专利名称：肝纤维化相关血清标志物检测蛋白芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种同时进行多种肝纤维化血清标志物的检测蛋白芯片及其制备和使用方法。
背景技术：
肝纤维化是由于肝细胞外基质的形成和降解的平衡失调导致肝内纤维组织的积累，肝内原有的纤维组织的塌陷和凝缩的结果，肝纤维化可以由多种因素引起。目前，诊断肝纤维化最可靠的方法仍是肝穿刺活检。但该方法有一定危险性，且需反复多次肝穿取材，不易为病人接受，在实际应用中有相当大的局限性。
近年来，临床上将肝纤维化时释放于外周血中的某些代谢产物浓度作为反映肝纤维化的非侵入性检测指标(程书权，1999；Rosenberg WM，2004；Tsukamoto T，2004；Sakugawa，2005)。但由于肝纤维化时细胞外基质成分繁多且其形成机制复杂，因此，必须合理地联合多种成分测定才有临床诊断意义。临床研究表明，对III型前胶原(PIIIP)(程书权，1999；胡云良，1997；刘仁才，1999；Tsukamoto T，2004；Rosenberg WM，2004)；IV型胶原及其片段(程书权，1999；胡云良，1997；刘仁才，1999；Sakugawa，2005；Tsukamoto T，2004)；透明质酸(程书权，1999；胡云良，1997；刘仁才，1999；Rosenberg WM，2004)；基质金属蛋白酶抑制物(Rosenberg WM，2004)；层粘连蛋白(LN)(程书权，1999；胡云良，1997；刘仁才，1999)；r-干扰素(IFN-r)；白细胞介素-2(IL-2)；白细胞介素-4(IL-4)；肿瘤坏死因子T(NF-a)；细胞间粘附分子-1(ICAM-1)；转化生长因子β(TGFβ)；血小板衍化生长因子(PDGF)等多种血清标志物的检测可以反映不同临床阶段的肝损害程度和肝纤维化的程度，较常规肝功能指标敏感，是判断慢性肝病患者肝硬变发展趋势的良好指标[崔东来，2000]。
对肝纤维化血清标志物的检测主要使用放免、酶免等免疫检测法，但有对血清标志物的检测存在时间长、前处理要求高、单个试剂盒每次测试仅能获得一个标志物的浓度等局限。
蛋白芯片具有使用标本量少、灵敏度高、线形好、操作简单方便等优点，在生物医药领域有广阔的应用空间。已用于丙型肝炎、肿瘤标志物和过敏原等的检测。本发明建立了可同时对多种肝纤维化血清标志物进行快速灵敏检测的蛋白芯片检测系统。
发明内容
本发明涉及肝纤维化相关血清标志物检测蛋白芯片及其制备和使用方法。
用于制作蛋白芯片的载体可为为经醛基、氨基、多聚赖氨酸等修饰的玻片，NC膜或硅片。
本纤维化相关血清标志物检测蛋白芯片由2至多个微阵列组成。每个微阵列包括肝纤维化相关血清标志物的捕获抗体、阳性对照和阴性对照(图1)。
本纤维化相关血清标志物检测蛋白芯片使用双抗体夹心法来实施对血清标志物的检测(图2)。
本发明所检测的纤维化相关血清标志物为III型前胶原(PIIIP)；IV型胶原(IV-C)；透明质酸(HA)；层粘连蛋白(LN)；r-干扰素(IFN-r)；白细胞介素-2(IL-2)；白细胞介素-4(IL-4)；肿瘤坏死因子(TNF-α)；细胞间粘附分子-1(ICAM-1)；转化生长因子β(TGFβ)等10种血清标志物。
本发明涉及的捕获抗体为III型前胶原(PIIIP)；IV型胶原(IV-C)；透明质酸(HA)；层粘连蛋白(LN)；r-干扰素(IFN-r)；白细胞介素-2(IL-2)；白细胞介素-4(IL-4)；肿瘤坏死因子(TNF-α)；细胞间粘附分子-1(ICAM-1)；转化生长因子β(TGFβ)等10种血清标志物的单克隆抗体。
