作为血清和组织生化标志物的bag3的制作方法
【专利摘要】本公开内容涉及诊断生物学标志物领域。具体地，本公开内容涉及用作诊断病理状态的生物学标志物的抗BAG3抗体。此外，本公开内容包括用于在生物样品中检测和评估抗BAG3抗体或BAG3/抗体复合物的特异性ELISA方法和试剂盒。
【专利说明】作为血清和组织生化标志物的BAG3
[0001] 说明
[0002] 本发明涉及用作病理状态的诊断中的生化标志物的抗BAG3抗体。 现有技术
[0003]BAG3(RefSeq:NP_004272 ;基因ID9531)为74kDa的细胞质蛋白，特别是集中在 粗糙型内质网中。BAG3蛋白属于通过称为BAG域的结构域（110-124个氨基酸）与热激蛋 白HSP70的ATPase域相互作用的共分子伴侣（co-chaperones)家族。除了BAG域，BAG3 包括WW域以及可介导与其它蛋白结合的富含脯氨酸的重复（PXXP)。此外，两个保守的 IPV(Ile-Pro-Val)基序位于WW和PXXP区域之间，并介导BAG3结合到分子伴侣HspB家 族的成员HspB8。因此，由于它的多结构域结构的衔接性质，BAG3可与不同的伴侣蛋白相 互作用。bag3基因表达在包括肌细胞的少数正常的细胞类型中和数个原发瘤或肿瘤细胞 系中是组成性的。此外，它可被各种应激源诱导：事实上应激的刺激物激活热激转录因子 (HSF)l，HSF1 负责应激激活的基因包括bag3 的表达（RosatiA，GrazianoV，DeLaurenzi V,PascaleM，TurcoMC.BAG3:amultifacetedproteinthatregulatesmajorcell pathways.CellDeathDis. 2011 ;2:el41)。证据表明，BAG3通过根据细胞的环境以依赖或 不依赖Hsp70的方式调节细胞凋亡调节的蛋白质例如IKKy、Bax或BRAF的水平或定位，具 有维持细胞存活的功能。
[0004]BAG3蛋白质表现为在心肌成肌细胞分化期间表达，并且维持成肌素的表达。这 些发现表明BAG3参与心脏的后期发育（DeMarcoM，TurcoMC，RosatiA，BAG3protein isinducedduringcardiomyoblastdifferentiationandmodulatesmyogenin expression.CellCycle. 2011 ;10:850-852)。此外，在心肌细胞中，BAG3 已经显示位于 Z-盘，并且与肌动蛋白加帽蛋白CapZ0 1相互作用，稳定肌原纤维结构，并且在机械应激过 程中可能保持肌纤维的完整性。BAG3突变可损害Z-盘的组装，并提高对应激诱导的细胞凋 亡的敏感性。与BAG3在心肌细胞并且通常在肌细胞中的存活和肌纤维的完整性中的作用 一致，bag3基因的突变已经与一些形式的肌纤维肌病和扩张型心肌病相关联。
[0005] 到目前为止，已经检测到了细胞质BAG3和可溶的串行形式的BAG3二者，并且发现 它们与不同的病理，以及更广泛地与细胞存活相关联。
[0006] 对允许快速鉴定这样的病理，而不具有以意外的特殊方式以及敏感的方式与创伤 性诊断相关联的缺点，和/或可允许早期检测病理，监测治疗的效果，预测并发症的风险， 进行信息追踪的生物学标志物的鉴定日益感到需求及重要性。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明涉及用作病理状态的诊断中的生化标志物的抗BAG-3抗体。
[0009] 优选地，所述抗BAG-3抗体结合到可溶的BAG3以形成免疫复合物。
[0010] 根据本发明优选的实施方式，所述诊断是体外的（invitro)或离体的（exvivo)。
[0011] 本发明的另一方面为，所述诊断的接受者为哺乳动物，优选人类。
[0012] 如在本发明的详细说明中进一步描述的，本发明的抗BAG-3抗体的用途具有对选 自由心脏病，癌症，糖尿病，皮肤、神经、骨、血管和结缔组织的炎症和炎症相关的疾病组成 的组的病理状态特异性的优点。
[0013] 根据本发明的实施方式，所述心脏病选自：心绞痛、梗塞前心绞痛、心肌梗塞、心力 衰竭、局部缺血（ischemia)、急性冠心病（acutecoronarydisease)、急性心力衰竭、慢性 心力衰竭和医源性心脏病。
