专利名称：IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能作为酶标记抗体用于免疫测定的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶 融合蛋白，属于生物工程领域。
背景技术：
碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase, AP)和辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是酶免疫测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)中较为常 用的免疫标记用酶。在ELISA中应用，AP系统的敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也 较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得 率较HRP低等原因，因此国内在ELISA中一般均采用HRP。碱性磷酸酶在免疫测定中作为标记用酶，是通过催化相应底物显色实现的。常用 标记用酶的AP有两个来源，分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取，牛小肠碱性磷酸酶比活高 达2000U/mg蛋白，大肠杆菌碱性磷酸酶比活40-60U/mg蛋白。大肠杆菌为原核生物而不能 对蛋白质进行糖基化。序列分析表明AP活性中心Aspl01-Serl02-Ala103序列高度保守。 糖基化可能是影响其活性的重要因素，但并未得到证实。目前，免疫酶标试剂制备方式是采用双功能试剂(如戊二醛，过碘酸盐等)将抗体 与酶偶联，按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游 离酶不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已 被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶 标抗体量，故制备的结合物应予以纯化。因此，传统的抗体与酶的标记方式需要交联、纯化 等多步蛋白质操作；而且偶联后往往存在蛋白质活性降低，抗体_酶结合物不均一，因而降 低了检测的灵敏度。利用基因工程技术生产免疫测定标记用酶，可改变从生物体分离提纯的生产方 式，也是得到符合标记要求高纯度酶的一条新途径。而将标记酶直接与抗体融合表达的方 式制备，可克服化学交联剂偶联方法的弊端。理论上尽管将碱性磷酸酶与抗体融合表达，但目前研究主要集中在单链抗体 (ScFv)与AP融合蛋白的构建，但是每检测一种抗原就要制备相应的融合抗体，在不能或不 便构建抗体-酶融合蛋白时则融合标记受阻。因此，寻找一种可结合多种一抗的二抗并与 酶以融合表达方式来制备免疫酶标试剂具有重要意义。IgG抗体亲和肽是来自葡萄球菌蛋白A (staphylococcal protein A, SpA)的ZZ结 构域。SpA为金黄色葡萄球菌细胞壁的单链多肽，分子量为42kD，能通过疏水作用结合人、 兔等多种动物IgG的Fc段，且这种结合不影响IgG的Fab段与抗原特异性结合的免疫活性， 根据SpA这一特性，SpA不仅用于免疫球蛋白和单克隆抗体的纯化，还被多种标记物(HRP， AP，FITC，胶体金等)偶联标记用于免疫测定；因SpA与IgG结合不受种属限制，被称为“广 泛二抗”。
针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种无需再次标记即可用于酶免疫测 定的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白(IgG affibody-Alkaline Phosphatase fusion protein，简写 IgG Ab-AP)。本发明是通过以下技术方案实现的一种IgG抗体亲和肽_碱性磷酸酶融合蛋白，是IgG抗体亲和肽和碱性磷酸 酶构成的融合蛋白，其一经产生即具有与IgG抗体的结合活性和AP催化活性，且二者 标记比例为1 1;该融合蛋白的酶比活力为386 士 82U/mg;与兔IgG抗体的亲和常数 Ka ^ 6. 