专利名称：燃料乙醇生产中回收再利用纤维素酶全组份的方法
技术领域：
本发明涉及一种燃料乙醇生产中回收再利用纤维素酶全组份的方法，即在木质纤 维素同步糖化发酵工艺中，根据各种纤维素酶的不同性质，耦合新鲜底物重吸附和酶固定 化两种工艺回收再利用纤维素酶全组分的方法，属于工业生物技术领域。
背景技术：
当前，资源紧缺、环境恶化和能源匮乏是人类社会可持续发展的三大瓶颈问题。如 何高效、绿色、低成本地开发利用可再生能源已成为经济社会协调可持续发展的中心议题。 利用酶催化转化和酵母发酵等生物技术生产纤维素乙醇，是最有潜力的可再生能源生产路 线之一，已引起各国政府和科技界的普遍关注并予以广泛研究。纤维素酶因其具有活力低、耗量大和成本高等特点，直接阻碍了纤维素乙醇的商 业化进程。通过菌种改造、酶定向进化、改进酶的稳定性和耐受性等手段，纤维素酶的生产 成本和单位酶活均有所改善，但仍无法满足燃料乙醇生产的经济性要求。为降低纤维素酶 成本，开发纤维素酶有效回收工艺成为解决这一障碍的重要途径。纤维素酶为多组分酶体系，通常由作用方式不同而能相互协同催化水解纤维素 的三类酶组成外切β-1，4-葡聚糖酶(CBH)、内切β-1，4-葡聚糖酶(EG)和纤维二糖酶 (CB)。三类酶催化特性各异，为纤维素的全组份回收带来以下问题①CBH与EG的催化底物 为纤维素固体颗粒，采用固定化方法会造成固定化酶与固体底物间存在很大的传质障碍， 降低酶解效率；②CB催化底物主要为可溶性纤维二糖或寡糖，很难吸附于纤维素固体底物 上，无法用底物吸附法将其回收；③酶解产物葡萄糖和纤维二糖对纤维素酶有产物抑制作 用，造成酶催化和吸附能力降低。目前，纤维素酶全组份回收利用技术主要为超滤膜回收， 但设备要求高，操作复杂，且膜污染问题严重，很难应用于工业化生产。
发明内容
本发明目的在于提供一种燃料乙醇生产中回收再利用纤维素酶全组份的方法，可 以克服现有技术的缺陷，针对酶回收过程存在的问题，利用纤维素酶CBH、EG对纤维素的吸 附、脱附行为和纤维二糖酶的底物纤维二糖为小分子可溶性物质，本发明提出在同步糖化 发酵(Simultaneous Saccharide Fermentation, SSF)工段后采用新鲜底物重吸附和纤维 二糖酶固定化耦合工艺，将酶回收工艺置于同步糖化发酵工段后，实现全酶组分的回收再 利用。该回收利用方法工艺简单，设备简单、操作方便，大大降低了纤维素酶使用成本，在纤 维素乙醇生产领域具有非常重要的应用前景。本发明提供的一种燃料乙醇生产中回收再利用纤维素酶全组份的方法包括以下 步骤在木质纤维素同步糖化发酵工段后，利用新鲜底物重吸附和纤维二糖酶固定化耦 合工艺，实现纤维素酶全组份的回收再利用，本发明方法工艺流程图如图1所示。具体为1)制备固定化纤维二糖酶颗粒，置于反应器中，酶加入量为10_30CBU/g纤维素；
2)预处理后木质纤维素加入反应器中，加入培养液(pH4. 5-5. 5柠檬酸钠缓冲液、 (NH4)2HPCV MgSO4. 7H20、酵母膏、抗生素)至固体浓度为8-25%。在50°C下，每克纤维素底 物添加纤维素酶10-50FPU，预酶解12-24小时。降温至30_37°C，添加酵母转入同步糖化发 酵(SSF)阶段。反应结束后，分别利用2-5目、50-200目筛网，过滤固液分离得到固定化酶 颗粒、发酵溶液和发酵残渣。固定化酶颗粒直接用于下一轮同步糖化发酵工艺。3)滤液中加入与(2)相同质量新鲜木质纤维素底物，室温下重吸附90min后再次 固液分离，固相加入新鲜培养液(保持原固液比)，与固定化酶共同进入新一批次同步糖化 发酵工艺，液相进入精馏工段。所述的木质纤维素原料为适当粉碎后玉米芯、甘蔗渣、玉米秸秆、麦秆和稻草，粒 径为10-100目。纤维素酶全组份为外切β-1，4-葡聚糖酶、内切β-1，4-葡聚糖酶和纤维二糖酶。 利用固定化回收利用纤维二糖酶，用新鲜底物重吸附法主要回收外切β_1，4-葡聚糖酶和 内切β-1，4-葡聚糖酶。所述的纤维素酶回收工艺置于同步糖化发酵工段后，乙醇精馏工段前。步骤(1)所述的纤维二糖酶的固定化，其固定化方法包括无机载体吸附、离子交 换树脂结合、共价结合、高分子包埋、金属螯合和仿生矿化固定化方法；所述的置于反应器中可以置于筛网、膜管后固定于反应器中，也可直接放于反应 器中。步骤(2)所述的利用筛网过滤回收固定化酶，是滤后固定化颗粒可以直接用于新 一批次同步糖化发酵过程。步骤(3)所述的新鲜底物放入滤液中是在室温或4°C下静置或缓慢震荡90分钟至 2小时；浆料固液分离方法为压滤、真空过滤和离心过滤。本发明提供的一种燃料乙醇生产中回收再利用纤维素酶全组份的方法，有效的解 决了纤维素酶三大组分的回收再利用；方法应用于发酵过程，扩大了酶回收的应用范围，可 直接得到乙醇产品；操作简单，设备要求低，仅增加固液分离工段，从而降低了纤维素酶使 用成本，在燃料乙醇工业化生产中具有良好的应用前景。