[0014] 根据本发明的另一个实施方式，所述癌症选自：胰腺癌、膀胱癌和前列腺癌。
[0015] 本发明的另一个实施方式为检测生物样品中抗BAG3抗体或结合到可溶的BAG3以 形成免疫复合物的抗BAG3抗体的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
[0016]a.获得生物样品，所述生物样品由血清、血浆、尿或唾液组成，
[0017]b.确定所述生物样品中抗BAG3抗体或BAG3缔合的抗体（BAG3associated antibodies)的存在。
[0018] 根据优选的实施方式，本发明的方法还包括以下另外的步骤：
[0019]c.比较从所述生物样品获得的值与参考值或从健康供体获得的值。
[0020] 在优选的实施方式中，所述确定步骤b通过ELISA试验进行。
[0021] 根据本发明优选的实施方式，所述血清、血浆、尿或唾液来自哺乳动物，优选人类。
[0022] 根据本发明的方法的优选的实施方式，所述抗BAG3抗体或所述免疫复合物的存 在与病理状态相关。
[0023] 优选地，所述病理状态选自由心脏病，癌症，糖尿病，皮肤、神经、骨、血管和结缔组 织的炎症和炎症相关的疾病组成的组。
[0024] 优选地，所述心脏病选自：心绞痛、梗塞前心绞痛、心肌梗塞、心力衰竭、局部缺血、 急性冠心病、急性心力衰竭、慢性心力衰竭和医源性心脏病。
[0025] 根据本发明优选的实施方式，所述癌症选自：胰腺癌、膀胱癌和前列腺癌。
[0026] 本发明的另一个实施方式为ELISA试剂盒以及其用于检测生物样品中抗BAG3抗 体或结合到可溶的BAG3以形成免疫复合物的抗BAG3抗体的用途，所述ELISA试剂盒包括 用于捕获可溶的BAG3的BAG3重组蛋白或BAG3特异的小鼠单克隆抗体AC-1、AC-2、AC-3、 AC-4、AC-5、AC_rbla、AC_rblb、AC_rb2a、AC_rb2b、AC_rb3a、AC_rb3b、AC_rb4a和AC_rb4b， 以及能够识别人免疫球蛋白的抗体。
[0027] 优选地，所述生物样品为血清、血浆、尿或唾液样品。
[0028] 在本发明优选的实施方式中，所述血清、血浆、尿或唾液样品来自哺乳动物，优选 人类。
[0029] 本发明还进一步涉及用于检测生物样品中的BAG3蛋白的免疫组织化学（IHC)试 剂盒，其中，所述生物样品优选为组织样品，所述试剂盒包括BAG3-特异的抗体和试剂，所 述试剂包括染色需要的探针。
[0030] 附图简述
[0031] 本发明的特征和优点将从下面记录的详述、为了说明而非限制目的给出的实施例 以及附图1-10中明显，其中：
[0032]图1.
[0033] 图1A:在来自培养的心肌细胞的上清液中检测BAG3蛋白质。在5%的C02气氛下 于37°C使用或不使用10%的FBS培养80%融合的人（HCMa)和大鼠（H9c2)心肌细胞16个 小时。在包含50mMNaCl和0. 05%IGEPAL的缓冲液中透析所述上清液，冻干，并在lml的RIPA缓冲液（50mMTrisHC1pH7. 6、150mM氯化钠、2mM原钒酸钠、4mMEDTA、10mM焦磷酸 钠、1 %NP-40、0. 1 %脱氧胆酸钠）中重悬，通过蛋白质印迹用抗BAG3抗体或抗GAPDH抗体 分析。
[0034] 图1B:在胞吐囊泡中检测BAG3蛋白质。从H9c2细胞获得的上清液（Surnatants) 经连续的离心：（i)2'OOOXg15分钟，以去除细胞；（ii)lO' 000Xg30分钟，以去除细胞 碎片；（iii) 150'000Xg90分钟，以使胞吐囊泡成团块。在PBS中以150'000Xg洗团块 (pellet) 90分钟一次，并通过蛋白质印迹用抗BAG3T0S-2多克隆抗体分析，与全细胞裂解 物比较。Rab-4作为胞吐囊泡的标志物被分析。细胞溶质蛋白GAPDH作为对照被分析。
[0035] 图1C:在蛋白质印迹中用抗BAG3抗体T0S-2多克隆抗体分析来自两个健康供体 和两个受慢性心力衰竭影响的患者的血清。
[0036] 图1D:从凝胶切除在两个受慢性心力衰竭影响的患者中获得的条带，并使用程序 MASCOT通过质谱分析它的身份。
[0037]图 2.
