专利名称：一种具有抗肿瘤作用的血清制剂及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于抗肿瘤药物技术领域，特别涉及一种利用蛇毒提取具有抗肿瘤作用的血清制剂的制备方法。
癌症的化学治疗是降低癌症死亡率的重要措施。用蛇毒及其有效组分抗癌的研究在国内外都已经开展，并取得一定的成果，特别是在眼镜蛇毒方面，已先后有用全蛇毒制剂或它的有效组分体内注射或体外培养抗癌的报道，但由于眼镜蛇毒中成分复杂，大多数组分直接进入体内都可能对机体产生严重毒性反应，直接用全蛇毒或其某一成分(如对细胞有直接溶解作用的组分)的体外抗癌虽确有一定效果，临床实际应用则风险很大，因此，这些研究成果很难在临床应用和推广。国内外已有用眼镜蛇毒组分与单抗偶联导向性杀伤肿瘤细胞的研究，但因偶联物易于解体而导致眼镜蛇毒组分脱落失效，或因分子较大不易进入实体瘤内部，以及目前缺乏对人类肿瘤细胞亲和力强的单抗等原因，眼镜蛇毒组分与单抗偶联导向性杀伤肿瘤细胞的方法对人类肿瘤，特别是实体瘤的疗效不确切，目前尚难用于临床；国内有学者报道眼镜蛇毒通过口服途径在动物实验中有明显的抗癌作用，且无明显的毒副作用，其疗效经临床试用得到证实，但直接用蛇毒口服对于有消化道破损的病人有直接进入血液循环的危险，不利于在临床推广应用，因此有必要对其制剂加以改造。
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种毒性低、选择性高、疗效确切的具有抗肿瘤作用的血清制剂的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种由上述方法制得的具有抗肿瘤作用的血清制剂。
本发明的再一目的在于提供上述具有抗肿瘤作用的血清制剂的应用。
本发明是通过下述的技术方案来实现的本具有抗肿瘤作用的血清制剂的制备方法包括下列步骤(1)给动物口服蛇毒或蛇毒在体外消化、变性的产物，连续口服一天以上；(2)在动物服用蛇毒或其消化、变性产物后抽取该动物的血清；(3)将抽取的血清加工成制剂。
给动物口服蛇毒的剂量范围为给大型动物每日口服量按体表面积折算相当于家兔剂量10mg/kg～该动物的最大耐受量。
具体地说，可以给健康成年家兔每日口服11.2～45mg/kg的眼镜蛇毒或给其他大型动物口服按体表面积折算与家兔剂量11.2～45mg/kg相应等效剂量的眼镜蛇毒，连续口服的时间为3～5天。
本发明还涉及由本方法制得的具有抗肿瘤作用的血清制剂在制备治疗或预防肝癌、肺癌、鼻咽癌、白血病等多利人类恶性肿瘤的药物中的应用。
本发明与现有的用蛇毒治疗肿瘤的方法相比具有如下的优点及效果(一)毒性低由于眼镜蛇毒中成分复杂，含有多种对机体有剧毒的毒素，大多数天然组分直接注射入体内都可能对机体产生严重毒性反应，直接注射给药的方法风险太大，难于在临床应用，直接用眼镜蛇毒口服也有一定的危险性。眼镜蛇毒中具有生物活性的组分均为蛋白质类物质，经由本方法通过动物口服给药后，这些蛋白质经过动物的胃肠道内消化酶的消化和肝内首关消除，最终以各种小分子消化产物的形式进入体循环，眼镜蛇毒的原有毒性将不复存在，因而由本方法制得的血清制剂不会产生全身性的毒性反应，使用非常安全。
(二)选择性高、副作用小既往研究中，用眼镜蛇毒或其组分的体内、体外抗癌实验表明，它们与传统化疗药一样，在杀灭肿瘤细胞的同时，也一定程度地对正常机体细胞，特别是增殖较快的机体细胞产生细胞毒性。而本发明制得的血清制剂在对人肝癌、肺癌、白血病及鼻咽癌细胞产生明显细胞毒性的同时，对增殖较快的正常人胚肺成纤维细胞完全没有细胞毒性，因而副作用较小。
