专利名称：一种与宫颈癌及其癌前病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与宫颈癌及其癌前病变相关的血清 /血浆miRNA标志物及其应用。
背景技术：
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，占全球女性恶性肿瘤的第二位，仅次于乳 腺癌。2002年全球共49万例宫颈癌新发病例，其中83%的病例发生在发展中国家，27万 人因宫颈癌而死亡。虽然我国城市宫颈癌的死亡率从上世纪60年代以后呈下降趋势，但是 宫颈癌的发病率和以及其在农村地区的死亡率一直持高不下。尤其进入到90年代后期，宫 颈癌的发病率呈明显年轻化的趋势，城市中年龄在35-44的妇女宫颈癌的发病率正以每年 4. 的速度增长。2005年的中国肿瘤登记统计数字表明，我国宫颈癌发病率为9. 1/10万， 死亡率为2. 4/10万。宫颈癌已成为威胁我国女性生命和健康的重要疾病之一，是亟待解决 的重大公共卫生问题。宫颈癌的发生是一个缓慢的过程，浸润性宫颈癌发生前通常有10-20年左右的癌 前病变阶段，这一浸润前阶段在WHO的分类标准中被称作宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)。根据非典型细胞占宫颈上皮全层的厚度，可将CIN进 一步分CIN可分为3期，即轻度上皮内瘤样病变(CIN I)，中度上皮内瘤样病变(CIN II)， 和重度上皮内瘤样病变(CIN III)，而原位癌归类于CIN III期。从CIN I期发展为浸润 癌约需8-15年左右的时间，大部分CINI是短暂的，大约有60%左右的CINI还可逆转为正 常，而中度和高度CIN进展为癌的可能性却很大，约有超过10%的cmiii会进展为浸润癌。 但如果能很好地把握癌前病变这段时间，早期做出准确的诊断，及时采取相应的措施，就可 以极大地提高宫颈癌的治愈率和生存率，甚至预防宫颈癌的发生。因此，有效准确的诊断手 段显得尤为重要。目前，宫颈癌的诊断方式主要有子宫颈刮片细胞学检查，阴道镜检查，宫颈活体组 织检查等。虽然这些方法在诊断早期和中晚期宫颈癌患者上有一定的价值，由于其特异度 和灵敏度不高，创伤性较大，又涉及社会文化伦理等方面问题(如年轻女性对于妇科检查 的误解、忽视或拒绝)，不但不能保证诊断对癌症患者诊断的准确性，对于处于轻度CIN阶 段的癌前患者，尤其是年轻患者的诊断能力更为有限。此外，对于中高度CIN患者，早期判 断哪些会进展为宫颈癌，哪些则会长期处于稳定状态，也可以避免过度治疗带来的创伤。因 此，我们亟需发现更加明确而有效的生物标志物，对宫颈癌及其癌前病变做出明确的辅助 早期诊断，这将有助于对处于癌前病变的患者及时采取相应的措施，使癌前病变逆转为正 常情况；同时可以帮助宫颈癌患者做出辅助早期诊断，有助于早期治疗，提高治愈率和生存 率。MicroRNAs (即miRNAs)是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点，它的成熟 状态是一类长约19-23个核苷酸的小单链RNA分子，进化上具有高度保守性。它由DNA转录产生，但不翻译成蛋白质，而是在蛋白质合成过程中调节其他基因的功能。miRNAs参与了 哺乳动物几乎所有的病理和生理活动，如个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等， 与许多疾病的发生、发展存在着紧密的联系。自从参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7 被发现以来，miRNA分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。 2005年预测miRNAs至少能调控5300个人类基因，即所有基因的30%。随着研究的深入， 越来越多的miRNAs不断被发现。近年来，miRNA与肿瘤的关系已经成为研究的热点和重点， 已经发现miRNA通过负调控基因的表达与肺癌，乳腺癌，胃癌，宫颈癌等的发病高度相关。研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、含 量丰富、易于定量检测，且存在疾病特异性。现有的成熟的技术，包括定性和定量miRNA分 子的技术，表明利用血清miRNAs作为分子生物标志物的方法比传统的特异蛋白分子标记 方法将更加有效，同时这也克服了分子标记在抗体制备和定量分析上发展所遇到的瓶颈。然而，目前还没有关于血清/血浆miRNAs用于宫颈癌辅助早期诊断等方面的报 道，若能筛选出宫颈癌及其癌前病变异常表达的血清/血浆miRNAs作为生物标志物，并研 制相应的疾病进展监测、辅助诊断试剂盒，对我国宫颈癌的诊断现状必将是一次有力的推 动。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与宫颈癌及其癌前病变辅助早 期诊断相关的血清/血浆miRNA标志物。本发明的第二个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物的引物。本发明的第三个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物及其引物在制备宫颈癌 及其癌前病变辅助早期诊断、动态监测的试剂盒中的应用。