7 X IO7L · moF10本发明的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白的制备方法，步骤如下(1)将IgG抗体亲和肽基因和碱性磷酸酶基因连接，然后构建重组载体；(2)电转化巴斯德毕赤酵母，选取重组载体整合到酵母基因组上的菌株；(3)经G418抗性压力筛选高拷贝表达菌株；(4)培养菌株，诱导表达IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白；(5)提取纯化IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白。具体如下(1)构建重组载体首先在分泌型碱性磷酸酶基因上游和下游提供限制性内切酶 切割位点Sac I及Pst I，然后通过PCR扩增不带N-信号肽及C-末端扩展肽的碱性磷酸酶 基因，将其插入到IgG抗体亲和肽下游；然后在IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶基因上游和下 游提供限制性内切酶切割位点Not I，通过PCR扩增并插入pPIC9K的Not I位点，构建毕赤 酵母表达载体PlgG Ab-AP/9k ；(2)电转化，并选取整合成功的菌株①挑取巴斯德毕赤酵母单菌落，接种于5mLYPD培养基中，30°C，250rpm培养过夜， 得过夜培养物；②取100 50(^1^的过夜培养物接种至5001111^ 0培养基中，301，250印111培养至 OD6tltl 达到 1.3-1. 5，得菌液；③将菌液于4°C，3000rpm离心5min，然后用500mL冰预冷的无菌水重悬菌体；④按步骤③离心，用250mL冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；⑤按步骤③离心，用20mL冰预冷的IM的山梨醇将菌体沉淀重悬；⑥按步骤③离心，用ImL冰预冷的IM的山梨醇重悬菌体；将细胞置于冰上；⑦将1 μ g经Sal I线性化的pAb_AP/9k载体DNA加入到80 μ L细胞中，将混合物 移至预冷的电转杯中；⑧电转参数电压1500V，电容25 μ F，电阻200 Ω ；Gene Pulser Xcell电转进行毕 赤酵母的电转化，将目的基因导入到毕赤酵母中；⑨通过组氨酸缺陷型突变的互补筛选转化子将电转化后的细胞立即涂布到缺少 组氨酸的MD琼脂平板上，在30°C孵育48-72h ；⑩挑取MD平板的酵母单菌落，通过菌落PCR直接检查载体是否与基因组整合，选 取载体与基因组整合的菌落进行下一步操作；(3)筛选高拷贝表达菌株将上述⑩验证正确的单菌落，用枪尖点种于含有不同
5G418浓度(1. Omg/mL-4. Omg/mL)的YPD平板上，30°C培养2_5天，出现G418抗性克隆；(4)诱导表达将通过G418压力筛选的高拷贝单菌落(G418浓度4. Omg/mL平板生 长的菌落)，接种于BMGY培养基中，30°C，280rpm培养至OD600达到2 6 ；3000g离心5min 收集细胞，弃去上清，用BMMY培养基重悬细胞，转入BMMY培养基中，30°C，280rpm诱导蛋白 表达；每24h补加一次甲醇至甲醇浓度为0. 5%，120小时结束诱导；(5)提取纯化①取诱导后的发酵液，4°C，lOOOOrpm，离心IOmin ；②收集上清，并用0. 22 μ m滤膜过滤，使用Millipore超滤器，4°C，4000rpm，离心 30min浓缩，得浓缩发酵液；③将IOmL Ni-NTA倒入2. 5 X IOcm柱中，用3个柱床体积的缓冲液A在4°C进行柱
平衡；④将浓缩发酵液上样，用6个柱床体积的缓冲液B清洗；⑤用6个柱床体积的缓冲液C洗脱目的蛋白；⑥使用Millipore超滤器，4°C，4000rpm，离心30min浓缩，将浓缩液以0. OlMTBS 稀释，得稀释液；⑦将稀释液加入IgG-S印harose-4B 柱，流速 0. 2ml/min，以 0. OlMTBS 洗至 OD280nm < 0. 02为止，然后换用0. lmol/L pH2. 3甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，流速0. 2ml/min,收集洗 脱液；⑧使用Millipore超滤器，4 °C，4000rpm，离心30min浓缩，即得IgG抗体亲和