(三)疗效确切先期的动物实验和临床验证已证实口服眼镜蛇毒具有一定的抗癌作用，而由本发明制得的血清制剂由于具有毒性低和选择性高的优点，因而治疗范围大，剂量调整空间充足，不会受到毒性作用的制约，易于确保体内达到足够的药物浓度。实验研究结果也证明本发明对多种肿瘤具有明显的抗癌活性，既抑制癌细胞增殖，更促进其凋亡。同时，由于消化吸收产物的分子变小，更易进入实体瘤内部和跨膜进入肿瘤细胞，有利于充分发挥其药理作用。
(四)应用前景好由于本发明具有上述特点，因而较之既往研究的眼镜蛇毒制剂更有利于在临床推广应用；又由于本发明的原料资源非常丰富，制备方法简便，所以可极方便地批量生产；由本方法制得的产品为血清冻干粉，便于保存，也便于根据需要制作胶囊剂或注射剂使用，同时，它还为进一步分离纯化出有效组分，以生化制药手段开发安全、高效的国家一类抗癌新药提供了良好的基础。
为了更好地体现本发明的效果，下面将用体外培养肿瘤细胞实验及动物急性毒性试验结果来说明由本方法制得的血清制剂对人体肿瘤细胞的抑制作用及低毒特点。在体外培养肿瘤细胞实验中可发现口服眼镜蛇毒的动物血清对HpeG2等多种人类肿瘤细胞确能产生明显的细胞毒作用，可使肿瘤细胞生存率明显下降，而与之对照的动物空白血清作用明显较弱；该血清与动物空白血清相比，对增殖迅速的人胚肺成纤维细胞完全没有细胞毒作用。该血清对癌细胞的分裂指数有明显的抑制，表明它具有抑制肿瘤细胞增殖的作用；流式细胞仪检查及DNA条带分析结果表明，它还可显著诱导肿瘤细胞凋亡。用昆明种小鼠口服该制剂的急性毒性试验结果表明，小鼠对高剂量蛇毒血清制剂的口服最大耐受量大于5g/kg，说明该制剂为低毒制剂。下面是相关实验结果1.血清制剂的制备健康成年新西兰兔21只，分为7组，每组3只，每日以眼镜蛇毒(高剂量45mg/kg、低剂量22.5mg/kg)或蒸馏水灌胃，各组给药方案分别为蛇毒45mg/kg×1天，蛇毒45mg/kg×3天，蛇毒45mg/kg×5天，蛇毒22.5mg/kg×1天，蛇毒22.5mg/kg×3天，蛇毒22.5mg/kg×5天，蒸馏水1ml/kg×3天。在末次给药后4小时，在乙醚麻醉状态下，经动物颈动脉用无菌导管收集尽可能多的血液，待血液在体外凝结后，以1500转/分速度离心15分钟，抽取全部上清(血清)，合并组内3只动物的血清，经60℃水浴30分钟灭活补体后，冷冻干燥成冻干粉，常温密封保存备用。
2.最佳给药天数选择以人肝癌HepG-2细胞株按常规方法体外培养，待细胞开始增殖并达到一定数量后，分别接种到含上述血清冻干粉1mg/ml的培养基中，48小时后用血细胞计数板在高倍镜下计数肿瘤细胞，结果表明灌服两种剂量蛇毒动物的血清在细胞毒作用上均为1天组较弱，3或5天组作用强度相似。表明连续给药3天后，血清中药物有效组分含量已达稳态水平，可见3天为最佳给药天数，以下实验均用给药3天的血清为受试血清。
3.对四种肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒作用按常规方法分别测定受试血清对人肝癌HepG-2细胞、人白血病HL-60细胞、人鼻咽癌CNE-2细胞和人肺腺癌细胞四种肿瘤细胞，以及正常人胚肺成纤维细胞的细胞毒作用。四种肿瘤细胞的实验均分为13组进行，分别为正常血清、低剂量蛇毒血清和高剂量蛇毒血清各3种浓度(冻干粉1、2.5、5mg/ml)，阳性对照药阿霉素3种浓度(5、10、15μg/ml)，空白对照(正常培养基)，每组10孔。加药48小时后作生存细胞计数，并参照空白对照组的细胞数均值计算各受试药对细胞的抑制率，结果分别见表1～表2。
