大豆Glyma.04G253500抗病基因的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及大豆Glyma. 04G253500抗病基因及其编 码的蛋白质MEKK1与合成方法。
【背景技术】
[0002] 大豆原产于中国，在我国已有5000多年的栽培历史。然而自1996年至2010年 间，大豆进口量从110万吨骤然飙升至5480万吨，已严重影响到我国的粮食安全。大豆在 高温、高湿的环境中，易遭受多种病原物如病毒、真菌及线虫等的侵染。在我国，危害大豆生 产的主要病原物有大豆花叶病毒、亚洲锈病、霜霉病及大豆孢囊线虫病。这些高发的大豆真 菌病，病毒病致使我国每年的大豆产量减产高达10-30%。以大豆花叶病毒病为例，全国各 地均有发生，侵染区的发生在70-95%以上。植株被病毒侵染后重病年损失10-20%，个别 年份或少数地区产量损失可高达50%。病株不但减产而且降低种子质量（如萌发率、蛋白 质含量及含油量的降低），从而影响种子商品价值。因此，提高大豆品种的抗病能力是目前 大豆育种工作急需解决的关键问题之一。
[0003] MAPK通路的基本组成是一种从酵母到人类都保守的三级激酶模式，包括MAPK激 酶激酶（MAPkinasekinasekinase，MKKK)、MAPK激酶（MAPkinasekinase，MKK)和MAPK， 这三种激酶能依次激活，共同调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多 种重要的细胞生理/病理过程。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种大豆Glyma. 04G253500抗病基因的用途。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种大豆Glyma. 04G253500抗病基因的用 途，用于提高大豆的抗病性能；所述大豆Glyma. 04G253500抗病基因cDNA核苷酸的序列如 SEQIDN0 :1 所述。
[0006] 作为本发明的大豆Glyma. 04G253500抗病基因的用途的改进：所述抗病包括抗大 ?花叶病毒（SMV)、抗大?霜霉囷。
[0007] 在本发明中，提供了大豆Glyma. 04G253500抗病基因及其编码的蛋白质ΜΕΚΚ1与 合成方法。
[0008] 大豆Glyma. 04G253500抗病基因的cDNA核苷酸的序列如SEQIDN0 :1所述。
[0009] 大豆Glyma. 04G253500抗病基因编码的蛋白质MEKK1的氨基酸序列如SEQIDN0 : 2所述。
[0010] 大豆Glyma. 04G253500抗病基因的合成方法为：提取基因沉默型大豆的 RNA，将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，以下述序列为引物，通过RT-PCR获得 Glyma. 04G253500的基因序列，所述引物的序列为：
[0011] Glyma. 04G253500-F:5' -CCCGAATTCATGCATTACCTATCTCGGATTTT-3' ；
[0012] Glyma. 04G253500-R:5' -CCCGGATCCTTAACCCTTACGGCCGTGA-3'。
[0013] 本发明还提供了一种MEKK1沉默植株。
[0014] 本发明利用基因沉默及基因诱导技术，沉默大豆Glyma. 04G253500基因，验证其 增强大豆抗病的能力；并转入诱导型启动子，增强大豆抗病能力，改良抗病性状。
[0015] 本发明的有?效果：大?Glyma. 04G253500抗病基因提尚了大?抗病性能；大? Glyma. 04G253500抗病基因的合成方法简单，合成效率高，可以实现工业化生产。
【附图说明】
[0016] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0017] 图1为Glyma. 04G253500抗病基因全长cDNA序列的扩增结果。
[0018] 图2为沉默GmMEKKl导致大豆植株局部和系统的超敏性细胞的死亡。
[0019]图2中：
[0020]A为未沉默GmMEKKl的对照组；
[0021]B为沉默GmMEKKl的实验组；B中的箭头代表沉默GmMEKKl产生的超敏性细胞坏死 斑点；
[0022] C为未沉默GmMEKKl的对照组；
[0023] D为沉默GmMEKKl的实验组；
[0024]E为放大的沉默GmMEKKl的实验组；E中的箭头代表超敏性细胞坏死斑点；
[0025] F为放大的未沉默GmMEKKl的对照组；
[0026]G为台盼蓝染色的沉默GmMEKKl的实验组植株的系统叶片；G中的箭头代表超敏性 细胞坏死斑点；
[0027]Η为台盼蓝染色的未沉默GmMEKKl的实验组植株的系统叶片；
[0028] 图3为沉默型大豆植株的MEKK1在转录水平上降低，PR基因诱导沉默植物MEKK1 的表达。
[0029] 图4为沉默GmMEKKls的大豆植株提高了对大豆花叶病毒（SMV)的抗性。
[0030]图 4 中，
[0031]A为BPMV-OandGmMEKKlGUS染色结果；
[0032] 备注说明：下图为上图的局部放大示意图，箭头所指为GUS染色斑点；
[0033]B为BPMV-OandGmMEKKl⑶S染色斑点直径统计。
[0034] 图5为沉默GmMEKKls的大豆植物提高了对霜霉病的抗性。
[0035]图 5 中：
[0036]A为在BPMV-0植株叶片上检测出大豆霜霉病斑（图A左）。在GmMEKKl植株叶片 上未检测出大显霜霉病斑（图A右）；
[0037]B为在BPMV-0植株叶肉细胞中观测到大豆霜霉病菌丝；
[0038]C为在GmMEKKl植株叶肉细胞中未观测到大豆霜霉病菌丝；