[0038] 图2A:在来自CHF患者的血清中检测BAG3蛋白质。通过蛋白质印迹用从心力衰 竭患者获得的血清（1:40)分析BAG3重组蛋白和来自HCMa细胞的全细胞裂解物。进行来 自健康供体的血清的分析作为阴性对照。
[0039] 图2B:通过ELISA试验检测抗BAG3抗体。在特异性ELISA试验中比较来自50个 CHF患者（具有〈60%的射血分数）的血清与来自50个健康供体的血清中抗BAG3抗体的 存在。结果以任意单位绘制。
[0040] 图2C:ELISA试验结果的R0C分析。于0. 083 A.U.的截断值导致74%的灵敏度 和68 %的特异性。
[0041]图 3.
[0042]图3A:为 了检测rBAG3-FITC结合到HCMa细胞（a、b、c)和J774A1细胞（d、e、f、g、 h、i)而进行直接荧光的共聚焦显微分析。根据生厂商说明书使用购自SIGMA的FluoroTag FITC Conjugation Kit将BAG3重组蛋白和纯化的BSA(来自购自SIGMA的牛血清的白蛋 白）共轭到FITC。根据生产商说明书计算的等量的rBAG3-FITC(b、e)和BSA-FITC(h)蛋白 加到具有〇. 1% NaNj^ HCM和J774 A1的培养介质中1个小时。0-整合素作为对照（a、 d、g)被分析。通过Zeiss LSM共聚焦显微镜分析细胞。合并的图像在c、f和i中显示。
[0043] 图3B:BAG3结合巨噬细胞。用不同浓度的Fitc-BAG3蛋白质（7、14和70nm)培养 J774A1巨噬细胞（1X106细胞/ml)。FITC-BSA(70nM)用作阴性对照（灰色）。通过流式 细胞术分析细胞荧光。
[0044] 图3C图a-分析用BAG3培养的J774A1巨噬细胞中的Cox-2和iNOS水平。用对 照培养基、BSA、LPS或rBAG3培养80%融合的J774A1细胞20个小时。在所示处加入多粘 菌素以证实，由大肠杆菌得到的rBAG3的效果独立于污染性内毒素的存在。通过蛋白质印 迹分析细胞裂解物中的Cox-2和iNOS表达。
[0045] 图3C图b-分析从与BAG3培养的J774A1巨噬细胞释放的亚硝酸盐。用对照培 养基、BSA、LPS或rBAG3培养80%融合的J774A1细胞24个小时。用100ill的格里斯试 剂培养来自每个样品的1〇〇U1上清液；用BeckmanDU62分光光度计测量在550nm的光密 度（0D550)。通过比较样品的0D550与亚硝酸钠的标准曲线来评估亚硝酸盐的浓度。
[0046] 图3C图c一分析从与BAG3培养的J774A1巨噬细胞释放的IL-6。用对照培养基、 BSA、LPS或重组BAG3培养80%融合的J774A1细胞5个小时。在所示处加入BAG3肽（肽 1、肽2、肽3、肽4或乱序肽）625nM，以证实它们封闭BAG3活性的能力。使用ELISA试验测 量细胞培养介质中的IL-6产生。通过比较样品的0D与重组IL-6的标准曲线而评价IL-6 的浓度。
[0047]图 4.
[0048]图 4A:
[0049] 在正常胰腺组织中使用单克隆抗BAG3抗体AC-1染色BAG3的代表图像。用苏木 精复染色切片。染色揭示胰岛的中等阳性，而正常的胰管和胰腺腺泡细胞不具有BAG3的表 达。
[0050]图 4B:
[0051] 使用以生物素化的二抗揭示的单克隆抗BAG3抗体染色的BAG3低阳性和BAG3高 阳性肿瘤样品的代表图像。切片用苏木精复染色。以两个不同的放大率显示：l〇〇X(左图） 和400X(右图）。我们通过使用400X的放大率在10个不重叠的视野的总癌细胞中计数 阳性细胞，基于样品中阳性癌细胞的比例分配评分。如所述地计算的BAG3阳性细胞的中值 百分比为40%，并且该值用作截断值使低阳性的样品和高阳性的样品分开。
[0052] 图4C:做出了比较具有低的BAG3染色（彡40%的阳性细胞）的39个患者与27 个具有高的BAG3染色（>40%的阳性细胞）的患者的存活曲线。所有分析的患者经历胰腺 癌的R0切除。中位存活期从高阳性组中的12个月提高到低阳性组中的23个月。对数秩 检验P值=0.0013。
[0053]图 5.
