连翘中抗肿瘤活性物质的提取方法及其产品和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种从连翘中提取抗肿瘤活性物质的方法及其产品和应用。本发明的一种从连翘中提取抗肿瘤活性物质的方法，按如下步骤进行：一、连翘水提液（FS-1）的制备；二、乙醇沉淀法初步分离抗肿瘤有效部位（FS-2）；三、大孔吸附树脂柱层析法分离连翘抗肿瘤有效部位（FS-3）；四、薄层层析法分离连翘中的抗肿瘤活性物质（FS-4）。此外，本发明通过实验证实了连翘抗肿瘤活性物质（FS-4）能够诱导人胃癌SGC-7901细胞的凋亡，同时更进一步的，本发明对连翘抗肿瘤活性物质（FS-4）中的具体成分进行了初步验证。由本发明的方法提取得到的连翘抗肿瘤活性物质（FS-4），具有明显的抗肿瘤活性作用，对于肿瘤疾病的治疗提供了一种新的技术手段。
【专利说明】连翘中抗肿瘤活性物质的提取方法及其产品和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种活性物质的提取方法及其产品和应用，特别涉及一种从连翘中提取抗肿瘤活性物质的方法及由该方法提取得到的产品和该产品在抗肿瘤方面的应用，本发明属于生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]连翘是中国临床常用传统中药之一，又名黄花条、连壳、青翘、落翘、黄奇丹等。《中华人民共和国药典》2005年版一部收载的连翅为木犀科(Oleaceae)连翅属(Forsythia)植物连翅(Forsythia suspensa (Thunb.)Vahl)的干燥果实,连翅有抗菌、强心、利尿、镇吐等药理作用，常用连翘治疗急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结结核、尿路感染等症。
[0003]目前，胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。尽管其发病率在发达国家已显著减少，但在全球癌症相关死亡率中排名第二。本次研究是在研究连翘提取物抗病毒作用的实验中意外的发现了连翘的抗肿瘤作用，由此，本发明对连翘抗肿瘤活性物质的提取方法进行了进一步的改进，提高了提取率，并且对该提取物进行了系统的抗肿瘤活性的测定，证明该提取物具有体外诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用。
【发明内容】
[0004]为了解决现有癌症尤其是胃癌临床治疗中存在的化疗药物副作用大，易耐药等问题，本发明以我国资源丰富，价格便宜，毒副作用低且易于普及的中草药连翘(即连翘的干燥果实)为研究对象，对其进行分离、提取，得到连翘抗肿瘤活性物质(FS-4)，并对其进行抗肿瘤活性的测定，进而提供了一种从连翘中分离提取具有抗肿瘤作用的连翘抗肿瘤活性物质的方法。
[0005]为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段:
[0006]一、连翘水提液(FS-1)的制备；
[0007]二、乙醇沉淀法初步分离抗肿瘤有效部位(FS-2)；
[0008]三、大孔吸附树脂柱层析法分离连翘抗肿瘤有效部位(FS-3)；
[0009]四、薄层层析法分离连翘中的抗肿瘤活性物质(FS-4)；
[0010]五、连翘抗肿瘤活性物质(FS-4)体外诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡作用的研究；
[0011]六、连翘抗肿瘤活性物质(FS-4)的初步验证。
[0012]具体的，本发明的一种提取连翘中抗肿瘤活性物质(FS-4)的方法按照如下步骤进行:
[0013](I)连翘水提液的制备
[0014]连翘经过筛除尘后，水洗浸泡过夜，次日文火煮沸，过滤，收集滤液，蒸发浓缩，制成水提液，灭菌，标记为FS-1，置4°C冰箱保存备用；
[0015](2)乙醇沉淀法初步分离抗肿瘤有效部位