肽-碱性磷酸酶融合蛋白。所述缓冲液A为50mM Tris，pH 8. 0的溶液，其中，含有IOmM咪唑及0. 3M氯化钠。所述缓冲液B为50mM Tris，pH 8. 0的溶液，其中，含有20mM咪唑及0. 3M氯化钠。所述缓冲液C为50mM Tris, pH 8. 0的溶液，其中，含有250mM咪唑及0. 3M氯化钠。经上述制备方法得到的IgG亲和肽_碱性磷酸酶融合蛋白具有高度均一性，无需 体外标记即可用于酶免疫测定；在Dot-ELISA检测兔IgG抗体中，与常规标记的山羊抗兔 IgG-AP检测效果相当。本发明的IgG亲和肽_碱性磷酸酶融合蛋白是利用毕赤酵母表达的，为糖基化产 物，其碱性磷酸酶活性高于从大肠杆菌提取的天然碱性磷酸酶。本发明是利用基因工程技术直接将抗体或抗原与酶以融合的方式表达，不但避免 了繁琐且低效率的酶与蛋白质的化学交联，而且无需得到纯化的酶和抗体或抗原。本发明将碱性磷酸酶基因与IgG亲和肽重组构建IgG亲和肽_碱性磷酸酶融合蛋 白，并利用巴斯德毕赤酵母分泌表达，该融合蛋白一经产生即具有与IgG抗体的结合活性 和AP催化活性，无需再次标记即可用于酶免疫测定；同时，IgG亲和肽仅与IgG的Fc段结 合，提高了与IgG亲和特异性，且无需每检测一种抗原而制备相应的融合抗体。由背景技术可知，SpA被称为“广泛二抗”，但尽管SPA已作为一种“广泛二抗”或 “替代二抗”在免疫测定中应用，但SpA的IgG结合活性来自E、D、A、B、C 5个高度同源的 IgG结合结构域。研究发现，其IgG结合结构域不仅与IgG的Fc段结合，也与某些IgG的 Fab段(如人IgGl的F (ab' )2)结合。为克服其弊端，以ZZ亲和肽结构域代替SpA的5个同源IgG结合结构域，使IgG结合结构域的分子量减小到14kD，也克服了 SpA与某些IgG的 Fab段结合的缺点。因此本发明采用仅与IgG Fc段结合的ZZ结构域-IgG抗体亲和肽，避 免对IgG的Fab段与抗原特异性结合的影响。本发明的IgG亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白，具有IgG亲和肽和碱性磷酸酶的生 物学活性，无需体外标记即可用于酶免疫测定，且其活性较常规大肠杆菌提取的碱性磷酸 酶更高，本发明具有活性高、使用方便、效果好等优点。
图1为含有融合蛋白基因的表达载体plgG Ab-AP/9k的质粒图；图2为IgG Ab-AP融合蛋白-山羊抗兔IgG-HRP百分结合率抑制标准曲线；图3为IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白、山羊抗兔IgG-AP检测兔IgG抗体 的对比示意图。本发明中涉及的培养基的配方如下YPD 1 % east Extract ；2% Peptone ；2% Dextrose ；2% Agar ；MD 1. 34% YNB ；4X10_5% Biotin ；2% Dextrose ；1. 5% Agar ；BMGY 1 % Yeast Extract ；2% Peptone ；IOOmM potassium phosphate buffer, ρΗ6· 0 ；1. 34% YNB ；4X10-5% Biotin ；1% glycerol ；BMMY 1 % Yeast Extract ；2% Peptone ；IOOmM potassium phosphate buffer, ρΗ6· 0 ；1. 34% YNB ；4Χ10_5% Biotin ；0. 5% methanol。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明。实施例1 IgG抗体亲和肽_碱性磷酸酶融合蛋白基因表达载体的构建为将碱性磷酸酶基因与IgG亲和肽基因连接，首先在分泌型碱性磷酸酶基因 (secreted alkaline phos-phatase，SEAP，GenBank Accession No :U35316)上游禾口下游提 供限制性内切酶切割位点Sac I及Pst I，通过PCR扩增不带N-信号肽及C-末端扩展肽的 碱性磷酸酶基因(1467bp)，插入IgG亲和肽下游(pEZZ18的Sac I及Pst I位点)；第二步 在IgG亲和肽-AP基因上游和下游提供限制性内切酶切割位点Not I，通过PCR扩增并插入 PPIC9K的Not I位点，构建毕赤酵母表达载体plgG Ab_AP/9k，如图1所示。实施例2电转化巴斯德毕赤酵母GS115为在巴斯德毕赤酵母GS115中转化pAb_AP/9k并随后整合进基因组中，载体首先 用Sal I线性化，使用Gene Pulser Xcell电转仪电转化进行1)挑取酵母单菌落，接种于5mLYPD培养基中，30°C，250rpm培养过夜；2)取100-500 μ L的过夜培养物接种至500mLYPD培养基中，30°C，250rpm培养至 OD600 达到 1. 3-1. 5 ；3)将菌液于4°C，3000rpm离心5min，用500mL冰预冷的无菌水重悬菌体；4)按步骤3离心，用250mL冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；5)按步骤3离心，用20mL冰预冷的IM的山梨醇将菌体沉淀重悬；6)按步骤3离心，用ImL冰预冷的IM的山梨醇重悬菌体；将细胞置于冰上；
