专利名称：一种肿瘤标志物－血清蛋白指纹图谱的检测方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种肿瘤标志物-血清蛋白指纹图谱的检测方法。具体涉及血清蛋白质的表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱测定和特异性蛋白峰比较识别的方法。
背景技术：
恶性肿瘤是一种多基因参与的复杂疾病。其基因表达分析涉及转录组及蛋白质组学方法。由于蛋白质的表达或功能从转录到翻译间有多点调控，转录的mRNA丰度与翻译的蛋白质数量间相关不明显，核酸的分析方法无法实时准确地反映肿瘤发生过程中蛋白质数量与种类地变化，因此用蛋白质组学方法从整体上研究肿瘤地发病机制，寻找肿瘤诊断和预后的特异性标记以及药物治疗的靶标已成为近期研究的热点(Srinivas PR，Kramer BS，Srivastava S.Trends in biomarkerresearch for cancer detection[J].Lancet Oncol，2001，2(11)698-704；Annika Lindblom，Snnelie lijegren.Tumor markers in malignancies.BMJ[J].2000，320424-427)。肿瘤标志物的定义并不明确，它通常是指肿瘤组织自身特有的可反映肿瘤存在和生长的物质，可在肿瘤患者组织、体液和排泄物中检出。现已发现的肿瘤标志物包括肿瘤特异性抗原及相关抗原、激素类受体、酶类、癌基因、抗癌基因及其产物等。理想的肿瘤标志物应具备1)唯肿瘤细胞所特有，不存在于正常或非癌组织中；2)与肿瘤的大小、分期及治疗预后相关；3)采用高灵敏的方法可定性或定量地检测。完全符合这些条件的肿瘤标志物至今尚未发现。
肝癌已成为目前我国癌症病人死亡第二位的原因，全世界45％的原发性肝癌发生在我国。目前仍以外科手术为首选和主要治疗方案。术后总体5年生存率只有62.9％，大肝癌术后5年生存率仅为34.6％。HCC常表现为早期的血管侵犯，包膜侵犯和肝内、肝外的转移。尽管采取了免疫治疗、预防性TAE、中药治疗等手段来预防肝癌切除术后的转移复发，但总体术后5年复发率仍高达61.5％，即使是小肝癌术后5年复发率也高达45.5％。目前临床主要依靠定期复查AFP、异常凝血酶原、岩藻糖基转移酶和B超来发现术后的转移复发，但应用于肝癌复发转移的预测和判断仍有相当的困难。判断肿瘤转移复发的危险性和早期诊断转移的发生，并采取有效的手段预防肿瘤转移的发生，诱发肿瘤转移休眠状态或延迟转移的发生，成为当前肝癌研究的主要课题之一。肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)极易侵犯门静脉形成癌栓(portal vein tumor thrombus，PVTT)，导致肿瘤细胞的肝内播散和转移，因此PVTT是影响和决定肝癌患者术后转移复发状态的极重要的因素。
蛋白质组学研究涉及蛋白质表达模式研究和功能模式研究，目前以前者研究较为集中。蛋白质表达模式研究的支撑技术主要有蛋白质的分离、鉴定技术和生物信息学。蛋白质的鉴定技术主要为质谱法(MS)，即利用样品离子化后，离子间的质荷比(m/z)的差异来分析确定样品的分子质量。现最常用的有两种，即电喷雾质谱(ESI-MS)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。生物技术的发展对新的肿瘤标志物的发现起了非常的作用，2D电泳结合MS、高压液相分析(HPLC)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)，LC-MS-MS等技术使人们可以从蛋白质水平分析潜在的肿瘤标志物，从而使新标志物的发现提升到一个更高的水平(Wei WZ.Tumor markersdiscovery topractice[J].DDT 2003，8(10)441-44316；Emanuel FP，Ali MA，Ben AH，etal.Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer[J].Lancet，2002，359(16)572-577；Julia DW，Kelley CM，Cloud PP，et al.Newapproaches to proteomic analysis of breast cancer[J].Proteomics，2001，1，1205-1215)
发明内容
本发明的目的是针对目前肝癌转移复发的血清学检测技术的不足，提供一种肿瘤标志物-血清蛋白指纹图谱的检测方法。