[0016] 取连翘水提液FS-1置于塑料离心管中，然后向其中分次缓慢加入质量百分比浓度为90%-100%的乙醇溶液，并不断震荡，直至乙醇溶液的体积达到溶液总体积的90%-95%为止，将离心管置于4°C冰箱8-14h，低温离心，收集上清液，上清液经滤纸过滤，减压浓缩后，置于4°C冰箱备用，标记为FS-2 ；
[0017](3)大孔吸附树脂柱层析法分离连翘抗肿瘤有效部位
[0018]取FS-2，缓慢加入到预处理好的大孔吸附树脂柱顶端，加入量为2%柱体积，待FS-2渗入树脂层，依次用蒸馏水、质量百分比浓度为30%、60%、90%的乙醇溶液，以5.0Oml/min流速进行洗脱，收集洗脱部分，质量百分比浓度为90%的乙醇洗脱液经100°C条件下减压浓缩后，标记为FS-3 ；
[0019](4)薄层层析法分离连翘抗肿瘤活性物质
[0020]按照苯:正己烷:甲醇:冰乙酸的体积比=14-16:14-16:0.5-1.5:0.5-1.5配制展开剂，将FS-3于室温25°C下在薄层制备板上展开，展开时间50-60min，晾干；然后，通过碘熏法熏染薄层制备板，并在紫外灯照射下观察，即发现FS-3分为13个条带，收集从薄层制备板上数的第4个条带，标记为FS-4，即为抗肿瘤活性物质。[0021]在本发明中，优选的，步骤(1)按照以下步骤进行:连翘经过筛除尘后，用自来水清洗3-6遍，再用蒸馏水洗2-4遍，然后加蒸馏水使液面高出连翘8-15cm，浸泡过夜；次日文火于100°C煮沸，l_3h后趁热用脱脂棉过滤，药渣重复提取，再用脱脂棉过滤，将两次滤液混合，于10(TC蒸发浓缩至1.00mg/ml，制成水提液，经三日间歇平压灭菌法灭菌，每次40min,置4°C冰箱保存备用。
[0022]在本发明中，优选的，步骤(2)中所述的低温离心是指于4°C，4000r/min离心15min。
[0023]在本发明中，优选的，步骤(3)中所述的大孔吸附树脂柱为X-5型大孔吸附树脂柱。
[0024]在本发明中，优选的，步骤(4)中所述的展开剂按照苯:正己烷:甲醇:冰乙酸的体积比=15:15:1:1配制，展开时间为55min。
[0025]在本发明中，优选的，步骤(4)中所述第4个条带的收集方法包括以下步骤:
[0026](I)从薄层制备板上将上数第4个条带切割下来放入小烧杯中；
[0027](2)向烧杯中加入无水乙醇，搅拌，沉淀20_24h后收集上清液，用脂溶性的0.22 μ m滤膜过滤，得到过滤后的上清液，备用，重复步骤(2) 2-3次；
[0028](3)将收集的过滤后的上清液混合后，再离心，取上清液，减压浓缩后以脂溶性0.22 μ m的滤膜过滤，滤液经冷冻干燥制成粉末，标记为FS-4，即为抗肿瘤活性物质。
[0029]进一步的本发明还提出了按照以上任一所述的方法制备得到的抗肿瘤活性物质及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0030]在本发明中，优选的，所述的肿瘤为胃癌。
[0031]本发明提取出的连翘抗肿瘤活性物质(FS-4)，经一系列的抗肿瘤活性测定，证实其具有体外诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用。FS-4作用于SGC-7901细胞36h半数抑制浓度(IC5tl)仅为3.23 μ g/ml，优于临床常用药物顺钼的作用(IC5tl为4.21 μ g/ml)。根据《国家新药(西药)临床前研究指导原则汇编》规定，植物粗提物IC5tl ( 20μ g/ml，并且有细胞毒性的剂量依赖性关系，可判定样品在体外对细胞具有杀伤作用，由此可见连翘抗肿瘤活性物质(FS-4)是一种强的抗肿瘤活性物质。【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为Α0/ΕΒ双荧光染色法检测药物作用12h后SGC-7901细胞凋亡的形态学变化(X40)；
[0033]附注:A.对照组；B.50 μ g/ml FS-4 ；C.100 μ g/ml FS-4 ；
[0034]图2为正常细胞对照组和FS-4作用12h后透射电镜下SGC-7901细胞形态；