表1.眼镜蛇毒血清对四种肿瘤细胞生存数的影响(×103，x±s，n＝10)
与同浓度正常血清组比较* p＜0.05，**p＜0.01与阿霉素(5μg/ml)组比较#p＜0.05，##p＜0.01表2.眼镜蛇毒血清对四种肿瘤细胞生存的抑制率(％，x±s，n＝10)
与同浓度正常血清组比较*p＜0.05，**p＜0.01与阿霉素(5μg/ml)组比较#p＜0.05，##p＜0.01上述结果经双因素方差分析，组间有非常显著差异(p＜0.01)，组内样本间无明显差异(p＞0.05)。组间t检验结果见表内标记，与同浓度正常血清比较，高、低剂量蛇毒血清各组的细胞毒作用均显著强于正常血清(p＜0.01)，确有独特的细胞毒作用，低、高剂量蛇毒血清5mg/ml的强度稍强于阿霉素5μg/ml(p＜0.05或p＜0.01)。
正常细胞实验分9组，为正常血清、高剂量蛇毒血清各4种浓度(0.5、1、2、5mg/ml)，空白对照(正常培养基)。每组10孔，给药前先测定各样本的细胞数，加药72小时后作生存细胞计数，并参照给药前的细胞数均值计算各受试药对细胞的增殖率，结果见表3。
表3.限镜蛇毒血清对人胚肺成纤维细胞生存数的影响(x±s，n＝10) 与同浓度正常血清组比较*p＜0.05，上述结果经双因素方差分析，组间有显著差异(p＜0.05)，组内样本间无明显差异(p＞0.05)。组间t检验结果见表内标记。对正常人胚肺成纤维细胞，蛇毒血清表现为促进细胞增殖，其作用略强于正常家兔血清，去除家兔血清本身的作用，蛇毒消化产物对正常细胞完全没有细胞毒作用，反而略有促进细胞增殖的作用，表现出对肿瘤细胞的高度选择性细胞毒作用。
4.抗肿瘤细胞增殖实验
按常规方法分别测定受试血清对人肝癌HepG-2细胞、人白血病HL-60细胞、人鼻咽癌CNE-2细胞和人肺腺癌细胞四种肿瘤细胞分裂指数的影响。四种肿瘤细胞的实验均分为4组进行，分别为正常血清、高剂量蛇毒血清(浓度均为5mg/ml)，阳性对照药阿霉素(15μg/ml)，空白对照(正常培养基)。每隔24小时各组做10张抹片，用HE染色后在高倍镜下数100个完整细胞，累计10张片的1000个完整细胞中的分裂细胞数，得出该组的细胞分裂指数，连续观察7天，结果见表4～表7。
表4.眼镜蛇毒血清对CNE-2细胞分裂指数的影响(10-3) 表5.眼镜蛇毒血清对HepG-2细胞分裂指数的影响(10-3)
表6.眼镜蛇毒血清对HL-60细胞分裂指数的影响(10-3)
表7.眼镜蛇毒血清对肺腺癌细胞分裂指数的影响(10-3)
由上述结果可见，眼镜蛇毒血清的抗细胞增殖作用较正常家兔血清为强，而与浓度为15μg/ml的阿霉素相近。说明它的细胞毒作用与抑制肿瘤细胞增殖有关。
5.促进肿瘤细胞凋亡实验在上一实验细胞培养的基础上，用流式细胞法测定了受试药物对肝癌和白血病细胞凋亡的影响，结果见表8。
表8.眼镜蛇毒血清对两种肿瘤细胞凋亡率(％)的影响
结果表明，正常家兔血清不能明显增加肿瘤细胞的凋亡，而蛇毒血清则可使细胞凋亡率增加10倍以上，其作用接近15μg/ml浓度的阿霉素。DNA条带分析也表现出类似结果，这提示眼镜蛇毒血清对肿瘤细胞的细胞毒作用主要与促进肿瘤细胞凋亡有关。
6.高剂量眼镜蛇毒血清制剂口服的急性毒性试验取健康昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重20.1±1.5g，禁食12小时后按5g/kg剂量一次灌胃给予25％浓度的高剂量蛇毒血清冻干粉溶液，经连续14日观察，未发现任何明显毒性反应，小鼠在观察期内无一死亡。实验结果表明小鼠口服该制剂的最大耐受量大于5g/kg，由此可见该血清制剂为一种低毒制剂。