[0054] 来自数个类风湿性关节炎的滑膜组织中BAG3染色的代表图像。在滑膜成纤维细 胞和炎性浸润物中观察到了BAG3阳性。用苏木精复染色切片。
[0055]图 6.
[0056]BAG3染色在正常膀胱（normalurocystis)中产生阴性和在膀胱移行细胞癌中产 生肿瘤细胞的细胞质中BAG3高阳性的代表图像。用苏木精复染色切片。
[0057]图 7.
[0058]图 7A:
[0059] 在图中显示通过qRT-PCR评价的bag3mRNA相对表达，其中，值报告为平均值 +S.D。蓝色的线表示计算的中值。
[0060]图 7B:
[0061]对qRT-PCR分析的所有患者做出存活分析。13个具有高的bag3表达（中位存活 =19. 0个月）的患者与12个具有低的bag3表达（中位存活=32. 0个月）相比较具有较 短的存活期。对数秩检验P值=0. 0198。
[0062]图 8.
[0063]图 8A:
[0064] 如图中表示，用不同浓度的吉西他滨处理胰腺癌细胞系（PSN1、Capan-1、AsPC-1、 PANC-1和MIAPaCa-2)。在48个小时后，分析凋亡细胞的死亡。图描述了亚G0/G1细胞的 平均百分比（土S.D.)。数据是3个独立的实验的代表。
[0065]图 8B:
[0066] 胰腺癌细胞系中BAG3的蛋白质印迹分析；GAPDH看家蛋白含量用于监测相等的装 载条件。
[0067]图 8C:
[0068] 用2iiM的吉西他滨（GEM)处理MIAPaCa-2和PANC-1细胞系显示的时间，通过蛋 白质印迹监测BAG3蛋白表达水平。
[0069]图 8D:
[0070]通过RT-PCR分析bag3mRNA水平；图描述了相对的bag3mRNA水平（土S.D.)，并 且数据是三个独立的实验的代表。
[0071]图 8E:
[0072]用BAG3siRNA或非靶向siRNA(NTsiRNA)转染MIAPaCa-2 和PANC-1 细胞系 72 个小时，然后用2yM吉西他滨（GEM)处理24个小时。通过蛋白质印迹分析BAG3水平，并 检测GAPDH的水平，以监测相等的装载条件。
[0073]图 8F:
[0074] 如上述转染MIAPaCa-2和PANC-1细胞，并用2iiM吉西他滨（GEM)处理24小时 或48小时。如所述地分析凋亡性细胞死亡。图描述亚G0/G1细胞的平均百分比（土S.D.)。 数据是3个独立的实验的代表。
[0075]图9.
[0076] 图9A:通过ELISA试验检测BAG3特异的免疫复合物。来自55个胰腺癌患者的血 清与来自51个健康供体的血清在特异性ELISA试验中比较BAG3特异的免疫复合物的存 在。结果以任意单位+S.E.绘制。
[0077] 图9B:ELISA试验结果的R0C分析。于0. 183A.U.的截断值导致65%的灵敏度和 78 %的特异性。
[0078]图 10.