7)约1 μ g经Sal I线性化的pAb_AP/9k载体DNA加入80 μ L细胞，将混合物移至 预冷的电转杯中；8)按照Gene Pulser Xcell电转仪操作要求，进行毕赤酵母的电转化，将目的基因 导入到毕赤酵母中；9)通过组氨酸缺陷型突变的互补筛选转化子。将细胞立即涂布到缺少组氨酸的 MD琼脂平板上，在30°C孵育48-72h ；10)挑取MD平板的酵母单菌落，通过菌落PCR直接检查载体是否与基因组整合。实施例3高拷贝菌株的筛选及目的蛋白的表达为了获得高拷贝的基因工程菌，使用选择压力进行筛选。将验证正确的单菌落，用 枪尖点种于含有不同G418浓度的YPD平板上。点种时，按照G418浓度由低到高顺序点种 平板，30°C培养。将通过G418(4. Omg/mL)压力筛选的高拷贝单菌落，接种于25mL BMGY中，30°C， 280rpm培养至OD6tltl达到2_6。3000g离心5min收集细胞。弃去上清，用BMMY培养基重悬 细胞，转入50mL BMMY中，30°C，280rpm诱导蛋白表达；.每24h取样lmL，并补加一次甲醇 至甲醇浓度0. 5%，120小时结束诱导。实施例4IgG抗体亲和肽_碱性磷酸酶融合蛋白的纯化1)取诱导一定时间的发酵液，4°C，lOOOOrpm，离心lOmin。2)收集上清，并用0. 22 μ m滤膜过滤，使用Millipore超滤器(截留分子量为 IOkDa)，4°C，4000rpm，离心 30min 浓缩。3)将IOmL Ni-NTA倒入2. 5X IOcm柱中，用3个柱床体积的缓冲液A(50mM Tris, pH 8. 0 ；0. 3M氯化钠；IOmM咪唑)在4°C进行柱平衡。4)将浓缩发酵液上样，用6个柱床体积的缓冲液(50mM Tris，pH 8. 0 ；20mM咪唑； 0. 3M氯化钠)清洗。5)用6个柱床体积的缓冲液(50mM Tris, pH 8. 0 ；250mM咪唑；0. 3M氯化钠)洗
脱目的蛋白。6)使用Millipore超滤器(截留分子量为IOkD)，4°C，4000rpm，离心30min浓缩， 将浓缩液以适当0. 01MTBS稀释。7)将步骤6溶液加入IgG-S印harose-4B柱，流速0. 2ml/min,以0. 01MTBS洗至 0D280nm < 0. 02为止，换用0. lmol/L ρΗ2· 3甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，流速0. 2ml/min,收
集洗脱液。8)使用MiIlipore超滤器(截留分子量为IOkDa)，4°C，4000rpm，离心30min浓缩， 12% SDS-PAGE检测纯化效果。实施例5 IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白活性鉴定IgG抗体亲和肽_碱性磷酸酶融合蛋白是一双功能蛋白质，具有碱性磷酸酶的催 化活性及与IgG抗体结合的活性。碱性磷酸酶活性检测原理
IgG Ab-AP
4-硝基苯磷酸酯^- 4-硝基苯酚+Pi
8
360 μ LpNPP 溶液(50mM 的 Tris-HCl 中含 2mM 乙酸镁，pNPP 浓度 0. 25 10mM， ρΗΙΟ. 0)，加入IgG Ab-AP溶液40 μ L (BCA法定量，武汉博士德生物公司)，37°C反应IOmin, 3. 6mLIMNaOH终止反应，测定405nm的吸光度值。酶活力单位在上述条件下，每分钟催化产生1 μ mol/L pNP所需的酶量定义为1 个活性单位(U)。Img酶所含有酶的单位数称为比活力。根据下式计算计算活力单位U = MXA-1XeXb其中，M = IgG Ab-AP融合蛋白质量；A = 405nm吸光度；ε = 18700[LXmol—1 Xcm—1] ；b = Icm经测定，IgG Ab-AP融合蛋白的碱性磷酸酶比活力为 386士82U/mg蛋白，比活力高于市售大肠杆菌提取天然碱性磷酸酶。