专利名称：：一种卵巢肿瘤血清标志物的制作方法
技术领域：
：本发明属生物
技术领域：
，具体涉及一种卵巢肿瘤血清标志物。
背景技术：
：研究揭示，卵巢癌为妇科三大恶性肿瘤之一，死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤的首位。目前临床对于卵巢癌的早期诊断仍面临诸多困难，一般体检和影像学检查作用有限，待能够发现和明确诊断时，往往已到了中、晚期，缺少预警价值。常用于检查的血清标志物如癌抗原125(CA125)对于恶性卵巢肿瘤有提示作用，但仍容易与炎症、良性肿瘤导致的改变相混淆，因而易造成误诊(准确性70%-80%)。为了满足临床诊断日益提高的灵敏度和特异性要求，开发新的血清肿瘤标志物势在必行。研究显示，恶性肿瘤发生必然伴随一系列基因结构的改变，引起细胞代谢方式转换。如由有氧呼吸为主改变为无氧酵解方式；由定向生长变为无向繁殖，并分泌酶类降解基质侵入周围；还大量分泌原先不/弱表达的多肽，如CA125、pl85等。这种代谢变化在早期即可被检测出，如在绒癌早期，可以测出血清中高糖化人绒毛膜促性腺激素beta单位的核心成分beta-hCGcore。故寻找到这些部位、组织特异性的血清生物标志物临床意义显得尤为重要。卵巢肿瘤血清标志物的研究一直是本领域的研究重点。血清中蛋白含量较多，其谱型变化其中是由代谢改变所致结果，如分泌、合成(同一型的转换)、肽链切割点改变，修饰基团变化等；或是导致代谢改变的原因，如环氧化酶I(COX-I)和环氧化酶2(C0X-2)转换。实践显示，代谢组学分析的对象物理化学参数差异大，采用单一分离分析手段难以对其进行无偏向全面分析。在代谢组学的研究中，常采用色谱、质谱、核磁共振(NMR)、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、发射性检测、光散射等分离分析手段及其组合。其中，色谱以其高分离度、高通量，质谱以其普适性、高灵敏度和特异性，核磁共振技术特别是H-NMR以其对含氢代谢产物的普适性而成为最主要的分析工具；由于液一质联用和气-质联用分析范围较广，成为代谢组学研究分析中很重要的工具。核磁共振技术具备快速和无偏向性的特点，但与其它技术相比灵敏度太低；其它方法，如CE/LIF技术有很高的检测灵敏度，但为选择性检测，故色谱质谱联用是目前常采用的能较好兼顾灵敏度和无偏性的检测方法。
发明内容本发明的目的在于提供一种卵巢肿瘤血清标志物。根据本发明，可建立系列的良性、交界性和恶性卵巢肿瘤的血清代谢组学指纹图谱。进一步建立系列的良性、交界性和恶性卵巢肿瘤的血清代谢组学指纹模型。本发明采用色谱和质谱技术，高通量、大规模对患者血清进行多层次的分析，筛选血清差异表达分子，通过对卵巢肿瘤患者血清进行不同层次的代谢组学以及多肽谱分析，明确其中的小分子代谢谱，从而找到多组与良性、交界性和恶性卵巢肿瘤相关的特征性生物标志物。本发明有可能为大规模筛查不同阶段的卵巢肿瘤提供简易的方法，亦可为相关临床病人的鉴别诊断提供有价值的参考依据。本发明的目的通过下述技术方案和方法实现，(1)、收集各种类型的卵巢肿瘤患者的血清标本；首先制定标本收集规程和配套管理、教育软件。包括，记录病人基本信息肿瘤分期、分型和分级，治疗方式，化疗和用药类型、剂量、时间等，以便归类分层。并对病人进行跟踪随访，为预后分析做好准备。同时收集正常人群(女性)等量外周血标本，以及卵巢良性肿瘤(内异症、囊腺瘤、畸胎瘤等)标本。所有患者信息均输入数据库，加密保存并备份。(2)、质谱_色谱联用的代谢组学方法完成标本差异表达分子的筛选；将收集到的标本妥善保存(-70°C)，在规定时间内进行处理。对不合格的标本(数量不够或混有杂质)，重新收集。标本内容物的提取、层析均按标准化过程进行。