[0079] 在特异性ELISA试验中检测来自49个女性受试者在诊断为胰腺癌前0-1年的患 者血清中的BAG3特异的抗体，与来自235个女性对照受试者的血清比较BAG3特异的抗体 的存在。对照血清对于每个病例受试者为约5,并与各个病例年龄匹配。其它时间点包括： 与251个对照相比诊断为PDAC前1-2年的53个受试者；与212个对照相比诊断为PDAC前 2-3年的44个受试者；与187个对照相比诊断为PDAC前3-4年的42个受试者。
[0080] 结果以任意单位土S.绘制。用studentt检验计算P值。
[0081] 发明详述
[0082] 本发明涉及用作病理状态的诊断中的生化标志物的抗BAG-3抗体。
[0083] 本发明中的术语"诊断"指医疗诊断（通常简称为诊断），指尝试确定或鉴别可能 的疾病或紊乱的过程。本发明的诊断还包括早期诊断。
[0084] 术语"早期诊断"指试验在特异或非特异的症状前辨别病理状态的能力。
[0085] 现在在血清、血浆、尿或唾液中有利地检测到抗BAG3抗体。直到现在，还未在生理 或病理状态的血清中发现这样的抗体。在血清中检测抗BAG3抗体作为鉴定和监测治疗的 工具具有诊断、早期诊断和预后目的、风险分层使用的快速和无创技术的优点。
[0086] 抗体的检测的另一个优点为需要非常少量的血清用于检测。实际上，可溶的BAG3蛋白还可在患一些病理的患者的血清中检测到，但是用于检测可溶蛋白所需要的血清量远 高于检测抗体需要的量。此外，以下是可能的：可溶的BAG3蛋白的水平可以比抗体低很多， 和/或相对于可溶的BAG3蛋白，抗体可以是在特定病理的早期阶段可检测的和/或可更有 效地预测并发症的危险或监测治疗的效果。
[0087] 本发明另一个实施方式为可在选自血清、血浆、尿或唾液的不同生物样品中有利 地检测所述抗BAG3抗体。
[0088] 在本发明中，血清意为既非血细胞也非凝血因子的血液的成分；它是去除纤维蛋 白原的血浆。血清包括未用在凝血（凝固）中的所有蛋白质和所有电解质、抗体、抗原、激 素和任何的外源物质。
[0089] 在本发明中，血浆意为通常在悬浮液的全血中保留血细胞的血液的淡黄色/浅黄 色液体组分。它包含凝血因子，例如纤维蛋白原。
[0090] 在另外的实施方式中，本发明提供了抗BAG3抗体作为生化标志物的用途，其中， 所述抗BAG3抗体结合到可溶的BAG3以形成免疫复合物。
[0091] 现在已经在生物样品中有利地检测到游离的或结合到可溶的BAG3以形成免疫复 合物的抗BAG3抗体，并可在病理状态的诊断中用作标志物。在生物样品中检测这样的抗体 和/或免疫复合物还具有用于诊断和/或预后目的的快速和无创技术的优点。
[0092] 根据本发明的优选的实施方式，所述诊断是体外的或离体的。
[0093] 本发明的进一步的实施方式为所述诊断的接受者为哺乳动物，优选人类。
[0094] 在本发明中，免疫复合物或蛋白/抗体复合物意为抗体对可溶抗原的整体结合， 称为单一免疫复合物，结合的抗原作用为结合到抗体的特定的表位。
[0095] 由于还需要非常少量的血清用于检测免疫复合物，这样的免疫复合物具有看作抗 体的检测的相同的优点。检测可溶的BAG3需要的血清的量还比检测蛋白/抗体（免疫） 复合物需要的高很多。可在特异病理的早期阶段检测免疫复合物及游离的抗体，并且可更 有效地预测并发症的危险或监测治疗的效果。
[0096] 本发明的再一个实施方式为抗BAG3抗体或所述免疫复合物（由抗BAG3抗体结合 到可溶的BAG3形成）用作病理状态的生物学标志物的用途，其中，所述病理状态为心脏病， 癌症，糖尿病，皮肤、神经、骨、血管和结缔组织的炎症和炎症相关的疾病。
[0097] 优选地，所述心脏病选自以下组成的组：心绞痛、梗塞前心绞痛、局部缺血、心肌梗 塞、心力衰竭、急性冠心病、急性心力衰竭、慢性心力衰竭和医源性心脏病。
[0098] 根据本发明的优选的实施方式，所述癌症选自：胰腺癌、膀胱癌和前列腺癌。
