专利名称：大豆GmCOL4基因在植物花期调控中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一个大豆开花基因在植物花期调控中的应用。
背景技术：
大豆是重要的农作物之一，是植物蛋白质、食用油、生物柴油以及异黄酮和卵磷脂等次生代谢产物的重要来源。因为大豆是短日植物，开花受光周期的严格控制，因而不同区域间的优异品种不能相互引种、生育期也受环境光周期的制约(aiang等.，2008)。如果能降低大豆对光周期的敏感性，突破大豆开花对光周期的限制，就能解决大豆的引种问题，从而实现各区域间优质品种的相互交换，丰富各地优异种质资源，调节大豆生育期，提高大豆产量和品质。以往解决大豆光周期敏感性主要是通过杂交的方法获得新品种，但是，这种育种方法具有对亲本的依赖性强和周期长等缺点，到目前为止尚未获得大豆光周期广适应性品种。对拟南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受极其复杂的调节网络控制的 (Mouradov等，2002 ；Turck等，2008)。但是，其中一个关键蛋白对开花时间的调节起着至关重要的作用，它就是CONSTANS(CO)基因。Putterill等最早报道了拟南芥中的CO基因 (Putterill等，19%)。通过大量的研究发现CO介于生物节律钟与下游开花基因之间，将光信号转变为开花信号(Suarez等，2001)。随着基因组学和生物信息学的兴起和发展， 不同物种中的CO不断被认知，如水稻(Oryza sativa) (Yano等，2000)、小麦(Tritivum aestivum) (Nemoto 等，2003)禾口衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (Serrano 等，2009)的 CO基因。在已研究的植物中，CO常以多个拷贝的形式存在于生物体中，各CO拷贝的功能有明显差异。拟南芥的CO家族有17个成员(Robson等，2001)，水稻中有16个成员(Griffiths 等，2003)，甘蓝型油菜(Brassica napus)中也克隆得到4个CO同源基因(Robert等， 1998)，在温带裸子植物欧洲云杉(Picea abies)中鉴定到2个CO同源基因(Holefors等， 2009)。但大豆CO基因的功能及其应用方面未见报道。通过调节大豆开花基因表达来改变植物对光周期的敏感性和开花时间也没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆GmC0L4基因植物花期调控中的应用，通过在植物中过表达或抑制表达GmC0L4，实现调节植物光周期和开花时间。本发明的通过RT-PCR的方法从大豆‘垦农18，中分离到GmC0L4(全称为Glycine max CONSTANSLike 4)的cDNA全长，它与拟南芥CO蛋白的氨基酸序列之间的同源性为对％，在保守功能域(两个B-box和一个CCT domain)具有多个关键氨基酸的不同。因此推测与拟南芥CO基因促进开花的功能不同，GmC0L4可能具有抑制开花的功能。通过Real-time PCR分析了大豆GmC0L4基因的表达模式，结果表明主要在大豆子叶、茎、叶、花、荚中均有表达，其中在开花期的叶中表达量最高，因此推测所述基因与开花
3相关。本发明将GmC0L4基因构建到表达载体p35S-GW上，并在大肠杆菌DH5a中扩繁。 通过农杆菌介导转化方法，将P35S-GW携带的GmC0L4基因转入拟南芥，获得拟南芥转化植株。结果表明，GmC0L4具有降低植物对光周期的敏感性并抑制拟南芥开花的作用。本发明的通过克隆大豆GmC0L4基因，并在在植物中过表达GmC0L4基因，延长植物生育期，抑制植物开花。因此，GmC0L4基因及其编码的蛋白可以调节花期，可用于解决杂交育种中的花期不遇的问题，各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的问题以及光周期敏感性问题和引种问题。