所收集到的正常对照，良性及恶性肿瘤患者的血清进行平行的代谢组学和蛋白组学分析①、基于UPLC-Q/TOFMS(超高效液相色谱/飞行时间质谱)的血液全组分代谢组学分析。将一定量的血清经过除蛋白，冻干等前处理之后，进行UPLC-Q/TOFMS分析，得到患者的全血的代谢物谱图，然后经过代谢组学软件的处理，得到各种代谢物的相关信息，所有数据归一化之后，进行下一步的多维数据综合分析。②、基于HPLC-Q/TrapMS(高效液相色谱/串联四级杆离子阱质谱)的血清磷脂的代谢轮廓分析以及溶血磷脂酸(LPA)的代谢靶标分析。对血清样本，首先进行针对磷脂的液液萃取，然后利用LC-Qtrap进行分离分析，利用色谱图并结合EPI质谱图对各类磷脂分子进行定性。之后，利用自主开发的软件提取色谱峰并进行半定量分析。在此基础上，通过数据处理方法，找出其中代谢变化明显的磷脂分子，进而研究其在代谢通路中的作用、生物学意义以及对发病机理的影响。对于LPA的分析过程与磷脂类似，只是在提取方法及质谱条件上会有所不同。上述所有分析结果经过数据处理之后，进入下一步的数据综合分析。③、基于MALDITOFMS(基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱)的血清多肽谱的分析。将全血中的蛋白质及多肽经分离纯化后进行MALDITOFMS分析，将得到的多肽谱进行解析，找到与疾病相关的特征峰，并且进一步分析其肽链结构，最后将得到的结果进行综合整理之后进入下一步的数据综合分析。(3)、通过数据分析软件，实现对血清代谢组学指纹图谱的化学计量学分析。上述分析结束之后，将原始数据进行化学计量学的分析。例如PCA(主成分分析)ANN(人工神经元网络)等分析，以期取得下列结果从血液全组分分析数据之中找出癌症相关的小分子生物标记物，并鉴定其结构；得到癌症病人的磷脂代谢轮廓分析谱以及溶血磷脂酸的代谢靶标分析谱，并分析其病理机制；得到病人的血清多肽代谢谱，并尽可能的鉴定其中的特征峰的氨基酸序列。最后，在综合上述所有工作的基础之上，通过数据分析软件，利用上述得到的所有的谱图数据，确定有应用价值的筛选良性、交界性和恶性卵巢肿瘤的血清代谢组学指纹图谱。本发明不但提供了有关卵巢肿瘤血清血清多肽谱变化，还能建立其变化与代谢谱之间的联系，做到某种程度上的相互印证。在肿瘤血清标志物的蛋白组学研究方兴未艾之际，将其研究领域由多肽谱推及到包括其他代谢小分子在内的代谢谱。不但避免了和国内外同行的简单重复竞争，而且开拓了筛选范围，将会得到更具实用和基础研究意义的差异性生物标志物。图1是恶性卵巢肿瘤组与健康对照组的PLS-DA模型，其中，A得分矩阵□为恶性卵巢肿瘤组，▲为健康对照组，每个点表示一个样品，t表示样本在主成分投影值；B载荷矩阵每个点表示一个质谱检测到的离子，w*c表示变量在主成分上的载荷投影值，变量重要性因子由每个变量(质谱检测到的离子)在载荷矩阵中的载荷投影值计算得出，离原点远的点具有大的变量重要性因子，为潜在标志物。图2是良性卵巢肿瘤与健康对照组的PLS-DA模型，其中，A得分矩阵+为良性卵巢肿瘤组，▲为健康对照组，每个点表示一个样品，t表示样本在主成分投影值；B载荷矩阵每个点表示一个质谱检测到的离子，w*c表示变量在主成分上的载荷投影值，变量重要性因子由每个变量(质谱检测到的离子)在载荷矩阵中的载荷投影值计算得出，离原点远的点具有大的变量重要性因子，为潜在标志物。图3是交界性卵巢肿瘤与健康对照组的PLS-DA模型，其中，A得分矩阵〇为交界性卵巢肿瘤组，▲为健康对照组，每个点表示一个样品，t表示样本在主成分投影值；B载荷矩阵每个点表示一个质谱检测到的离子，w*c表示变量在主成分上的载荷投影值，变量重要性因子由每个变量(质谱检测到的离子)在载荷矩阵中的载荷投影值计算得出，离原点远的点具有大的变量重要性因子，为潜在标志物。