[0035]附注:透射电镜1:正常细胞X8000 ;2:实验组细胞X8000 ;3:正常细胞X 20000 ；4:实验组细胞X 20000 ；
[0036]图3为FCM检测FS-4作用12h SGC-7901细胞凋亡率结果；
[0037]附注:1:对照组；2:12.5 μ g/ml FS-4 作用组；3:25 μ g/ml FS-4 作用组；4:50 μ g/mlFS-4 作用组；5:100 μ g/ml FS-4 作用组；
[0038]图4为空白对照及FS-4质谱总离子流图。
[0039]图5为碘熏法熏染后的薄层制备板(左)及各条带的相应切割位置(右)。
[0040]箭头所示为上数的第4个条带(FS-4)，其中第2、3个条带用肉眼看不到，只有在紫外灯下才能看到。
【具体实施方式】
[0041]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明的技术方案和细节形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护的范围内。
[0042]实施例1:连翘水提液(FS-1)的制备
[0043]取连翘(购买自世一堂药店，黄翘，产地山西)500g经过筛除尘后，用自来水清洗5遍，用蒸馏水洗3遍，加蒸馏水使液面高出连翘IOcm左右，浸泡过夜。次日文火于100°C煮沸，2h后趁热用脱脂棉过滤，药渣重复提取，再用脱脂棉过滤，将两次滤液混合，于100°C蒸发浓缩至1.00mg/ml,经三 日间歇平压灭菌法灭菌,每次40min,制成水提液,标记为FS-1,置4°C冰箱保存备用。
[0044]实施例2:乙醇沉淀法初步分离抗肿瘤有效部位(FS-2)
[0045]取3.5ml连翘水提液FS_1置于塑料离心管中，然后向其中分段缓慢加入质量百分比浓度为100%的乙醇溶液，并不断震荡，直至乙醇溶液体积达到溶液总体积的90%为止。将离心管置4°C冰箱12h，于低温离心机4°C，4000r/min离心15min，收集上清液，上清液经滤纸过滤，减压浓缩，置于4°C冰箱，备用，标记为FS-2。
[0046]实施例3:大孔吸附树脂柱层析法分离连翘抗肿瘤有效部位(FS-3)
[0047]取FS-2，缓慢加入到预处理好的大孔吸附树脂(X-5型)柱顶端，加入量为2%柱体积，8mg/次，共6次。待FS-2渗入树脂层，依次用蒸馏水、质量百分比浓度为30%、60%、90%的乙醇溶液，以5.0Oml/min流速进行洗脱，收集洗脱部分，质量百分比浓度为90%的乙醇溶液洗脱液经100°C条件下减压浓缩后，即得FS-3。
[0048]实施例4:薄层层析法分离连翘抗肿瘤活性物质(FS-4)
[0049](I)薄层板的活化:将薄层板在烘箱中渐渐升温，维持105°C~110°C活化30min。活化后的制备薄层板放在干燥器内保存待用；
[0050](2)点样:先用铅笔在距薄层板一端Icm处轻轻划一横线作为起始线，然后用100微升的点样管吸取FS-3，在起始线上小心点样，使上样量达到2mg/板，点好样的制备薄层板用电吹风的热风吹干，备用；
[0051](3)展开:首先按苯:正己烷:甲醇:冰乙酸的体积比=15:15:1:1配置展开剂。在展开缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过lcm，将点好样的薄层板小心放入展开缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中，盖好盖。室温25°C，展开时间55min，晾干；
[0052](4)显色
[0053]碘蒸气进行显色:将展开后的薄层板挥发掉溶剂后置于一放置有少量固体颗粒碘的密闭玻璃容器中I~2min，然后从碘蒸气容器中取出薄层板，用针尖画出组分显现的条带;
[0054](5)收集:
[0055]将多块经上数步骤(1)- (4)得到的薄层板先在紫外灯下进行划线，颜色褪去后进4丁切割:
[0056]将薄层板上数第4个条带切割下来收集到小烧杯中，加入其体积5倍的无水乙醇溶液，搅拌，沉淀24h后收集上清，用脂溶性的0.22 μ m滤膜过滤上清液，以上步骤重复3次(具体操作:①用注射器从烧杯A中吸出上清液，然后用脂溶性的0.22滤膜过滤到烧杯B中；②再向烧杯A中加入5倍体积的无水乙醇溶剂重复上述步骤；③烧杯B中随时可以用鼓风干燥器蒸干。)；将上清液混合后，再离心，取上清液，最后减压浓缩至IOml左右，再以0.22μπι的滤膜过滤，滤液经冷冻干燥的方法将提取得到的药物制成粉末，标记为FS-4，-20°C保存备用。
[0057]实施例5:连翘抗肿瘤活性物质(FS-4)体外诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡作用
[0058]采用MTT比色法检测连翘抗肿瘤活性物质体外对人胃癌SGC-7901细胞生长、增殖的抑制作用。FS-4作用于人胃癌SGC-7901细胞6、12、24、36h的半数抑制浓度(IC5tl)分别为 87.38 μ g/ml、56.10 μ g/ml、34.45 μ g/ml、3.23 μ g/ml。
[0059]通过AO-EB双荧光染色法观察到不同浓度的FS-4作用人胃癌SGC-7901细胞后，出现大量的凋亡细胞(图1所示)。
[0060]透射电子显微镜(金标准)观察到FS-4作用人胃癌SGC-7901细胞后，凋亡细胞的超微结构。显示核浆比减少，核仁消失，胞浆内空泡明显，染色质密集边缘化，细胞表面绒毛脱失，形成质膜叶片样突起，并有凋亡小体形成(图2所示)。
[0061]FS-4作用于SGC-7901细胞后，可使细胞DNA发生断裂，形成“梯状” DNA。
[0062]流式细胞仪Annexin V -PI双染检测细胞凋亡的情况(图3所示)。正常细胞对照组及 12.5 μ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml FS-4 处理 SGC-7901 细胞 12h 后，细胞凋亡率分别为4.15%、8.04%,29.46%,44.66%,58.53%，FS-4各作用组与对照组差异均有显著性(P < 0.01)。
[0063]Western Blot测定不同时间作用于SGC-7901细胞，以及不同浓度FS-4作用于SGC-7901细胞后，均可激活凋亡相关蛋白(Caspase-3、Caspase-9、Bcl_2、Bax)的表达。
[0064] 本发明提取出的连翘抗肿瘤活性物质(FS-4)，经一系列的抗肿瘤活性测定，证实其具有体外诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用。FS-4作用于SGC-7901细胞36h半数抑制浓度(IC5tl)仅为3.23 μ g/ml，优于临床常用药物顺钼的作用(IC5tl为4.21 μ g/ml)。根据《国家新药(西药)临床前研究指导原则汇编》规定，植物粗提物IC5tl ( 20μ g/ml，并且有细胞毒性的剂量依赖性关系，可判定样品在体外对细胞具有杀伤作用，由此可见连翘抗肿瘤活性物质(FS-4)是一种强的抗肿瘤活性物质。
[0065]实施例6:FS-4成分的初步验证
[0066]WATERS公司Acquity超高效液相色谱仪串联四级杆飞行时间质谱仪(UPLC/Q-T0FMS), ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 X 50mm, 1.7 μ m)色谱柱，配有 PDA 检测器和 MassLynx4.1
工作站。
[0067]1、样品溶液制备
[0068]溶剂为80%甲醇水溶液。称取FS-410mg溶于10ml80%甲醇水溶液，制作lmg/ml的贮备液，4 °C存储，待测。
[0069]2、色谱分离条件
[0070]流动相A为0.1%甲酸高纯水溶液，流动相B为乙腈；流速为0.35ml/min。梯度洗脱进行分离，初始梯度保持2%流动相B (乙腈)0.5min,在IOmin内乙腈线性上升至100%,维持1.5min，之后3.5min内乙腈含量降回2%，详见下表1。平衡色谱柱lmin。每次进样量为5 μ L ;柱温35°C ；自动进样器内环境温度维持在4°C。