本发明第四个目的是提供用于宫颈癌及其癌前病变辅助早期诊断的试剂盒。发明人通过分离和研究宫颈癌患者及与其年龄匹配的健康女性对照血清/血浆 中的miRNAs，同时分离和研究年龄相匹配的CIN I/II/III期患者血清/血浆中的miRNAs， 寻找一组与宫颈癌及其癌前病变高度相关的高特异性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于 临床应用的宫颈癌及其癌前病变辅助早期诊断试剂盒，为宫颈癌及其癌前病变的筛查和诊 断提供数据支持，为宫颈癌前病变进展的动态监测和临床治疗效果评价提供数据支持。本发明的目的是通过下列技术方案实现的一种与宫颈癌及其癌前病变相关的血清/血浆miRNA标志物，该标志物为miR_21 单独或者miR-21与miR-29a组合。所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，这些引物为miR-21 的引物为 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 ；miR_29a 的引物为 SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12。所述的血清/血浆miRNA标志物在制备宫颈癌及其癌前病变辅助早期诊断试剂盒 中的应用。所述血清/血浆miRNA标志物的引物在制备宫颈癌及其癌前病变辅助早期诊断试 剂盒中的应用。一种宫颈癌及其癌前病变辅助早期诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆
4miRNA 中 miR-21 单独或者 miR-21 与 miR_29a 组合。所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有下列两种血清/血浆miRNA标志物组合的引物 miR-21 的引物为 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 ；miR_29a 的引物为 SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12。所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓 冲液，dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。具体地说，本发明解决问题的技术方案包括(1)建立统一标准的标本库和数据 库以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床 资料。(2)血清/血浆miRNA差异表达谱分析选择宫颈癌病例、与宫颈癌病例年龄匹配的 健康女性对照，检测其血清/血浆miRNA表达谱及含量，分析宫颈癌病例和健康女性对照 间血清/血浆miRNA的共性和特性，筛选差异表达miRNAs。(3)筛选疾病相关血清/血浆 miRNAs 对已筛选的血清/血浆差异表达miRNAs在CIN I/II/III期病例中进行定量分析， 确定宫颈癌前病变相关血清/血浆miRNAs，能够指示宫颈癌前病变发展的动态变化。(4) 血清/血浆miRNA筛查和诊断试剂盒的研制根据宫颈癌病例和健康女性对照、CIN 1/11/ III期病例相关血清/血浆miRNA开发miRNAs辅助诊断试剂盒，实现宫颈癌及其癌前病变 早期诊断并监测疾病动态发展的目的。本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口 学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，并控制疾病分期、患者年龄等因素对 于发病的影响)，并采用了 RT-PCR、Real-time PCR方法、Solexa测序技术等。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分1.研究样本的选择(1)经病理学明确诊断的宫颈癌病例；(2)采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗；(3)与病例年龄匹配的健康女性对照；(4)年龄匹配的经病理学明确诊断的CIN I期、II期、III期病例。本研究共采用105例符合标准的样本进行研究。2. Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取血清/血浆总RNA，按常规方法操 作。通常能得到 5yg RNA/50ml血清或血浆。3. Solexa 测序(1)总RNA进行PAGE电泳回收17_27nt RNA分子(2)将链接引物(adaptor prime，Solexa测序通用引物)酶联在小RNA分子的3' 与5'端(3)进行RT-PCR反应后进行测序(4)数据分析与处理4. Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法(1)取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；(2)设计引物；(3)进行 PCR 反应；(4)检测并比较宫颈癌病例与健康女性对照血清/血浆样本中miRNA的量的变化，