[0099] 本发明的另外的实施方式为检测生物样品中抗BAG3抗体或结合到可溶的BAG3以 形成免疫复合物的抗BAG3抗体的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
[0100] a.获得生物样品，所述生物样品由血清、血浆、尿或唾液组成，
[0101] b.确定所述生物样品中抗BAG3抗体或BAG3缔合的抗体的存在。
[0102] 根据本发明的方法具有允许检测健康个体和被涉及BAG3的病理影响的患者之间 的抗BAG3抗体和/或BAG3/抗体复合物之间的显著差别的优点。提出的检测方法允许心 脏病患者的组与健康人群的组在统计上显著性地分离。还可在患者的亚组中以增加的危险 (心力衰竭，HF)分层这样的心脏病患者。
[0103] 本发明的再一个方面涉及在生物样品中检测抗BAG3抗体的存在或结合到可溶的 BAG3以形成免疫复合物的抗BAG3抗体的方法，所述方法还包括以下步骤：
[0104]c.比较从所述生物样品获得的值与参考值或从健康供体获得的值。
[0105] 在优选的方面，根据本发明的方法为其中所述确定步骤b通过ELISA试验进行的 方法。
[0106] 根据本发明的方法中的优选的实施方式，所述血清、血浆、尿或唾液来自哺乳动 物，优选人类。
[0107] 根据本发明的方法具有允许病理的、疾病和/或它们的并发症的危险评估、以及 监测治疗的生物学标志物的快速和无创检测的优点。
[0108] 根据另一个方面，本发明涉及检测方法，其中，所述抗BAG3抗体或结合到可溶的 BAG3以形成免疫复合物的所述抗BAG3抗体的存在与病理状态相关。
[0109] 在优选的实施方式中，所述病理状态选自由心脏病，癌症，糖尿病，皮肤、神经、骨、 血管和结缔组织的炎症和炎症相关的疾病组成的组。具体地，所述心脏病选自由以下组成 的组：心绞痛、梗塞前心绞痛、心肌梗塞、局部缺血、心力衰竭、急性冠心病、急性心力衰竭、 慢性心力衰竭或医源性心脏病。
[0110] 根据本发明优选的实施方式，所述癌症选自：胰腺癌、膀胱癌和前列腺癌。
[0111] 本发明还涉及用于检测生物样品中抗BAG3抗体或结合到可溶的BAG3以形成免疫 复合物的抗BAG3抗体的ELISA试剂盒。
[0112] 根据本发明的ELISA试剂盒包括用于捕获抗BAG3抗体或BAG3特异的小鼠单克隆 抗体AC-l、AC-2、AC-3、AC-4、AC-5、AC-rbla、AC-rblb、AC-rb2a、AC-rb2b、AC-rb3a、AC-rb3b、 AC-rb4a和AC-rb4b、用于捕获可溶的BAG3的BAG3重组蛋白，以及能够识别人免疫球蛋白 的抗体。
[0113] 这样的抗体可为能够识别人免疫球蛋白的酶连接的抗体。
[0114] 本发明还涉及用于在生物样品中检测BAG3相关的抗体的试剂盒，并且以用于捕 获可溶的BAG3的BAG3特异的小鼠单克隆抗体AC-1、AC-2、AC-3、AC-4、AC-5、AC-rbla、 AC-rblb、AC-rb2a、AC-rb2b、AC-rb3a、AC-rb3b、AC-rb4 和AC-rb4b以及能够识别人免疫球 蛋白的用于检测的酶连接的抗体通过ELISA进行。
[0115] 优选地，所述生物样品为血清、血浆、尿或唾液样品。
[0116] 在本发明优选的实施方式中，所述血清、血浆、尿或唾液样品来自哺乳动物，优选 人类。
[0117] 本发明还涉及用于检测生物样品中的BAG3蛋白的免疫组织化学（IHC)试剂盒，其 中，所述生物样品优选为组织样品。这些样品可为活体组织切片、冷冻组织、石蜡包埋组织。
[0118] 根据本发明的IHC试剂盒包括BAG3特异的抗体和试剂，所述试剂包括染色需要的 探针。
[0119]所述BAG3特异的抗体可为小鼠单克隆抗体AC-1、AC-2和AC-3和/或能够识别小 鼠免疫球蛋白的用于检测的酶连接的抗体。