图4是健康人与良性，恶性卵巢肿瘤的血清全组分分析PLS-DA模型，其中，A得分矩阵□为恶性卵巢肿瘤组，+为良性卵巢肿瘤组，▲为健康对照组，每个点表示一个样品，t表示样本在主成分投影值；B载荷矩阵每个点表示一个质谱检测到的离子，w*c表示变量在主成分上的载荷投影值，变量重要性因子由每个变量(质谱检测到的离子)在载荷矩阵中的载荷投影值计算得出，离原点远的点具有大的变量重要性因子，为潜在标志物。图5是健康人与良性，恶性，交界性卵巢肿瘤的血清全组分分析PLS-DA模型，其中，A得分矩阵□为恶性卵巢肿瘤组，+为良性卵巢肿瘤组，ο为交界性卵巢肿瘤组，▲为健康对照组，每个点表示一个样品，t表示样本在主成分投影值；B载荷矩阵每个点表示一个质谱检测到的离子，w*c表示变量在主成分上的载荷投影值，变量重要性因子由每个变量(质谱检测到的离子)在载荷矩阵中的载荷投影值计算得出，离原点远的点具有大的变量重要性因子，为潜在标志物。图6是恶性卵巢肿瘤与健康对照模型和良性卵巢肿瘤与健康对照模型的SUS图。图7是对恶性卵巢与健康对照模型和交界性卵巢肿瘤与健康对照模型SUS图。图8是交界性卵巢肿瘤与健康对照模型和良性卵巢肿瘤与健康对照模型SUS图。具体实施例方式实施例11、各种类型的卵巢肿瘤患者的血清标本收集收集正常对照组362例、良性组281例、交界性组51例和恶性组305例。2、利用选定的基于质谱-色谱联用的代谢组学方法完成标本差异表达分子的筛选工作。建立了用于卵巢癌恶性肿瘤生物标志物谱发现的代谢组学分析模型。包括恶性卵巢肿瘤组与健康对照组，良性卵巢肿瘤与健康对照组，交界性卵巢肿瘤与健康对照组，健康对照组与良、恶性卵巢肿瘤，健康对照组与良、恶性和交界性卵巢肿瘤的血清全组分代谢谱模型；采用多变量统计分析方法寻找到了特征性的生物标志物谱，并对特征代谢物结构进行了鉴定。①、恶性卵巢肿瘤组与健康对照组的血清全组分代谢谱模型。选取27例恶性卵巢肿瘤样本和28例健康对照用于恶性卵巢肿瘤组与健康对照组的血清全组分分析模型的建立。将得到的总离子流(TIC)图进行峰提取、峰匹配。数据用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)方法对恶性卵巢肿瘤以及健康对照血清的代谢指纹数据进行建模。结果如图1从图IA中可以看出恶性卵巢肿瘤和健康对照组的代谢显型有比较显著的区别，据此建立的PLS-DA模型可以解释90.7%的分类信息，并且模型的预测能力达到71.6%。根据变量重要性因子筛选对分类贡献最大的10个检测离子，这些代谢物可被认为是在恶性卵巢肿瘤代谢产生影响的生物标志物谱。表1是与恶性卵巢肿瘤有关的化合物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>②、良性卵巢肿瘤与健康对照组的血清全组分代谢谱模型。选取31例良性卵巢肿瘤血清样本和28例健康对照血清样本，用于健康人和良性卵巢肿瘤的血清全组分分析模型的建立。实验条件与健康对照组与恶性卵巢肿瘤组的分析模型相同。将得到的总离子流(TIC)图进行峰提取、峰匹配。数据用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)方法对良性卵巢肿瘤以及健康对照血清的代谢指纹数据进行建模，结果如图2所示。从图2A可知良性卵巢肿瘤与健康对照样本的血清代谢轮廓也有比较明显的区别，据此建立的PLS-DA模型能够解释73.2%d的分类信息，预测准确率为54.9%。根据变量重要性因子筛选对分类贡献最大的10个检测离子，这些代谢物可被认为与在良性卵巢肿瘤代谢产生影响的密切相关。表2是与良性卵巢肿瘤有关的化合物。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>③、健康对照组与交界性卵巢肿瘤的血清全组分分析模型。