图1为克隆载体pGWCm的结构示意图。图2为大豆开花基因GmC0L4编码蛋白的氨基酸序列与CO基因编码蛋白的氨基酸序列的比较。图3A为大豆开花基因GmC0L4在大豆中不同组织器官的表达水平。图;3B为大豆开花基因GmC0L4在大豆中不同发育时期的表达水平。图4为大豆开花基因GmC0L4在转基因植物细胞核中的定位；图5为植物表达载体p35S-GW的结构示意图。图6为大豆开花基因GmC0L4拟南芥转化植株表现。其中，在图3中，短线前面的字母表示植株的发育时期，短线后面的字母表示器官，U代表单叶；T代表复叶(T后面的数字为复叶的顺序)；F代表花；Pd代表荚；Pt代表叶柄(其后数字表示不同时期的荚)；R代表根；HH代表上胚轴；EH代表下胚轴；SAM代表生长点Jt代表茎；L代表侧生叶；C代表子叶Jeedling表示播种一周后的幼苗。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1大豆开花基因GmC0L4的克隆分别利用正向引物5 ‘ -ATGGGTTATATATGTGATTTTTGTG-3 ‘ 和反向引物 5' TCAGCAGCTTCTGGTTGTGC 3'从大豆‘垦农 18，(G1 ycine max L. Kennong 18，)叶片 cDNA中，扩增CO同源基因。PCR 反应程序为95°C 5min 预变性，95°C 30S,50°C !35S，72°C 2min，25 个循环， 72°C IOmin 延伸。将扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图1所示的pGWCm载体上。 先将pGWCm载体用Ahd I内切酶水解后用凝胶回收试剂盒回收酶切产物以获得T载体。然后PCR产物和T载体于16 °C进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a，并在其中扩增，筛选阳性克隆并测序。实施例2大豆开花基因GmC0L4编码蛋白的氨基酸序列分析大豆开花基因的GmC0L4蛋白序列与拟南芥之间的同源性较低仅为对％，且在保守功能域(两个B-box和一个CCT domain)多个关键氨基酸的不同，如图2所示。因此推测GmC0L4与拟南芥CO的功能可能不同，可能具有抑制植物开花的活性。
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实施例3大豆开花基因GmC0L4在大豆中不同组织器官及不同发育时期的表达水平利用实时定量荧光PCR(quantitative real time RT-PCR)测定大豆开花基因 GmC0L4在大豆中的表达。实时荧光定量PCR采用ABI M^One进行，用STOR Green I检测荧光信号。上游引物5' -ACCCTTTGAGCACAACCAGA-3‘，下游引物5' -GTTTTTCTTTTGCTAC
TATAGGACTG-3'。反应体系为SYBR Primix Ex Taq (2 X) (TaKaRa)7. 5 μ 1上游引物(10μ Μ)0. 3μ 1下游引物(10μ Μ)0· 3 μ 1ROX Reference Dye (50x)0. 3 μ 1cDNA1. 0μ 1灭菌双蒸水5. 6μ1反应参数为两步法95°C 10S，热启动；95°C 5S，60°C lmin，40个循环。用基因芯片数据分析软件Genesis对基因的表达进行标准化并作图。大豆开花基因GmC0L4主要在大豆子叶、茎、叶、花、荚中均有表达，其中在开花期的叶中表达量最高，如图3所示。实施例4大豆开花基因GmC0L4编码蛋白在植物细胞中的定位采用基因枪轰击的方法，将大豆开花基因GmC0L4与YFP的融合基因，转化至大豆叶片中。具体方法如下1)微粒子弹的制备将10 μ g重组质粒DNA与6 μ 1 50mg/ml的金粉悬液(直径为1. 0 μ m)、4 μ 1 0. lmol/L亚精胺(抽滤灭菌)和6 μ 1 2. 5mol/LCaCl2,涡旋振荡混勻，冰上静置15min，12，OOOrpm离心10s，收集金粉沉淀，用20 μ 1无水乙醇重悬。2)轰击受体材料将大豆幼嫩叶片摆放在MS培养基上，22°C预培养4h。选用 IlOOpsi的压力膜，将20 μ 1金粉-DNA混合物点在轰击膜中央，采用PDS 1000/He型基因枪(Bio-Rad)进行轰击，轰击距离6cm，真空度为25 . Hg。轰击后的表皮细胞22°C暗培养 24h后，在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP2)下观察。转化细胞中的YFP荧光信号表示大豆开花基因GmC0L4编码蛋白的定位，如图4所示。图4显示大豆开花基因GmC0L4编码的蛋白在大豆叶片中主要定位于核。