与兔IgG抗体亲和活性测定1)兔IgG抗体用包被稀释液稀释后(lOOng/mL)包被酶标板，每孔100 μ L，4°C温 育过夜，TBST(含 0. 5% Tween-20 的 0. OlM TBS 溶液，ρΗ8· 0) X5minX3 次；2)每孔加入封闭液200μ L，于37°C封闭lh, TBSTX5minX3次；3将纯化的IgG Ab-AP融合蛋白以适当梯度稀释后，与山羊抗兔 IgG-HRP(l 5000)按体积比1 1混勻；每孔加入上述混合液100 μ L，于37°C反应结合 lh, TBSTX5minX3 次；4)每孔加入TMB底物液100 μ L，37°C避光显色，当对照孔出现明显颜色反应时，每 孔加入终止液50 μ L，于20min内测定450/630nm ；5)以未包被兔IgG抗体的孔为空白值，以只加山羊抗兔IgG-HRP孔的A45(1/62(1值为Btl 值，加入不同浓度的IgG Ab-AP融合蛋白与山羊抗兔IgG-HRP混合液的A45(1/62(1值为B值。以 IgG Ab-AP融合蛋白的浓度负对数(-LogC)为横坐标，以山羊抗兔IgG-HRP百分结合率(B/ B0%)为纵坐标，绘制抑制标准曲线，如图2所示。当山羊抗兔IgG-HRP百分结合率为50%时 所对应的IgG Ab-AP融合蛋白浓度倒数，即为IgG Ab-AP融合蛋白与兔IgG抗体的亲和常数。经测定，IgG Ab-AP融合蛋白与兔IgG抗体的亲和常数Ka ^ 6. 7X IO7L · πιοΓ1。实施例6IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白在Dot-ELISA应用1)取NC膜用铅笔作好加样方格(5mmX 5mm)并作好相应标记；2)将膜浸入0. 01mol/L pH7. 4的TBS中15 30min，取出用滤纸吸干；3)将要包被的抗体(兔IgG抗体)包被稀释液稀释至工作浓度；4)加样0.5μ L于相应格内，室温自然干燥后，将NC膜片放入封闭液中振荡封闭 30min ；5)将膜片放入洗涤液中振荡洗涤3次，每次30min ；6)用滤纸吸干，将膜片放入酶标记抗体溶液(山羊抗兔IgG-AP，1 2000)或IgG Ab-AP溶液中，室温振荡30min ；7)将膜片放入洗涤液中振荡洗涤4次，每次30min ；8)将膜片浸入BCIP/NBT碱性磷酸酶显色溶液中，在振荡条件下充分显色，用流水 冲洗数分钟，放入蒸馏水中终止反应。如图3所示，IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白与山羊抗兔IgG-AP检测效果 相当。
权利要求
IgG抗体亲和肽 碱性磷酸酶融合蛋白，其特征在于是IgG抗体亲和肽和碱性磷酸酶构成的融合蛋白。
2.权利要求1所述的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白的制备方法，其特征在于， 步骤如下(1)将IgG抗体亲和肽基因和碱性磷酸酶基因连接，然后构建重组载体；(2)电转化巴斯德毕赤酵母，选取重组载体整合到酵母基因组上的菌株；(3)经G418抗性压力筛选高拷贝表达菌株；(4)培养菌株，诱导表达IgG抗体亲和肽_碱性磷酸酶融合蛋白；(5)提取纯化IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤如下，具体步骤如下(1)构建重组载体首先在分泌型碱性磷酸酶基因上游和下游提供限制性内切酶切割 位点Sac I及Pst I，然后通过PCR扩增不带N-信号肽及C-末端扩展肽的碱性磷酸酶基 因，将其插入到IgG抗体亲和肽下游；然后在IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶基因上游和下游 提供限制性内切酶切割位点Not I，通过PCR扩增并插入pPIC9K的Not I位点，构建毕赤酵 母表达载体PlgG Ab-AP/9k ；(2)电转化，并选取整合成功的菌株①挑取巴斯德毕赤酵母单菌落，接种于5mLYPD培养基中，300C，250rpm培养过夜，得过 夜培养物；②取100 500μ L的过夜培养物接种至500mLYPD培养基中，30°C，250rpm培养至0D_ 达到1.3-1. 