图1为固定化纤维二糖酶和新鲜底物重吸附耦合回收工艺流程图。图2固定化纤维二糖酶连续使用酶活保留曲线。图3为酶回收再利用效果图。
具体实施例方式实施例1(1)纤维二糖酶(Novozym 188)固定化配制质量分数3. 5%的海藻酸钠、酶液(Novozym 188，酶活900CBU/mL)和CaCO3 粉末(加入量与海藻酸钠一样)的混浊液，酶液添加量为每克海藻酸钠100CBU。配制 0. 25wt. %壳聚糖、2wt. %氯化钙、5v. %冰醋酸的粘稠液。用注射器吸取混浊液，逐滴滴入 粘稠液中，连续搅拌固化30分钟后将颗粒取出，用pH4. 8柠檬酸缓冲液清洗表面，并用吸水纸吸干颗粒表面水分，即得固定化纤维二糖酶，固定化颗粒贮存于4°C下待用。纤维二糖酶 活测定以15mM纤维二糖为底物，50°C水解30分钟，沸水灭酶5分钟，利用高效液相色谱测 定生成葡萄糖量，计算纤维二糖酶活。以每分钟产生2 μ mol葡萄糖定义为1CBU。固定化酶 酶活为2.8CBU/g载体(湿重)。以纤维二糖为底物，酶解24h为一周期，酶解后过滤固液分 离，固定化酶进入下一轮水解。实验得循环一次后固定化酶酶活保留95%以上，连续使用四 个批次仍可保持固定化纤维二糖酶活为初始酶活的83% (图2)；(2)酶循环利用两批次同步糖化发酵过程称取15g硫酸-氨水两步预处理后的玉米芯底物置于摇瓶中，加入培养液(pH 5. 0，50mM 柠檬酸钠缓冲液((NH4)2HPO4 0. 5g/L, MgSO4. 7H20 0. 025g/L，酵母膏 1. Og/L,四环 素40mg/L) lOOmL，使初始固液比为15%。置于50°C空气摇床中预热，摇床转速150rpm/min， 10分钟后加入固定化纤维二糖酶和纤维素酶(Spezyme CP，酶活171FPU/mL)，剂量分别为 每克纤维素底物20CBU和30FPU，进行预酶解。24小时后添加酵母(S. cerevisiae) 2g/L，在 37°C同步糖化发酵，摇床转速降为lOOrpm/min，反应96小时结束。回收阶段固定化酶用10 目筛网捞出；发酵溶液中加入15g新鲜底物于室温下静置90min后过滤，滤饼加入新鲜培养 液，与固定化酶一同进入下一批次SSF反应。以纤维素转化率、乙醇浓度和乙醇得率为考察指标，评价纤维素酶回收及利用效 率。如图2所示，SSF第一批次所得纤维素转化率、乙醇浓度和乙醇得率分别为82.0%、 42. 2g/L和72. 1%，第二批次分别为66. 1%,34. 3g/L和73. 1 %，酶活回收率和产醇再用率 均高于80%。实施例2(1)纤维二糖酶(Novozym 188)固定化利用交联法制备固定化纤维二糖酶。具体方法如下配制质量分数3. 5%的海藻 酸钠、酶液(Novozym 188，酶活900FPU/mL)溶液，酶液添加量为每克海藻酸钠100U。在混 浊液中加入2. 5% (ν/ν)戊二醛搅拌30min后，用注射器吸取，并逐滴滴入2wt. %氯化钙 溶液中。置于4°C冰箱中固化2小时，过滤。用pH4. 8柠檬酸缓冲液清洗颗粒表面，后用吸 水纸吸干颗粒表面水分，即得固定化纤维二糖酶，贮存于4°C下待用。纤维二糖酶活测定以 15mM纤维二糖为底物，50°C水解30分钟，沸水灭酶5分钟，利用高效液相色谱测定生成葡萄 糖量，计算纤维二糖酶活。以每分钟产生2 μ mol葡萄糖定义为1CBU。经测定，固定化酶活 2. lU/g(湿重)。以纤维二糖为底物，循环一次后固定化酶酶活保留90%以上，连续使用三 个批次仍可保持固定化纤维二糖酶活为初始酶活的80% ；(2)酶循环利用两批次同步糖化发酵称取15g甲酸-氨水浸泡预处理后的玉米芯底物，加入培养液(pH 5.0，50mM柠 檬酸钠缓冲液，(NH4)2HPO4 0. 5g/L, MgSO4. 7H20 0. 025g/L，酵母膏 1. 0g/L，青霉素 40mg/ L) lOOmL，使初始固液比为15%。置于50°C空气摇床中预热，摇床转速150rpm/min，10分钟 后加入固定化纤维二糖酶和纤维素酶(GC220，酶活160FPU/mL)，剂量分别为每克纤维素底 物20CBU和45FPU，进行预酶解。12小时后添加酵母3g/L，在37°C下进行SSF，反应96小 时结束。回收阶段固定化酶用10目筛网捞出，发酵溶液中加入15g新鲜底物于室温下静置 90min后过滤，滤饼加入新鲜培养液，与固定化酶一同进入下一批次SSF反应。以纤维素转化率、乙醇浓度和乙醇得率为考察指标，评价纤维素酶回收及利用效率。利用高效液相色谱检测并计算得SSF第一批次所得纤维素转化率、乙醇浓度和乙醇得 率分别为90. 8%、40. 2g/L和71. 1%，第二批次分别为78. 1%A0. 3g/L和70. 2%，酶活回 收率和产醇再用率均高于80%。结果表明，利用耦合回收方法可有效的实现酶回收，并能保 持高效酶解作用。利用该方法循环使用两次即可使酶用量降低一倍，实现酶使用成本的大 幅度降低。