5检测并比较CIN I/II/III期病例血清/血浆样本中miRNA的量的变化。5.诊断试剂盒制备方法Solexa方法确定宫颈癌病例和健康女性对照中有拷贝差异的miRNA，通过 qRT-PCR技术筛选在宫颈癌病例和健康女性对照中表达量和差异程度大，并且在CINI/II/ III期病例中差异表达的趋势与疾病进展趋势一致的一组血清/血浆miRNA，作为宫颈癌及 其癌前病变辅助早期诊断的指标。最后筛选出的与宫颈癌及其癌前病变进展有关的血清/ 血浆miRNA组成辅助诊断试剂盒(miR-21单独和miR-21与miR-29a的组合)。诊断试剂盒 包括miR-21单独和miR-21与miR_29a的组合引物以及Taq酶、dNTP等试剂。6.统计分析方法运用χ2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人 口学特征、组织类型、CIN分期和miRNA平均表达水平在研究对象组间分布的差异。我们在30例宫颈癌病例和30例健康女性对照的研究中发现有2种miRNAs与宫颈 癌发病情况有显著关联。2种miRNAs的不同表达水平以表示，其中ACt = CTt^-CT ·，我们在每个检测版中加入六平行的一个共用的健康人对照标本作为参照，计算相对表 达量。在CIN Ι/ΙΙ/ΙΙΙ期各15例病人中对这2种miRNAs进一步被检测，进而观察miR-21 单独和miR-21与miR-29a的组合是否在宫颈癌的发生发展中起着重要的作用。统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(SAS，v. 9. 1. 3)。统计学显著性水 平P值设为0. 05，所有统计学检验均为双侧检验。以下是本发明进一步的说明在上述30例符合条件的宫颈癌病例及30例健康女性对照中，两组年龄按个体精 确匹配。我们将这两组人群经Solexa测序试验获得相关结果。根据So 1 exa测序方法，本发明人检测到在“宫颈癌病例，，组和“健康女性对 照”组的血清中存在差异表达的微小核糖核酸包括let-7a、let_7b、let_7c、let-7d、 let-7e> let-7f> let_7g、let_7i、miR—1、miR—100、miR—101、miR—103、miR_106b、miR—107、 miR-10a、miR-10b、miR-122、miR-1224_5p、miR-1226、miR-1227、miR-1228、miR-124、 miR-1246、miR-1249、miR-1254、miR-125a_5p、miR_125b、miR-126、miR-1268、miR-127_3p、 miR-1274b、miR-128、miR-1284、miR-1290、miR-1291、miR-129_3p、miR-1294、miR-1301、 miR-1303、miR-1304、miR-1306、miR-1307、miR-1308、miR_130a、miR_130b、miR_133a、 miR-133b、miR-134、miR-139_3p、miR-139_5p、miR-140_3p、miR-140_5p、miR-142_3p、 miR-142-5p, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-146b-3p, miR-146b-5p, miR-148a, miR-148b、miR-150、miR-151-3p、miR-151-5p、miR-152、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17、 miR-181a、miR-181b、miR-181d、miR-182、miR-185、miR-186、miR-1908、miR-191、miR-192、 miR-193a-5p>miR-193b>miR-194>miR-197>miR-199a-3p>miR-199b-3p>miR-19b>miR-204> miR-206> miR-21、miR-210、miR-214> miR-22> miR-221> miR-222> miR-223> miR-23a> miR-23b> miR-24> miR-25> miR-26a> miR-26b> miR-27a> miR-28-3p> miR-296-5p> miR-29a> miR-29b> miR-29c> miR-30a> miR-30b> miR-30d> miR-30e> miR-31、miR-32> miR-320a> miR-320b> miR-320c> miR-320d> miR-323-3p> miR-323-5p> miR-324-3p> miR-324-5p> miR-326、miR-328、miR-329、miR-330-3p、miR-331-3p、miR-339_3p、miR-339_5p、miR_33a、 miR-340> miR-342-3p> miR-342-5p> miR-34c-5p> miR-361-3p> miR-361-5p> miR-365>