选取19例交界性卵巢肿瘤血清样本和28例健康对照血清样本用于健康人与交界性卵巢肿瘤的血清全组分分析模型的建立，实验条件与健康对照组与恶性卵巢肿瘤组的分析模型相同。将得到的总离子流图进行峰提取、峰匹配。数据用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)方法对交界性卵巢肿瘤以及健康对照血清的代谢指纹数据进行建模，结果如图3所示。所建模型能够解释74.2%的分类信息，预测准确率为56.1%。根据变量重要性因子筛选对分类贡献最大的10个检测离子，这些代谢物可被认为是在交界性性卵巢肿瘤代谢产生影响的生物标志物谱。表3是与交界性卵巢肿瘤相关的化合物。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>④、健康对照组与良性，恶性卵巢肿瘤的血清全组分分析模型。健康人的血清代谢轮廓分别与恶性卵巢肿瘤，良性卵巢肿瘤和交界性卵巢肿瘤得到明显的区分。在此基础上，用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)方法对良性卵巢肿瘤，恶性卵巢肿瘤以及健康对照血清的代谢指纹数据进行建模，结果如图4所示。从图4A可以看出，模型中健康人和良性肿瘤落在主成分1投影值为负的区域，恶性卵巢肿瘤样本位于主成分1投影值为正的区域。因此，根据主成分1可以检测出恶性卵巢肿瘤，并可以避免由于良性肿瘤带来的假阳性结果。而健康人群和良性卵巢肿瘤分别落在主成分2投影值为负和正的两个区域，根据主成分2也可以区分健康人和良性卵巢肿瘤。载荷矩阵中，落在1，4象限的点(主成分1投影值为正，主成分2投影值为负)，在恶性卵巢肿瘤中上调。同样，载荷矩阵(图4B)中落在第二象限和第三象限的点，在良性卵巢肿瘤和健康人中上调。投影值越大化合物重要性越高。⑤、健康对照组与良性，恶性，交界性卵巢肿瘤的血清全组分分析模型。用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)方法对良性卵巢肿瘤，恶性卵巢肿瘤以及健康，交界性卵巢肿瘤以及健康对照血清的代谢指纹数据进行建模，结果如图5所示。从图5A中可以看出健康对照样本，良性卵巢肿瘤和恶性卵巢肿瘤的主成分1投影值均为正值，且它们的主成分2投影值逐渐降低。而交界性卵巢肿瘤样本都落在主成分1投影值为负值的区域，可见交界性卵巢肿瘤和良性，恶性卵巢肿瘤的代谢显型有显著区别。与主成分1相关的化合物是区别交界性与良，恶性卵巢肿瘤的重要化合物。3、通过数据分析软件，实现对血清代谢组学指纹图谱的化学计量学分析。采用代谢组学技术对良性、交界性和恶性卵巢肿瘤之间的关系进行了研究。通过SUS-plot(sharedanduniquestructure)对恶性与良性卵巢肿瘤，恶性与交界性卵巢肿瘤，良性与交界性卵巢肿瘤的关系进行了研究，寻找到了与不同卵巢肿瘤均相关和具有肿瘤相关唯一性的特征代谢物，同时发现良性和交界性卵巢肿瘤的代谢谱相关性较低。本发明采用SUS图来体现模型之间的相互关系。SUS图是一种的载荷矩阵，图中的每一个点代表一个化合物，坐标为化合物与模型中主成分的相互关系。当化合物的横纵坐标值均大于0.5或者均小于-0.5时，代表这些化合物与两个模型的主成分都正相关或相关。通过这些化合物可以体现两个模型的共性。当化合物的横坐标绝对值大于0.5而纵坐标值接近0时，这个化合物与横坐标所代表模型相关而与纵坐标代表模型不相关，体现了横坐标模型的独特性。同样，当化合物的纵坐标绝对值大于0.5而横坐标值接近0时，这个化合物体现了纵坐标所代表模型的独特性。①、对恶性卵巢肿瘤与健康对照模型和良性卵巢肿瘤与健康对照模型作SUS图(图6)。图6中区域1，4内的化合物是良、恶性卵巢肿瘤中都相关的一些化合物，区域3内的化合物是只与恶性卵巢肿瘤相关而与良性肿瘤不相关的。