本发明应用血清蛋白质组学的方法测定血清蛋白质指纹图谱的特异性，主要技术方案为表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)，包括血清样本的采集标准，化学芯片的选择、处理和阅读，测定条件的优化；PVTT判别模式及验证。
本方法经血清样品检测的重复性分析；比较PVTT组和无PVTT组显示有16个蛋白峰有显著差异；获得的血清蛋白质指纹图谱中发现有判别意义的蛋白质峰；通过建立的决策树模型可以显著地区分两组患者，该模型的敏感性为75.8％(25/33)，特异性为82.3％(51/62)。本发明方法进一步可用于无创鉴别和预测肿瘤的转移。还可用于原发性肝癌病人术后肝癌转移复发倾向的预测及筛选。
图1，部分差异蛋白峰在HCC伴PVTT组和HCC不伴PVTT组中表达情况，其中m/z为3478(B)在HCC伴PVTT组上调，m/z为2745(A)、8773(C)、8901(D)在HCC伴PVTT组下调，横坐标为m/z(分子量)，纵坐标为蛋白质的丰度，PVTT(+)为HCC伴PVTT，PVTT(-)为HCC不伴PVTT图2，区分肝癌转移的血清蛋白质图谱的判别模式(PVTT决策树模型)具体实施方式
实施例1一、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)实验1.血清样本的采集标准患者均无药物治疗，空腹抽取5ml新鲜血，常温下放置3小时，待自然凝固后，4℃3000rpm离心30min，取上层血清分装后立刻置-70℃冰箱保存。
实验所用血清均仅一次冻融。表观无融血、无杂质，纯清透明。
2.芯片选择Ciphergen公司的WCX2芯片3.样本处理取出-70℃下血清溶解后，4℃10000rpm离心2min，取3ul血清加入6ul U9(9M urea，2％CHAPS，50mM Tris-Hcl，1％DTT，pH 9.0)裂解液混合后，冰浴振荡(MS1 Minishaker)30min，加入108ul WCX2缓冲液(50mMNaAc，pH 4.0)使血清稀释约40倍；WCX2芯片插入生物处理器(Bioprocessor)后每孔加入200ul缓冲液室温振荡500rpm，5min×2预处理；弃缓冲液后每孔分别加入100ul不同稀释后样品，室温振荡500rpm，1h；弃样品后芯片每孔加入200ul缓冲液室温振荡500prm，5min×2；弃缓冲液加入200ul去离子水(HPLC grade)即刻漂洗，取出芯片；待表面干燥后每孔滴加1ul SPA(Sinapinic Acid，50％ACN，0.5％TFA)，风干后，PBS-II(CiphergenBiosystems)上机阅读。
4.阅读条件(1)选用激光能量(Intensity)为185，(2)敏感性(Sensitivity)为8。
(3)每孔都实行20次激光轰击(4)测定范围蛋白质m/z(质荷比)在1500~30000Da(5)all-in-1肽谱进行标准化。
5.分析条件(1)BioMarker Wizard软件生成蛋白质峰并进行归类比较，(2)由Biomarker Patterns Software(BPS)实现不同组间的差异的决策树。
二.血清样品检测的重复性分析(SELDI-TOF-MS/WCX2蛋白芯片)利用同一份HCC血清样品，选择WCX2芯片的8个不在同一芯片的位点，进行SELDI-TOF-MS检测，得到的蛋白质谱中随机选择8个蛋白质峰，测得变异系数(CV)值为18.5％。
三，建立判别模式包含通过血清蛋白指纹谱比较区分肝癌转移的、有意义的血清差异蛋白质，和通过具有肝癌转移判别意义的血清蛋白质建立决策树模型。
区分肝癌(HCC)转移的、有意义的血清蛋白质1.HCC转移(以PVTT为基准)的血清蛋白指纹谱比较在m/z 1100～30000Da范围内，共检测出100个蛋白峰，比较PVTT组和无PVTT组有16个蛋白峰有显著差异(P＜0.01)(表1)，m/z为3478、1314、1744、1725、2022和3380在PVTT组中上调，而m/z为8901、9353、9415、8773、2766、2745、8697、7773、8569和1373在PVTT组下调(图1)。
2.获得的血清蛋白质指纹图谱中有判别意义的蛋白质峰表1是16个差异蛋白在PVTT(+)和PVTT(-)组中强度的比较。
表1
其中P＜0.01，*为参加建模型蛋白质建立PVTT决策树模型的判别方法采用Biomarker Patterns Software(BPS)完成PVTT的判断模型。