6miR-375> miR-378> miR-382> miR-409-3p> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-424> miR-425> miR-432、miR-433、miR-451、miR-483_3p、miR-483_5p、miR-484、miR-485_3p、miR-485_5p、 miR-486-3p> miR-486-5p> miR-490-3p> miR-494> miR-499-5p> miR-532-3p> miR-543> miR-574-3p>miR-584>miR-589>miR-625>miR-629>miR-652>miR-671-3p>miR-7>miR-708> miR-720> miR-744> miR-760> miR-766> miR-874> miR-885-3p> miR-885-5p> miR-886-5p> miR-9、miR-923、miR-92a、miR-92b、miR-93、miR-935、miR-940、miR-941、miR-942、miR-98、 miR-99a。根据上述Solexa结果，选择满足下列条件的miRNAs用qRT_PCR方法进一步的验 证1)在两组的倍数差异达5倍的miRNA作为本发明中初步筛查的血清生物标志物；2)这 些miRNAs至少在一组研究对象(“宫颈癌病例”组或“健康女性对照”组)中的拷贝数大 于50以提高检测效率。满足上述条件的miRNAs 包括miR_l、miR-21、miR_23b、miR-28_3p、miR_29a、 miR-100、miR-122、miR-125b、miR-181a、miR-206、miR-483-5p。qRT-PCR 结果发现在 60 例 样本中，有2种miRNAs (miR-21，miR-29a)在“宫颈癌病例”组和“健康女性对照”组中的表
达情况存在显著性差异。多因素Logistic回归分析结果表明，这2种miRNAs的表达水平均与宫颈癌的发 病存在着显著关联2种miRNAs均在病例中高表达。根据上述结果，将这2种与宫颈癌发病相关的miRNAs在45例宫颈癌前病变病例 (15例CIN I期病例、15例CIN II期病例、15例CIN III期病例)中进行进一步检测。我 们发现miR-21和miR-29a的表达与CIN的进展相关联，具体地说，miR-21和miR_29a在CIN Ι/Π/ΙΙΙ期病例血清/血浆中的表达均呈现出CIN KCIN IKCIN III期的规律，其中 miR-21在几组中的差别大于miR-29a。进一步分析这2种miRNA的组合用于宫颈癌及其癌前病变辅助早期诊断的效果， 发现其组合对宫颈癌及其癌前病变早期诊断的AUCArea Under the ROC Curve，ROC曲线 (Receiver Operating Characteristic Curve，受试者工作特征曲线)下面积与 miR-21 单个相比增加。根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于宫颈癌前病变进展监测的试剂 盒，包含测定受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的成熟miR-21单独和miR-21与 miR-29a组合的引物和其他检测试剂。具体而言，miR-21单独和miR-21与miR_29a的组合，或者miR-21单独和miR-21 与miR-29a组合的引物构成的相关诊断试剂盒有助于宫颈癌前病变患者的动态监测，为临 床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提 供支持，从而最大限度避免过度治疗，以及预防宫颈癌的发生。本说明书中血清/血浆是指血清和血浆，或者是指血清或血浆。本发明的有益效果本发明提供的血清/血浆微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)标志物作为宫颈癌 及其癌前病变辅助早期诊断的标志物的优越性在于(1)血清/血浆miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳 定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于宫颈癌及其癌前病变的辅助早期诊断，为其他疾病生物标志 物的研制提供借鉴。(2)血清/血浆miRNAs试剂盒是一种系统、全面的辅助诊断和监测试剂盒，可用于 宫颈癌患者的诊断及癌前病变患者的疾病进展的动态监测，有助于反映宫颈癌患者的疾病 状态，了解宫颈癌前病变患者疾病进展情况，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取 更具个性化的防治方案提供支持。(3)采用严密的设计和评价体系，本发明人初期采用Solexa全基因组测序技术对 血清/血浆miRNAs进行直接测序以获取疾病特异和异常表达的血清/血浆miRNAs表达谱， 并应用qRT-PCR的方法在CINI/II/III期病例中进行了验证；以上方法和策略的应用加速 和保证了血清/血浆miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的 研制提供方法和策略上的借鉴。本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆miRNA在辅助宫 颈癌及其癌前病变辅助早期诊断的应用前景，阐述异常表达的miRNAs对于宫颈癌及癌前 病变进展的影响，揭示其筛查和诊断价值。因此，本发明获得了宫颈癌发病相关血清/血浆 miRNAs表达数据库和标志物；通过血清/血浆miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和 应用，可使得宫颈癌及其癌前病变的辅助早期诊断，以及宫颈癌前病变动态监测更加方便 易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜 在治疗价值的新型小分子药物提供帮助。