[0120] 尤其地，所述IHC试剂盒有利地允许在来自经受胰腺切除的患者的100%的胰腺 癌组织样品中揭不BAG3蛋白，并在大部分膀胱;癌样品中表达。此外，还可通过IHC在膜岛中 的正常胰腺组织中用检测BAG3的试剂盒揭示BAG3蛋白，而其它正常组织结果为阴性（例 如正常的膀胱）。还可在类风湿性关节炎的组织样品的滑膜成纤维细胞和炎性浸润中观察 到BAG3阳性。
[0121] 受PDAC影响的患者的长期生存非常差：仅约4%的患者在诊断后活5年。实际上， 接受手术（surgicalreception)目前是治愈的唯一选择，但是，仅约20%的患者诊断为可 切除的疾病；此外，这样的患者的子集的大比例（约80%)中，在诊断时已经出现转移过程 (metastatizationprocess),并且实际的远端转移在手术切除后出现。因此，我们需要更 好地理解胰腺癌发展的早期阶段，并且鉴定可允许检测它们的分子。同样，非常需要允许更 好诊断和帮助治疗的选择的标志物。
[0122] 有益地，BAG3IHC试剂盒允许鉴定PDAC患者的预后。观察到，由IHC鉴定的BAG3 表达的强度与患者的存活率相关。因此，它可用于预后及用于做出治疗的选择。
[0123] 本发明的另一方面为用于在生物样品中检测BAG3基因表达的试剂盒，包括一组 扩增引物。优选地，所述扩增引物适于通过实时定量RT-PCR检测。
[0124] 下面描述并通过SEQIDNO. 1至SEQIDN0. 10识别的根据引物组1至5的特异 性引物bag3引物允许通过实时定量PCR检测和定量BAG3的表达。
[0125] 引物组1
[0126]正向：SEQIDNO. 1:AACGGTGACCGCGACCCTTT;
[0127]反向：SEQIDNO. 2:CCTTCCCTAGCAGGCGGCAG
[0128] 引物组2
[0129]正向：SEQIDNO. 3:CCGGCTGGCCCTTCTTCGTG;
[0130]反向：SEQIDNO. 4:CAGCCTAGAGCCCTCCCGGG
[0131] 引物组3
[0132]正向：SEQIDNO. 5:GTCACCTCTGCGGGGCATGC;
[0133]反向：SEQIDNO. 6:GGTGACTGCCCAGGCTGCTC
[0134] 引物组4
[0135]正向：SEQIDNO. 7:CCAGCCTCCCACGGACCTGA;
[0136]反向：SEQIDNO. 8:CTGGTGACTGCCCAGGCTGC
[0137] 引物组5
[0138]正向：SEQIDNO. 9:CAGGAGCAGCACGCCACTCC;
[0139]反向：SEQIDNO. 10 :TGGTCCAACTGGGCCTGGCT。
[0140] 用于在生物样品中检测bag3mRNA的RT-PCR试剂盒允许使bag3基因表达水平与 患者的存活关联，并可用于预后，以及用于治疗的选择。优选地，所述生物样品为组织样品。
[0141] 本发明的再一个方面由能够阻断巨噬细胞活化，并且因此可用于炎症、涉及巨噬 细胞活化的肿瘤或其它疾病的治疗的抗BAG3单克隆抗体、它们的片段、以及相应于BAG3蛋 白质的特定氨基酸序列的肽代表。具体地，参见图3和表I。
[0142]本发明涉及BAG3特异的小鼠单克隆抗体AC-1、AC-2和AC-3或上述被修饰为 F(ab)、F(ab'）2、F(ab)或人源化；或者包括如下序列的肽，作为能够结合和/或封闭可溶 的BAG3效果的用途：
[0143]PEP1 ：DRDPLPPGWEIKIDPQ(SEQIDNO. 11)
[0144]PEP2 ：SSPKSVATEERAAPS(SEQIDNO. 12)
[0145] PEP3 ：DKGKKNAGNAEDPHT(SEQ ID NO. 13)
[0146] PEP4 :NPSSMTDTPGNPAAP(SEQ ID NO. 14)。 实施例
[0147] 实施例1.