[0039]D为在GmMEKKl植株上附着胞和萌发管无法穿透叶表皮细胞；1、2、3代表附着胞， GT分别代表萌发管。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合图1至图5对本发明的优选实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和 特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界 定。
[0041]实施例1.、Glyma. 04G253500抗病基因序列合成
[0042]1、总RNA的提取，采用Trizol法提取总RNA :
[0043] (1)取大豆幼苗植株叶片，并将植株叶片剪碎，去掉叶柄和较粗的叶脉，放入到 液氮中预冷的研钵内，向研钵内加液氮并研磨至粉末，将粉末转移至液氮中冷却处理过的 1. 5ml的离心管内。
[0044] (2)向1. 5ml的离心管中加1mlTRIZ0L，并使离心管漩涡震荡，每震荡一会儿对离 心管进行开盖放气处理，防止离心管内的气压变大而使液体迸溅，从而制备得到研磨液。
[0045] (3)将制备得到的研磨液装入新的离心管内，将装好研磨液的离心管放在离心机 上进行离心处理，该离心机的温度为4°C，转速为12000rpm，离心时间为lOmin。
[0046] (4)吸取离心处理后的离心管的上清液到一个新的离心管中，并将装有上清液的 离心管室温放置5min。
[0047] (5)向装有上清液的离心管内加0.2ml氯仿，并对离心管盖紧盖子，强力震荡15秒 后，室温放置2-3min。
[0048] (6)将上述离心管进行离心处理；离心温度为4°C，转速为12000rpm，离心时间为 15min〇
[0049](7)离心后，离心管有液相和有机相，中间分层，将离心管倾斜45°，用100μ1枪 头向离心管内轻轻吸出最上面液相装入到新管中；不要吸到中间层和有机层。
[0050](8)加0. 5ml异丙醇于新管中，室温放置lOmin，离心温度为4°C，转速为 12000rpm，离心时间lOmin。
[0051](9)去除新管内的上清液，留沉淀于新管内。
[0052] (10)再向新管内加1ml75%乙醇，将新管震荡，再将新管进行离心处理，离心温 度为4°C，转速为7500rpm，离心时间为5min。
[0053] (11)再去除上清液，室温放置2-3min。
[0054] (12)用 20-30μ1Rnase-free water重悬，取 1μ1 测浓度。
[0055] (13)提取出总RNA。
[0056] 2、cRNA的合成
[0057] 具体步骤：
[0058] (l)RNA的变性
[0059] 把RNA放在65°C温度下热变性5min后，立即放于冰上冷却。
[0060](2)反应液配制
[0061]
[0062]补水至10 μ1。
[0063] (3)逆转录反应
[0064] 37°C条件下进行15min的逆转录，然后在98°C条件下进行5min的酶失活反应，最 后在4°C下保存。
[0065] 3、以cRNA为模板合成目的片段
[0066] 具体步骤：
[0067] (1)高保真PCR50μ1 体系
[0070] 最后加灭菌ddH20至50μ1。
[0071] (2)高保真PCR反应体系
[0072] 将上述体系混匀，放入PCR仪中，进行反应。
[0073]① 95°C，3min。
[0074]② 98°C，10s
[0075]③ 55°C-60°C, 15s
[0076]④ 72°C，lmin/kb ;
[0077]⑤ 72°C，10min〇
[0078] ⑥4 °C，永久保存。
[0079] 注意：②，③，④反应循环35次左右。
[0080] (3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。结果如图1所示。图左表示目的片段大小为 1701bp，图右表示 2000bp的DNAMaker。
[0081] 所得大豆Glyma. 04G253500抗病基因cDNA核苷酸的序列如SEQIDNO:1所述。该 大豆Glyma. 04G253500抗病基因编码的蛋白质MEKK1的氨基酸序列如SEQIDN0 :2所述。
[0082]实施例 2、BPMV-Glyma. 04G253500 载体的构建：
[0083]1、载体BPMV-RNA1 的酶切
[0084]
[0085] 将离心管放置于37°C下酶切3小时，纯化，S卩，为在PCR、酶切、酶标、或测序反应液 中，加3个体积的BufferPCR-A(若BufferPCR-A不足100μ1，加至100μ1);混匀后，转 移到DNA制备管中，将DNA制备管置于2ml离心管中，12,000Xg离心lmin，弃滤液。将制 备管置回2ml离心管，加0. 7mlBufferW2,12, 000Xg离心lmin，弃滤液。将制备管置于洁 净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加20μ1ddH20,室温静置lmin。12,000Xg离 心lmin洗脱DNA。
[0086] 2、基因片段Glyma. 04G253500 的酶切
[0089] 将离心管放置于37°C下酶切3小时，纯化（纯化条件同上），加20μ1ddH20。
[0090] 3、载体和基因片段的连接
[0091]
[0092] 4、热激转化、鉴定
[0093] 将20 μ 1重组质粒DNA制剂（步骤3所得）与200 μ 1的感受态DH5 α悬液温和 混合，置转化管于冰浴30min，再经42°C水浴90s，然后移置冰水中2min。转化管内加入 800μ1 LB培养基后，置37°C的摇床45min。从转化管内提取100ul转化细胞，均匀涂布于 LB平板（含相应质粒抗性的抗生素，具体是浓度为50mg/ml的氨苄青霉素抗生素），将LB 平板放于37°C过夜培养；生长的菌落基本确定为转化成功的菌株；之后进行质粒的提取鉴 定，从而获得质粒BPMV-RNAl-Glyma. 04G253500。
[0094] 备注说明：质粒的提取鉴定按照常规的试剂盒离心提取法进行。具体方法可如 下：
[0095] ①取步骤4中