图1 显示miR-21、miR-29a在健康女性对照组、宫颈癌病例组、CIN I期、CINII 期、CIN III期病例组中的表达水平。显示miRNA的表达情况分布，横轴代表研究对象，纵轴代表miRNA的表达水平(以 2_Δ"表示)。宫颈癌病例组与健康女性对照组相比，miR-21、miR-29a的表达水平均显著升 高(miR-21 :P = 2. 07994E-09 ；miR_29a :P = 0. 000205)。CIN I/II/III 期病例组中 miRNA 的表达有逐步增加的趋势。图2 显示miR-21单独的ROC曲线。显示宫颈癌病例组、CIN I期、CIN II期、CIN III期病例组分别对健康女性对照 组为参照的ROC曲线。其中——区分宫颈癌病例组与对照组AUC 90. 00 %，灵敏度83. 33 %，特异度 96. 67% ；——区分CIN III期病例组与对照组AUC 88. 33 %，灵敏度80. 00 %，特异度 96. 67% ；---区分CIN II期病例组与对照组AUC 61. 67 %，灵敏度26. 67 %，特异度
96. 67% ；...........区分CIN I期病例组与对照组AUC 51. 67%，灵敏度:6. 67%，特异
度96. 67%。图3 显示miR-21与miR_29a组合的ROC曲线。显示宫颈癌病例组、CIN I期、CIN II期、CIN III期病例组分别对健康女性对照组为参照的ROC曲线。其中——区分宫颈癌病例组与对照组AUC 95. 83 %，灵敏度93. 33 %，特异度 96. 67% ；——区分CIN III期病例组与对照组AUC 89. 56 %，灵敏度80. 00 %，特异度 96. 67% ；---区分CIN II期病例组与对照组AUC 68. 56 %，灵敏度40. 00 %，特异度
96. 67% ；...........区分CIN I期病例组与对照组AUC 51. 67%，灵敏度:6. 67%，特异
度96. 67%。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1样品的收集和样品资料的整理发明人于2006月3月开始至今从南京医科大学第一附属医院、南通肿瘤医院及南 京江宁社区收集了大量的宫颈癌患者和对照的外周血样品，通过对样品资料的整理，发明 人从中选择了 105例符合下列标准的样本作为Solexa测序和后续一系列qRT-PCR验证的 实验样品1、新发宫颈癌病例；2、采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗；3、与病例年龄匹配的健康女性对照；4、年龄匹配的CIN I/II/III期病例。并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。实施例2血清/血浆中miRNA的Solexa测序实验在上述符合条件的30例宫颈癌患者和30例健康女性对照中，两组年龄匹配。将 这两组人群经Solexa测序试验获得相关结果。具体步骤为1、分别取“宫颈癌病例”组和“健康女性对照”组患者的血清50ml，加入等体积的 Trizol 试剂；2、相分离室温放置15min，然后按0. 2ml氯仿/lml Trizol试剂的体积比加入氯 仿，震荡 15s,室温 15min, 12，OOOg, 4°C，离心 15min ；3、将水相转移到新的50ml的离心管，3步苯酚/氯仿除去蛋白相；4,RNA沉淀将水相转移到新的离心管中，按0. 5ml异丙醇/lml Trizol试剂体积 加入异丙醇，_20°C保存 60min, 12，OOOg, 4°C，离心 60min ；5、用lml Trizol试剂重悬沉淀，将悬液转移到新的1. 5ml的离心管中；6、重复2，4步(第四步离心改为15min)；7、RNA洗涤去掉上清，加入75%乙醇，12，000g，4°C离心5min ；8、测量浓度通常能得到 5 μ g RNA/50ml血清；9、总RNA进行PAGE电泳回收17_27nt RNA分子；10、将链接引物(adaptor prime，Solexa测序通用引物)酶联在小RNA分子的3' 与5'端；