本发明涉及的检测抗体为上述10种血清标志物的单克隆抗体，但与捕获抗体具有不同的抗原表位，并且已被生物素或荧光素标记。
下面结合实例对本发明作详细介绍。
图1蛋白芯片外观及阵列示意图。每张芯片可有多到12个微阵列。
图2芯片检测原理示意图。
具体实施例方式
实施实例一1.捕获抗体的稀释
将捕获抗体，即III型前胶原(PIIIP)；IV型胶原(IV-C)；透明质酸(HA)；层粘连蛋白(LN)；r-干扰素(IFN-r)；白细胞介素-2(IL-2)；白细胞介素-4(IL-4)；肿瘤坏死因子(TNF-α)；细胞间粘附分子-1(ICAM-1)；转化生长因子β(TGFβ)等10种血清标志物的单克隆抗体，用抗体稀释液(30％甘油+70％PBS)稀释到100-300μg/mL。
2.芯片的制备用特定的微阵列点样仪将捕获抗体点到玻片或NC膜上，同时将200μg/mL的BSA点到芯片上作为阴性对照，200μg/mL的生物素标记的BSA点到芯片上作为阳性对照，制成芯片(图1)。37℃过夜后，用0.01M PBS-Tween洗2次，然后用封闭液封闭3小时，0.01M PBS-Tween冲洗，凉干，4℃保存备用。
3.血清标志物的检测将待检血清用PBS稀释(一般2-10倍)，取约300μL的体积滴加到蛋白芯片阵列矩阵，于37℃孵化2小时，0.01M PBS-Tween洗2次。滴加约300μL的10种检测抗体的混合液到每一阵列矩阵，于37℃孵化2小时，0.01M PBS-Tween洗2次。滴加100μL的Cy-3标记的亲和素，室温孵化半小时，0.01M PBS-Tween洗2次。再用纯净水洗涤3次，晾干后扫描。用扫描仪自带的图象分析软件对扫描的结果进行定量分析。
权利要求
1.一种同时检测多种肝纤维化血清标志物的蛋白芯片，其特征在于通过固定在玻片、硅片等载体上的捕获抗体捕获样品血清中的肝纤维化标志物，被捕获的肝纤维化血清标志物与标记的检测抗体结合，经信号放大，从而达到检测的目的。
2.根据权利要求1所述的载体为经醛基、氨基、多聚赖氨酸等修饰的玻片，NC膜或硅片。
3.根据权利要求1所述的多种肝纤维化血清标志物包括III型前胶原(PIIIP)；IV型胶原(IV-C)；透明质酸(HA)；层粘连蛋白(LN)；r-干扰素(IFN-r)；白细胞介素-2(IL-2)；白细胞介素-4(IL-4)；肿瘤坏死因子(TNF-α)；细胞间粘附分子-1(ICAM-1)；转化生长因子β(TGFβ)。
4.根据权利要求1所述的捕获抗体分别为权利要求3所述10种肝纤维化血清标志物的单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的检测抗体为与权利要求3所述的单克隆抗体具有不同的抗原表位的单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的标记为生物素或荧光素标记。
7.根据权利要求1所述的信号放大为生物素-亲和素放大系统。
全文摘要
本发明公开了一种同时对多种肝纤维化血清标志物进行检测的蛋白芯片及其制备和使用方法，其特征在于通过固定在玻片、硅片等载体上的捕获抗体捕获样品血清中的肝纤维化标志物，被捕获的肝纤维化血清标志物与标记的检测抗体结合，经信号放大，从而达到检测的目的。该蛋白芯片具有使用样品量，灵敏、快速等优点，可用于临床上多种肝纤维化血清标志物的检测。
文档编号G01N33/532GK1841068SQ20051003397
公开日2006年10月4日 申请日期2005年3月31日 优先权日2005年3月31日
发明者李泽松, 张文, 耿永尧 申请人:深圳益生堂生物企业有限公司