[0148]在培养的人原代心肌细朐和大鼠心肌细朐系H9c2中剥夺血清引起的应激
[0149] 已知心肌细胞在提高针对胁迫物的响应中释放保护因子。由于应激诱导的蛋白， 例如Hsp70、Hp27、Hsp90以及其它蛋白虽然发挥了细胞内活性，但是还可响应于应激而被 分泌，在应激条件下分析了由心肌细胞释放的BAG3。为此目的，我们分析了在培养的人原代 心肌细胞和大鼠心肌细胞系J19C2中剥夺血清引起的应激的影响。如图1中显示，我们可在 暴露于血清剥夺16个小时的心肌细胞的上清液中检测到BAG3蛋白质（图1A)。由于细胞 存活在那个时间点不受剥夺血清的影响（结果未显示），我们抛弃了BAG3由于细胞坏死而 释放的假设。因此，我们证实了BAG3是否存在于胞吐囊泡中。实际上，通过由差速离心过 程分离细胞外囊泡（16)，我们发现它们包含BAG3蛋白质（图1B)。
[0150] 为进一步证实可溶形式的BAG3的存在，我们研究了它在受慢性心力衰竭（CHF)影 响的患者的两个血清中的存在。通过蛋白印迹分析，我们可鉴定由抗BAG3抗体识别的条 带。我们切除所述条带，并使它经质谱，证实它的身份（图1C)。该证据证实，可检测到胞外 形式的蛋白质。我们不能在来自健康供体的血清中检测到所述蛋白（图1C)。在整个BAG3 蛋白序列上由质谱识别和匹配的肽由粗体表示：
【权利要求】
1. 用于病理状态的诊断用途的抗BAG-3抗体。
2. 根据权利要求1所述的用途的抗BAG-3抗体，其中，所述抗BAG-3抗体结合到可溶的 BAG3以形成免疫复合物。
3. 根据权利要求1或2的任一项所述的用途的抗BAG-3抗体，其中，所述诊断是体外的 或离体的。
4. 根据权利要求1或3的任一项所述的用途的抗BAG-3抗体，其中，所述诊断的接受者 为哺乳动物，优选人类。
5. 根据权利要求1或4的任一项所述的用途的抗BAG-3抗体，其中，所述病理状态选 自：心脏病，癌症，糖尿病，皮肤、神经、骨、血管和结缔组织的炎症和炎症相关的疾病。
6. 根据权利要求5所述的用途的抗BAG-3抗体，其中，所述心脏病选自：心绞痛、梗塞 前心绞痛、心肌梗塞、心力衰竭、局部缺血、急性冠心病、急性心力衰竭、慢性心力衰竭和医 源性心脏病。
7. 根据权利要求5所述的用途的抗BAG-3抗体，其中，所述癌症选自：胰腺癌、膀胱癌 和前列腺癌。
8. 检测生物样品中抗BAG3抗体或结合到可溶的BAG3以形成免疫复合物的抗BAG3抗 体的方法，包括以下步骤： a. 获得生物样品，所述生物样品由血清、血浆、尿或唾液组成， b. 确定所述生物样品中抗BAG3抗体或BAG3缔合的抗体的存在。
9. 根据权利要求8所述的方法，还包括以下步骤： c. 比较从生物样品获得的值与参考值或从健康供体获得的值。
10. 根据权利要求6或9的任一项所述的方法，其中，所述确定步骤b通过ELISA试验 进行。
11. 根据权利要求6至10的任一项所述的方法，其中，所述血清、血浆、尿或唾液来自哺 乳动物，优选人类。
12. 根据权利要求6至11的任一项所述的方法，其中，所述抗BAG3抗体或所述免疫复 合物的存在与病理状态相关。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中，所述病理状态选自：心脏病，癌症，皮肤、神经、 骨、血管和结缔组织的炎症和炎症相关的疾病。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述心脏病选自：心绞痛、梗塞前心绞痛、心肌 梗塞、心力衰竭、急性冠心病、局部缺血、急性心力衰竭、慢性心力衰竭或医源性心脏病。
15. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述癌症选自：胰腺癌、膀胱癌和前列腺癌。 16. ELISA试剂盒用于检测生物样品中抗BAG3抗体或结合到可溶的BAG3以形成免疫复 合物的抗BAG3抗体的用途，所述ELISA试剂盒包括用于捕获可溶的BAG3的BAG3重组蛋白 或BAG3特异的小鼠单克隆抗体AC-1、AC-2、AC-3、AC-4和AC-5以及能够识别人免疫球蛋 白的抗体。
17. 根据权利要求16所述的用途，其中，所述生物样品为血清、血浆、尿或唾液样品。
18. 根据权利要求17所述的用途，其中，所述血清、血浆、尿或唾液样品来自哺乳动物， 优选人类。
【文档编号】G01N33/68GK104507965SQ201380032138
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年6月11日 优先权日:2012年6月19日
【发明者】玛丽亚·卡特里纳·图尔科 申请人:比奥尤尼沃萨有限责任公司