95例HCC患者进入模型，BPS处理数据，当满足0.439×(M2766)-0.101×(M3478)+0.605×(M8773)+0.657×(M8900)＜＝1.16232且M2745＜＝10.1457时进入节点1，为23例伴PVTT的HCC和1例不伴PVTT的HCC；当满足0.439×(M2766)-0.101×(M3478)+0.605×(M8773)+0.657×(M8900)＜＝1.16232且M2745＞10.1457时进入节点2，为3例不伴PVTT的HCC；当满足0.439×(M2766)-0.101×(M3478)+0.605×(M8773)+0.657×(M8900)＞1.16232且-0.0606×(M2745)+0.998×(M3478)＜＝0.795901进入节点3，为46例不伴PVTT的HCC和3例伴PVTT的HCC；当满足0.439×(M2766)-0.101×(M3478)+0.605×(M8773)+0.657×(M8900)＞1.16232且-0.0606×(M2745)+0.998×(M3478)＞0.795901和-0.996×(M2022)-0.0908×(M9415)＜＝-0.307601时进入节点4，为7例伴PVTT的HCC和1例不伴PVTT的HCC；当满足0.439×(M2766)-0.101×(M3478)+0.605×(M8773)+0.657×(M8900)＞1.16232且-0.0606×(M2745)+0.998×(M3478)＞0.795901和-0.996×(M2022)-0.0908×(M9415)＞-0.307601时，为11例不伴PVTT的HCC。
通过对原始图谱的初步判断，选择m/z为3478、2022、8901、9415、8773、2766、和2745建立的决策树模型，可以显著地区分两组患者(下图)。该模型的敏感性为75.8％(25/33)，特异性为82.3％(51/62)。
权利要求
1.一种肿瘤标志物-血清蛋白指纹图谱的检测方法，其特征是采用表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术，包括血清样本的采集标准，化学芯片的选择、处理和阅读，测定条件的优化；建立判别模式及验证步骤，所述的芯片阅读步骤，其参数设置为，阅读条件a.选用激光能量(Intensity)为185，b.敏感性(Sensitivity)为8，c.每孔都实行20次激光轰击，d.测定范围蛋白质m/z(质荷比)在1500~30000Da，e.all-in-1肽谱进行标准化，所述的建立判别模式步骤包括通过血清蛋白指纹谱比较区分肝癌转移的、有意义的血清差异蛋白质，和通过具有肝癌转移判别意义的血清蛋白质建立决策树模型。
2.按权利要求1所述的肿瘤标志物-血清蛋白指纹图谱的检测方法，其特征是选择的化学芯片是WCX2蛋白芯片。
3.按权利要求1所述的肿瘤标志物-血清蛋白指纹图谱的检测方法，其特征是所述测定条件其中分析条件为a.BioMarker Wizard软件生成蛋白质峰并进行归类比较，b.由Biomarker Patterns Software(BPS)来实现不同组间的差异的决策树。
4.按权利要求1所述的肿瘤标志物-血清蛋白指纹图谱的检测方法，其中建立判别模式步骤所述通过血清蛋白指纹谱比较区分肝癌转移的、有意义的血清差异蛋白质为M/Z 9353、*9415、*8901、*8773、8697、8569、7773、*3478、3380、*2766、*2745、*2022、1744、1725、1374、1314。
5.按权利要求1所述的肿瘤标志物-血清蛋白指纹图谱的检测方法，其中建立判别模式步骤的通过具有肝癌转移判别意义的血清蛋白质建立决策树模型，所述的具有转移判别意义的血清蛋白质包括M/Z*9415、*8901、*8773、*3478、*2766、*2745和*2022。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种肿瘤标志物－血清蛋白指纹图谱的检测方法。具体涉及血清蛋白质的表面增强激光解析离子化－飞行时间质谱测定和特异性蛋白峰比较识别的方法，包括血清样本的采集标准，化学芯片的选择、处理和阅读，测定条件的优化；PVTT判别模式及验证。经血清样品检测重复性分析；比较PVTT和无PVTT组显示有显著差异蛋白峰；获得的血清蛋白质指纹图谱中发现有判别意义的蛋白质峰；通过建立的决策树模型能显著地区分两组患者，敏感性为75.8％(25/33)，特异性为82.3％(51/62)。本发明进一步可用于无创鉴别和预测肿瘤的转移。还可用于原发性肝癌病人术后肝癌转移复发倾向的预测及筛选。
文档编号G01N33/72GK1851455SQ20051002534
公开日2006年10月25日 申请日期2005年4月22日 优先权日2005年4月22日
发明者刘银坤, 黄成 , 崔杰锋, 樊嘉, 周俭, 汤钊猷 申请人:复旦大学附属中山医院