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11、进行RT-PCR反应后并进行测序；12、数据分析与处理在“宫颈癌病例”组和“健康女性对照”组中运用Solexa测 序方法发现的血清差异表达的微小核糖核酸在上文中已经罗列出。 实施例3血清/血浆中miRNA的qRT-PCR实验根据上述Solexa结果，选择满足下列条件的miRNA用qRT_PCR方法进一步的验 证1)在两组中倍数差异达5倍的miRNA作为本发明中初步筛查的血清生物标志物，2)这 些miRNA中至少在一组(“宫颈癌病例”组和“健康女性对照”组)中的拷贝数大于50以提 高检测效率。满足上述条件的 miRNAs 包括miR-l、miR-21、miR-23b、miR-28-3p、miR-29a、 miR-100、miR-122、miR-125b、miR-181a、miR-206、miR-483-5p。根据所选 miRNAs 设计逆转 录和qRT-PCR的引物(见表4)。对“宫颈癌病例”组和“健康女性对照”组的血清单个个体 进行miRNA的qRT-PCR检测。在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测三 次。所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。(1)制备cDNA样品a)取500 μ 1血清；b)加等体积的水饱和酚，振荡混勻，4°C， 13200rpm离心3分钟，取上清；c)上清+1/2体积(250 μ 1)苯酚+1/2体积(250 μ 1)氯 仿，振荡混勻，4°C，13200rpm离心3分钟，取上清；d)加与上清等体积的氯仿震荡混勻，4°C， 13200rpm离心3分钟，取上清作为RNA样品；e)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转 录的反应体系包括4 μ 1 5 X AMV缓冲液、2 μ 1 IOmM dNTP混合物(Takara公司)、0. 5 μ 1 RNase抑制剂(Takara公司)、2 μ 1 AMV (Takara公司)以及1.5μ1 miRNA特异性反向引物 一种或几种的混合物。反应步骤为16°C孵育15分钟，42°C反应1小时，85°C孵育5分钟；(2)q_PCR 将cDNA按1/5体积稀释，取1μ 1稀释后的cDNA，加入0. 3μ 1 Taq酶 (Takara 公司)，1 μ 1 20 X EVA GREEN, 0. 2 μ 1 10 μ M 正向引物一种，0. 2 μ 1 ΙΟμΜ 通用反 向引物(URP :TGGTGTCGTGGAGTCG, SEQ ID No. 23)，1· 2 μ 1 25mM MgCl2,1· 6 μ 1 2. 5mM dNTP 混合物(Takara公司)，2 μ 1 10XPCR缓冲液，13. 5 μ IH2O, 20 μ 1体系进行q_PCR。仪器 使用的是ABI Prism 7300荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是95°C、5分钟进行1个循环 —95°C、15秒，60°C、1分钟进行40个循环。两组样品血清miRNAs的表达量比值可用方程
表示，其中ACt = CTtMi-Ct ，我们在每个检测版中加入六平行的一个共用的健康人 对照标本作为参照，计算相对表达量。qRT-PCR结果发现在60例样本中，有2种miRNAs (miR-21, miR_29a)在两组间的 表达情况存在显著性差异(表1)。表1. miRNA-21 和 miRNA_29a qRT-PCR 结果
miR21miR29a均数样本量标准差均数样本量标准差对照1.3726301.36571.2772301.0715CINl1.5615151.52981.2799150.8413CIN22.8856152.90713.4974155.9539CIN35.22951510.37676.64351512.5525病例17.00943012.00268.3249309.6796 实施例4血清/血浆中miRNA在CIN病例中qRT-PCR实验进一步研究
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根据上述结果，将这2种与宫颈癌发病相关的miRNAs在CIN I/II/III期病人中 进行进一步检测。我们发现miR-21，miR-29a在CIN病例组血清中的表达均显著高于对照 组，并且宫颈癌前病变的患者血清中mR-21和miR-29a表达与CIN的进展呈现一致的趋势， 所属的CIN分期越高，其表达越高(表1和图1)。实施例5miR-21单独和miR-21与miR-29a的组合对宫颈癌发病的诊断及其ROC 曲线根据上述Real-time PCR结果，本发明人通过对5组血浆样品(“宫颈癌病例组”、 “健康女性对照组”、“CIN I期病例组”、“CIN II期病例组”、“CIN III期病例组”)的miRNAs 表达水平的分析，分别以健康女性对照组miR-21和miR-29a表达量的95百分位数为阈值， 对miR-21，miR-29a进行评分，表达量小于95百分位数评分为0分，表达量大于等于95百 分位数评分为1分，进一步求得总得分(见表2、表3)，以此绘制ROC曲线来评估预测的灵 敏性和特异性，进而评估miR-21单独和miR-21与miR-29a的组合高表达对宫颈癌早期发 病的判断能力。ROC分析结果显示，miR-21单独以90.0%的AUC(R0C曲线下面积)将健 康女性对照组和宫颈癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为83. 33%，特异度为96. 67% ； 以88. 33%的AUC将健康女性对照组和CIN III期病例组分开，最佳临界点的灵敏度为 80. 00%，特异度为96. 67% ；以61. 67%的AUC区分健康女性对照组和CIN II期病例组， 灵敏度为26. 67%，特异度为96. 67% ；以51. 