实施例5大豆开花基因GmC0L4的植物表达载体将从实施例1中得到的大豆开花基因GmC0L4的克隆载体与如图5所示的植物表达载体p35S-GW(购自Invitrogen)等比例混合后通过LR反应(两种质粒各50ng，LR酶 1 μ 1，补H2O至终体积5 μ 1，混勻后25°C反应6小时以上)，将GmC0L4构建在p35S_GW上， 命名为P35S-GW-C0L4，用于在植物中过表达大豆开花基因GmC0L4，研究其功能。植物的转化方法采用农杆菌介导法进行。植物中的筛选标记为Bar。实施例6GmC0L4的转基因拟南芥的获得1.农杆菌液准备将含有目的基因双元表达载体的根瘤农杆菌GV3101: :p35S-GW-C0L4接种于5ml 含有相应抗性的液体LB培养基中，28 0C 200rmp培养，转化前Id接种于200ml含有相应抗生素的液体LB培养基扩大培养至0D600为0. 8 1. 2，5，OOOrmp离心15min收集菌体，菌体
5重悬于侵染缓冲液(含1/2MS大量，V2MS微量，5%蔗糖和0.02% Silweet L_77，pH5. 7)， 使0D600为0. 8左右。2.拟南芥转化拟南芥在长日照条件下培养，待主茎抽苔后剪掉，待大多侧枝现蕾时即可进行转化。将花序放进盛有侵染缓冲液的容器中，浸泡10 30s，转化完毕后，用黑色塑料袋罩住避光、保湿，16 24h后揭去塑料袋。常规管理至种子成熟。3. Basta抗性筛选转基因植株种子收获后于37°C烘干(1周左右)，然后均勻播在土中，罩上保鲜膜防止污染并保湿，播种7 IOd后待子叶完全张开时喷洒1 1000稀释的Basta，筛选阳性植株。分别利用正向引物 5 ‘ -GTTATGGGTCAACGGTTTC-3 ‘和反向引物 5 ‘ -TCAGCAGCTTCTGGTTGTGC-3 ‘ 鉴定获得的抗性植株，确保为GmC0L4转基因植株。通过PCR鉴定获得C0L4过表达转基因 T1代植株共3株。实施例7大豆开花基因GmC0L4抑制拟南芥开花从实施例6获得的拟南芥转化植株与野生型Col对照在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80 μ mol ·πΓ2 · s—1)下同时培育，给予同样的栽培管理措施，对30株GmC0L4的转基因拟南芥进行花期观测。结果表明，大豆开花基因 GmC0L4转化拟南芥，抑制拟南芥开花，对光周期不敏感，如图6所示，其中右侧代表对照野生型Col，左侧代表转基因植株。30株GmC0L4的T1代过表达转基因植株从播种到开花为 35 45天，平均为41. 4，而其对照20株Col野生型的开花时间为25 30天左右，平均为 32. 5天。结果表明大豆GmC0L4蛋白具有抑制开花的活性。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列说明SEQ ID No 1所示为大豆GmC0L4核苷酸序列；SEQ ID No2所示为大豆GmC0L4氨基酸序列；SEQ ID No 3和SEQ ID No 4为扩增GmC0L4全长的引物对；SEQ ID No 5禾口 SEQ ID No6 为 GmC0L4 Real-time PCR 引物对；SEQ ID No7 和 SEQ ID No 8 为检测转化植株的 PCR引物对。
权利要求
1.大豆GmC0L4基因植物花期调控中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过在植物中过表达或抑制表达GmC0L4， 实现调节植物光周期和开花时间。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在植物中过表达GmC0L4，使开花延迟，生育期延长。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一个大豆开花基因GmCOL4在植物花期调控中的应用。过表达GmCOL4可明显抑制植物(拟南芥)开花，使开花时间延迟，生育期延长。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题和引种问题。
文档编号C12N15/29GK102399788SQ20101027614
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者傅永福, 张晓玫 申请人:中国农业科学院作物科学研究所