[0071 ] 表1连翘FS-4梯度洗脱条件
[0072]
【权利要求】
1.一种从连翘中提取抗肿瘤活性物质的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)连翘水提液的制备 连翘经过筛除尘后，水洗浸泡过夜，次日文火煮沸，过滤，收集滤液，蒸发浓缩，制成水提液，灭菌，标记为FS-1，置4°C冰箱保存备用； (2)乙醇沉淀法初步分离抗肿瘤有效部位 取连翘水提液FS-1置 于塑料离心管中，然后向其中分次缓慢加入质量百分比浓度为90%-100%的乙醇溶液，并不断震荡，直至乙醇溶液的体积达到溶液总体积的90%-95%为止，将离心管置于4°C冰箱8-14h，低温离心，收集上清液，上清液经滤纸过滤，减压浓缩后，置于4°C冰箱备用，标记为FS-2 ； (3 )大孔吸附树脂柱层析法分离连翘抗肿瘤有效部位 取FS-2，缓慢加入到预处理好的大孔吸附树脂柱顶端，加入量为2%柱体积，待FS-2渗入树脂层，依次用蒸馏水、质量百分比浓度为30%、60%、90%的乙醇溶液，以5.00ml/min流速进行洗脱，收集洗脱部分，质量百分比浓度为90%的乙醇洗脱液经100°C条件下减压浓缩后，标记为FS-3 ； (4)薄层层析法分离连翘抗肿瘤活性物质 按照苯:正己烷:甲醇:冰乙酸的体积比=14-16:14-16:0.5-1.5:0.5-1.5配制展开剂，将FS-3于室温25°C下在薄层制备板上展开，展开时间50-60min，晾干；然后，通过碘熏法熏染薄层制备板，并在紫外灯照射下观察，即发现FS-3分为13个条带，收集从薄层制备板上数的第4个条带，标记为FS-4，即为抗肿瘤活性物质。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)按照以下步骤进行:连翘经过筛除尘后，用自来水清洗3-6遍，再用蒸馏水洗2-4遍，然后加蒸馏水使液面高出连翘8-15cm，浸泡过夜；次日文火于100°C煮沸，l_3h后趁热用脱脂棉过滤，药渣重复提取，再用脱脂棉过滤，将两次滤液混合，于100°C蒸发浓缩至1.00mg/ml，制成水提液，经三日间歇平压灭菌法灭菌，每次40min，置4°C冰箱保存备用。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的低温离心是指于4°C，4000r/min 离心 15min。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的大孔吸附树脂柱为X-5型大孔吸附树脂柱。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的展开剂按照苯:正己烷:甲醇:冰乙酸的体积比=15:15:1:1配制,展开时间为55min。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述第4个条带的收集方法包括以下步骤: (1)从薄层制备板上将上数第4个条带切割下来放入小烧杯中； (2)向烧杯中加入无水乙醇，搅拌，沉淀20-24h后收集上清液，用脂溶性的0.22 μ m滤膜过滤，得到过滤后的上清液，备用，重复步骤(2) 2-3次； (3)将收集的过滤后的上清液混合后，再离心，取上清液，减压浓缩后以脂溶性的0.22 μ m的滤膜过滤，滤液经冷冻干燥制成粉末，标记为FS-4，即为抗肿瘤活性物质。
7.按照权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的抗肿瘤活性物质。
8.权利要求7所述的抗肿瘤活性物质在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为胃癌 。
【文档编号】A61P35/00GK103933125SQ201410135783
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】李鑫, 刘微, 李洪源, 李丹娜 申请人:哈尔滨医科大学