权利要求
一种燃料乙醇生产中回收再利用纤维素酶全组份的方法，其特征在于包括以下步骤在木质纤维素同步糖化发酵工段后，利用新鲜底物重吸附和纤维二糖酶固定化耦合工艺，实现纤维素酶全组份的回收再利用，具体工艺步骤为1)制备固定化纤维二糖酶颗粒，置于反应器中，酶加入量为10 30CBU/g纤维素；2)预处理后木质纤维素加入反应器中，加入培养液至固体浓度为8 25％，在50℃下，每克纤维素底物添加纤维素酶10 50FPU，预酶解12 24小时；降温至30 37℃，添加酵母转入同步糖化发酵(SSF)阶段；反应结束后，分别利用2 5目与50 200目筛网，过滤固液分离得到固定化酶颗粒、发酵溶液和发酵残渣；固定化酶颗粒直接用于下一轮同步糖化发酵工艺3)滤液中加入与步骤(2)相同质量新鲜木质纤维素底物，室温下重吸附90min后再次固液分离，固相加入新鲜培养液，保持原固液比，与固定化酶共同进入新一批次同步糖化发酵工艺，液相进入精馏工段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的木质纤维素原料为粉碎后的玉米芯、 甘蔗渣、玉米秸秆、麦秆或稻草，粒径为10-100目。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于纤维素酶全组份为外切β-1，4-葡聚糖酶、内 切β-1，4-葡聚糖酶和纤维二糖酶，利用固定化回收利用纤维二糖酶，用新鲜底物重吸附 法主要回收外切β-1，4-葡聚糖酶和内切β-1，4-葡聚糖酶。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的纤维素酶回收工艺置于同步糖化发酵 工段后，乙醇精馏工段前。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的纤维二糖酶的固定化，其固定 化方法包括无机载体吸附、离子交换树脂结合、共价结合、高分子包埋、金属螯合或仿生矿 化固定化方法。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的置于反应器中是置于筛网、膜管后固 定于反应器中，或直接放于反应器中。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的利用筛网过滤回收固定化酶， 是滤后固定化颗粒直接用于新一批次同步糖化发酵过程。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的新鲜底物放入滤液中是在室 温或4°C下静置或缓慢震荡90分钟至2小时。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的浆料固液分离方法为压滤、真空过滤 和离心过滤。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的培养液为pH4.5-5. 5的柠檬酸钠缓 冲液，(NH4)2HPO4 0. 5g/L，MgSO4. 7H20 0. 025g/L，酵母膏 1. Og/L，抗生素 40mg/L。
全文摘要
本发明涉及一种燃料乙醇生产中回收再利用纤维素酶全组份的方法。在木质纤维素同步糖化发酵工段后利用耦合新鲜底物重吸附和固定化纤维二糖酶工艺回收再利用纤维素酶全组分的方法，属于生物液体燃料领域。步骤是1)制备纤维二糖酶固定化小球置于反应器中；2)同步糖化发酵工艺结束后，固液分离，筛出固定化酶颗粒，重复利用；3)滤液中加入新鲜木质纤维素底物，一段时间后再次固液分离，固体加入新鲜培养液，与固定化酶一同用于新一批次同步糖化发酵工艺。该回收利用方法可实现纤维素酶全组份回收，且工艺简单，设备要求低，适于大规模操作，具有广阔的工业化前景。
文档编号C12R1/865GK101974570SQ20101027591
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者何志敏, 张名佳, 苏荣欣, 齐崴 申请人:天津大学