区域4内的化合物只与良性卵巢肿瘤相关而与恶性肿瘤不相关的。初步发现，区域4内都是色氨酸的一些碎片离子，而区域3内是LPC类的化合物。表4是恶性卵巢肿瘤和良性肿瘤的关系研究中涉及的重要化合物。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>②、对恶性卵巢肿瘤与健康对照模型和交界性卵巢肿瘤与健康对照模型作SUS图，见图7。图7中区域1，3内的化合物是交界性，恶性卵巢肿瘤中都相关的一些化合物，区域2，4内的化合物是只与交界性卵巢肿瘤相关而与恶性肿瘤不相关的。区域5内的化合物只与恶性卵巢肿瘤相关而与交界性肿瘤不相关的化合物。表5是恶性肿瘤和交界性肿瘤的关系研究中涉及的重要化合物。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>③、对交界性卵巢肿瘤与健康对照模型和良性卵巢肿瘤与健康对照模型作SUS图，如图8所示。从图8可知良性肿瘤和交界性肿瘤的相关性非常低，图中没有与交界性，良性卵巢肿瘤中均相关的化合物，区域3内的化合物是只与交界性卵巢肿瘤相关而与良性肿瘤不相关的。区域1内的化合物只与恶性卵巢肿瘤相关而与交界性肿瘤不相关的。区域2内的是与交界性肿瘤负相关而与良性肿瘤正相关的化合物。表6是交界性卵巢肿瘤和良性卵巢肿瘤的关系研究中涉及的化合物。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求一种卵巢肿瘤血清标志物，其特征在于通过色谱和质谱技术，高通量、大规模对患者血清多层次的分析，筛选血清差异表达分子，对卵巢肿瘤患者血清进行不同层次的代谢组学以及多肽谱分析，明确其中的小分子代谢谱后，得到卵巢肿瘤血清标志物。2.检测权利要求1所述的卵巢肿瘤血清标志物的方法，其特征在于通过下述方法和步骤(1)、收集各种类型的卵巢肿瘤患者的血清标本；(2)、采用质谱_色谱联用的代谢组学方法进行标本差异表达分子的筛选；(3)、通过数据分析软件，实现对血清代谢组学指纹图谱的化学计量学分析。3.按权利要求2所述的检测卵巢肿瘤血清标志物的方法，其特征在于所述步骤1的各种类型的卵巢肿瘤是良性和恶性卵巢肿瘤。4.按权利要求2所述的检测卵巢肿瘤血清标志物的方法，其特征在于所述步骤2是对所收集到的正常对照，良性及恶性肿瘤患者的血清进行平行的代谢组学和蛋白组学分析。5.按权利要求4所述的检测卵巢肿瘤血清标志物的方法，其特征在于所述步骤2的代谢组学和蛋白组学分析是①、基于超高效液相色谱/飞行时间质谱的血液全组分代谢组学分析；②、基于高效液相色谱/串联四级杆离子阱质谱的血清磷脂的代谢轮廓分析以及溶血磷脂酸(LPA)的代谢靶标分析；③、基于基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱的血清多肽谱的分析。6.按权利要求2所述的检测卵巢肿瘤血清标志物的方法，其特征在于所述步骤3的对血清代谢组学指纹图谱的化学计量学分析是将原始数据进行主成分分析或人工神经元网络分析。全文摘要本发明属生物
技术领域：
，具体涉及一种卵巢肿瘤血清标志物。本发明采用色谱和质谱技术，高通量、大规模对患者血清进行多层次的分析，筛选血清差异表达分子，通过对卵巢肿瘤患者血清进行不同层次的代谢组学以及多肽谱分析，明确其中的小分子代谢谱，从而找到多组与良性、交界性和恶性卵巢肿瘤相关的特征性生物标志物。本发明有可能为大规模筛查不同阶段的卵巢肿瘤提供简易的方法，亦可为相关临床病人的鉴别诊断提供有价值的参考依据。文档编号G01N30/72GK101832977SQ20091004725公开日2010年9月15日申请日期2009年3月9日优先权日2009年3月9日发明者万小平,何以丰,吴晓华,康玉,张晓燕,徐丛剑,房国良,曹锐,程明军,许国旺,赵素敏,路鑫,陈静申请人:复旦大学附属妇产科医院