下面将描述本发明的几个实施例，但本发明的内容完全不局限于此。
实施例1将眼镜蛇毒粗毒干燥物用蒸馏水配制成4.5％浓度药液，每日按1ml/kg体重给健康成年家兔灌胃，使用药剂量相当于文献报道对荷瘤小鼠口服眼镜蛇毒有效剂量(30mg/kg)的4倍(按体表面积折算)，连续给药3天；在末次给药4小时后，在乙醚麻醉状态下，经动物颈动脉用无菌导管收集尽可能多的血液；待血液在体外凝结后，以1500转/分速度离心15分钟，抽取全部上清(血清)，经60℃水浴30分钟灭活补体后，冷冻干燥成冻干粉，常温密封保存备用。
实施例2按照实施例1中描述的方法，家兔口服的药液浓度为含眼镜蛇毒粗毒干燥物1.12％，使用药剂量相当于文献报道对荷瘤小鼠口服眼镜蛇毒的有效剂量(按体表面积折算)。
实施例3按照实施例1中描述的方法，家兔口服的药液浓度为含眼镜蛇毒粗毒干燥物2.25％，使用药剂量相当于文献报道对荷瘤小鼠口服眼镜蛇毒有效剂量的2倍(按体表面积折算)。
实施例4按照实施例1中描述的方法，但家兔口服眼镜蛇毒药液仅给药1天。
实施例5按照实施例1中描述的方法，但家兔口服眼镜蛇毒药液为连续给药5天。
实施例6按照实施例1中描述的方法，但家兔口服的眼镜蛇毒粗毒先用胃蛋白酶在体外部分消化，其方法是将0.1克胃蛋白酶溶解于10ml 0.4％的稀盐酸溶液中做成消化液，然后将眼镜蛇毒4.5克加入消化液中，搅拌溶解后消化30分钟，然后以蒸馏水稀释至100ml。
实施例7按照实施例1中描述的方法，但家兔口服的眼镜蛇毒粗毒药液在给药前先用100℃水浴加热30分钟，使其中的蛋白质变性。
权利要求
1.一种具有抗肿瘤作用的血清制剂的制备方法，其特征在于包括下列步骤(1)给动物口服蛇毒或蛇毒在体外消化、变性的产物，连续口服一天以上；(2)在动物服用蛇毒或其消化、变性产物后抽取该动物的血清；(3)将抽取的血清加工成制剂。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的血清制剂的制备方法，其特征在于给动物口服蛇毒的剂量范围为给动物每日口服量按体表面积折算相当于家兔剂量10mg/kg～该动物的最大耐受量。
3.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的血清制剂的制备方法，其特征在于给健康成年家兔每目口服11.2～45mg/kg的眼镜蛇毒或给其他大型动物口服按体表面积折算与家兔剂量11.2～45mg/kg相应等效剂量的眼镜蛇毒，连续口服的时间为3～5天。
4.一种用权利要求1所述方法制备的具有抗肿瘤作用的血清制剂。
5.权利要求4所述的具有抗肿瘤作用的血清制剂在制备治疗或预防肝癌、肺癌、鼻咽癌、白血病等多种人类恶性肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种具有抗肿瘤作用的血清制剂的制备方法,先给动物定量口服一定剂量的蛇毒或其体外变性、消化的产物,连续口服一天以上;在动物服用蛇毒或其消化、变性产物一定时间后抽取该动物的血清;再将抽取的血清加工成制剂。本方法制得的血清制剂具有毒性低、选择性高、疗效确切、应用前景好的优点,可应用于生产制备治疗或预防肝癌、肺癌、鼻咽癌、白血病等多种人类恶性肿瘤的药物。
文档编号A61P35/00GK1333021SQ01114650
公开日2002年1月30日 申请日期2001年4月24日 优先权日2001年4月24日
发明者任先达, 李红良, 张海伟, 罗英儒, 叶春玲 申请人:暨南大学