67%的AUC区分健康女性对照组和CIN I期 病例组，灵敏度为6. 67%，特异度为96. 67% (图2)。miR-21与miR-29a的组合以95. 8% WAUC(RC)C曲线下面积)将健康女性对照组和宫颈癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为 93. 33%，特异度为96. 67%;以89. 6%的AUC将健康女性对照组和CIN III期病例组分开， 最佳临界点的灵敏度为80. 00%，特异度为96. 67% ；以68. 6%的AUC区分健康女性对照组 和CIN II期病例组，灵敏度为40. 00%，特异度为96. 67% ；以51. 7%的AUC区分健康女性 对照组和CIN I期病例组，灵敏度为6. 67%，特异度为96. 67% (图3)。因此，本发明人证明了采用miR-21单独和miR-21与miR-29a的组合能够很好地 将健康女性对照和宫颈癌患者区分，并且，这种区分性与CIN的严重程度呈现很好的一致 性。表2. miRNA-21表达水平得分 表 3. miRNA-21 和 miRNA_29a 的得分求和
实施例6用于辅助宫颈癌及其癌前病变早期判断的miRNA试剂盒的制作
miRNA试剂盒的制作和操作流程是基于solexa测序，RT-PCR和real-time PCR等技术。 试剂盒包括血清/血浆miRNA引物(miR-21的引物为SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4 ； miR-29a的引物为SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12)，还可以有相应PCR反应所需的常用酶 和/或试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgC12，DEPC水，荧光染料或探针、Taq酶、通用反 向引物(URP :TGGTGTCGTGGAGTCG，SEQ ID No. 23)等，可根据具体采用的实验方法选用，这些 常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的 正常人样本等)及正常参考值(miR-21 5. 0948，miR-29a 3. 8238)。此试剂盒的价值在于 只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测miRNA的变化 趋势，再通过该趋势辅助早期诊断宫颈癌及其癌前病变，不仅稳定，检测方便，且定量精确， 大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确 做出辅助早期诊断。
1权利要求
一种与宫颈癌及其癌前病变相关的血清/血浆miRNA标志物，其特征在于该标志物为miR 21单独或者miR 21与miR 29a的组合。
2.权利要求1所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，其特征在于该引物为 miR-21 的引物为 SEQ IDNo. 3 和 SEQ IDNo. 4 ；miR-29a 的引物为 SEQ IDNo. 11 和 SEQID No. 12。
3.权利要求1所述的血清/血浆miRNA标志物在制备宫颈癌及其癌前病变辅助早期诊 断试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的血清/血浆miRNA标志物的引物在制备宫颈癌及其癌前病变辅助 早期诊断试剂盒中的应用。
5.一种宫颈癌及其癌前病变辅助早期诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测血清 /血浆miRNA中miR-21单独或者miR-21与miR_29a的组合。
6.根据权利要求5所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有血清/血浆miRNA中 miR-21单独和miR-21与miR_29a组合的引物。
7.根据权利要求5所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的血 清/血浆miRNA标志物的引物。
8.根据权利要求6或7所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR反应常 用的酶和/或试剂。
全文摘要
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，公开了一种与宫颈癌及其癌前病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用。该标志物为miR-21单独或者miR-21与miR-29a的组合。该标志物及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于宫颈癌及其癌前病变的辅助早期诊断。
文档编号C12Q1/68GK101921759SQ20101027555
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月8日 优先权日2010年9月8日
发明者张辰宇, 李瑛 , 沈洪兵, 胡志斌, 董静 申请人:南京医科大学