5，得菌液；③将菌液于4°C，3000rpm离心5min，然后用500mL冰预冷的无菌水重悬菌体；④按步骤③离心，用250mL冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；⑤按步骤③离心，用20mL冰预冷的IM的山梨醇将菌体沉淀重悬；⑥按步骤③离心，用ImL冰预冷的IM的山梨醇重悬菌体；将细胞置于冰上；⑦将1μ g经Sal I线性化的pAb_AP/9k载体DNA加入到80 μ L细胞中，将混合物移至 预冷的电转杯中；⑧电转参数电压1500V，电容25μ F，电阻200 Ω ；Gene Pulser Xcell电转进行毕赤酵 母的电转化，将目的基因导入到毕赤酵母中；⑨通过组氨酸缺陷型突变的互补筛选转化子将电转化后的细胞立即涂布到缺少组氨 酸的MD琼脂平板上，在30°C孵育48-72h ；⑩挑取MD平板的酵母单菌落，通过菌落PCR直接检查载体是否与基因组整合，选取载 体与基因组整合的菌落进行下一步操作；(3)筛选高拷贝表达菌株将上述⑩验证正确的单菌落，用枪尖点种于含有不同G418 浓度的YPD平板上，30°C培养2-5天，出现G418抗性克隆；(4)诱导表达将通过G418压力筛选的高拷贝单菌落，接种于BMGY培养基中，30°C， 280rpm培养至OD6tltl达到2 6 ；3000g离心5min收集细胞，弃去上清，用BMMY培养基重悬 细胞，转入BMMY培养基中，30°C，280rpm诱导蛋白表达；每24h补加一次甲醇至甲醇浓度为 0.5%，120小时结束诱导；(5)提取纯化①取诱导后的发酵液，4°C，lOOOOrpm，离心IOmin；②收集上清，并用0.22 μ m滤膜过滤，使用Mi 11 ipore超滤器，4°C，4000rpm,离心30min 浓缩，得浓缩发酵液；③将IOmLNi-NTA倒入2. 5X IOcm柱中，用3个柱床体积的缓冲液A在4°C进行柱平④将浓缩发酵液上样，用6个柱床体积的缓冲液B清洗；⑤用6个柱床体积的缓冲液C洗脱目的蛋白；⑥使用Mi11 ipore超滤器，4°C，4000rpm,离心30min浓缩，将浓缩液以0. 0IM TBS稀释， 得稀释液；⑦将稀释液加入IgG-S印harose-4B柱，流速0.2ml/min,以0. OlM TBS洗至OD28tlnm < 0. 02为止，然后换用0. lmol/L pH2. 3甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，流速0. 2ml/min,收集洗 脱液；⑧使用Millipore超滤器，4°C，4000rpm，离心30min浓缩。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述缓冲液A为50mMTris, pH 8.0 的溶液，其中，含有IOmM咪唑及0. 3M氯化钠。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述缓冲液B为50mMTris, pH 8. 0 的溶液，其中，含有20mM咪唑及0. 3M氯化钠。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述缓冲液C为50mMTris, pH 8. 0 的溶液，其中，含有250mM咪唑及0. 3M氯化钠。
7.权利要求1所述的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白作为酶标记抗体用于免疫 测定的应用。
全文摘要
本发明公开了一种IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白，是IgG抗体亲和肽和碱性磷酸酶构成的融合蛋白，能作为替代酶标记抗体用于免疫测定，其一经产生即具有与IgG抗体的结合活性和AP催化活性，且二者标记比例为1∶1；该融合蛋白的酶比活力为386±82U/mg；与兔IgG抗体的亲和常数Ka≌6.7×107L·mol-1。本发明的IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白的制备方法如下(1)将IgG抗体亲和肽基因和碱性磷酸酶基因连接，构建重组载体；(2)电转化巴斯德毕赤酵母；(3)经G418抗性压力筛选高拷贝表达菌株；(4)培养菌株，诱导表达；(5)提取纯化IgG抗体亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白。
文档编号C12N15/62GK101948545SQ201010275380
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月8日 优先权日2010年9月8日
发明者唐金宝, 杨洪鸣, 梁淑娟, 陈永 申请人:潍坊医学院