专利名称：血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器，具体地，涉及一种血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器，属于医学检测方法与磁性传感技术领域。
背景技术：
恶性肿瘤是当今威胁人类健康和生命的主要疾病之一，且发病率有逐年上升的趋势。目前临床主要的肿瘤检测手段包括[I]实验室检查主要包括血、尿、大便的常规检查、生化及免疫检查、病理学检查
坐寸ο[2]放射学检查主要包括X光透视、X光摄片、X光造影检查、CT扫描、核磁共振成像等。[3]放射性核素检查即同位素检查，包括功能测定检查、扫描及伽玛照射检查、放射免疫分析等。[4]超声波检查包括A型、B型超声波检查。[5]内窥镜检查包括各种硬性或光学纤维镜。在肿瘤的研究和临床实践中，早期发现、早期诊断、早期治疗是关键。目前常规的影像方法如X线、CT、核磁共振、B超等仅能发现O. 5cm以上的肿块，这时部分肿瘤已经处于中晚期，有的肿瘤已经发生了转移，多数病人已经丧失了最佳的治疗时机。血清肿瘤标志物在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效等方面都具有较大的实用价值。血清肿瘤标志物检测已经成为早期发现肿瘤的方法之一，目前已经发展了多种血清肿瘤标志物检测技术并不断地应用于临床如免疫放射分析法、酶标记免疫分析技术、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、液体芯片检测技术等，这些方法各有其优点，如液体芯片一次能检查出多种肿瘤标志物，和多次检测相比降低了成本。但这些方法的不足之处在于缺乏灵活性，单项指标敏感性低、特异性较差。在检测速度、准确率和检测费用方面均存在缺陷，因此利用多学科交叉的优势研制新型肿瘤标志物检测的生物传感器技术显得尤为重要。生物传感器是利用生物活性材料(如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等)与物理化学换能器(如电化学、光学、机械、电、磁等)有机结合构成的一种生物信息检测分析工具。由于生物传感器在医疗保健、疾病诊断、食品安全检测等具有广泛的用途，受到了世界各国科学家的深入研究和大力研发；然而仍存在一些因素限制了生物传感器的大规模应用和推广，如传统生物传感器的分析操作步骤太多、分析周期长、价格昂贵、体积大、昂贵的光学检测设备及需要训练有素的专业人员才能完成等。近年来，由于免疫磁珠技术的不断进展和传感器技术的发展，科学家们提出了将磁传感器并结合磁性标签研制用于生物学、医学、遗传学、毒物学等生物信息探测的新一代生物传感器。利用磁传感器并结合磁性标签用于探测生物分子的理念最早是由美国海军实验室的Baselt等[Baselt D. R. , LeeG. U. , Natesan M. , Metzger S. W., Sheehan P. E. , Colton R. , A biosensor based onmagnetoresistancetechnology, Biosens. Bioelectr. 17 (1998) 731.]于 1998 年提出的，由此开启了磁生物传感器研究的热潮。目前已报道的用于磁性纳米粒子(磁珠)检测的磁传感器，主要有电磁感应式传感器、超导量子干涉器、磁通门传感器、磁阻传感器、霍尔传感器、巨磁电阻传感器和巨磁阻抗传感器等。磁通门传感器作为一种弱磁场检测器件，近年来在卫星发射、运载火箭、航天器等更是作为姿态敏感器而被广泛使用，然而传统的磁通门传感器具有体积大、高重量、功耗大及长期稳定性差等缺点。90年代以来，微机电系统(MEMS)技术的飞速发展，为微型化磁通门传感器的研制提供了一条有效可靠的途径。采用MEMS技术研制微型化、集成化的磁通门传感器成为国内外研究开发的热点。与传统的磁通门传感器相比较，MEMS磁通门传感器结构紧凑，体积小、质量轻，安装调试简单，不怕震动撞击，受环境温度变化影响小，在磁场检测与生物医学检测方面展示出广阔的应用前景。经对现有技术的文献检索发现，Dieckhoff等(Diechhoff J. , SchillingM. , Ludwig F.)在《Appl.Phys.Lett.》(美国应用物理快报)《Vol. 99, pp. 112501, 2011》提出使用磁通门传感器来探测磁性纳米粒子，证明了磁通门传感器在生物医学检测领域的可行性，但该研究工作只是得到了磁通门传感器对Fe304磁性纳米粒子的响应，没有实现对 生物标志物的检测。随着微机电系统(MEMS)技术的发展,利用MEMS技术制备的微流控芯片已应用于生物与医学检测领域，而MEMS技术同样可用来制造微型化、集成化的磁通门传感器。将生物信息的固定与微型化磁通门传感器相结合构建新型血清肿瘤标志物检测系统，利用磁性纳米粒子标签对血清肿瘤标志物进行检测，具有重要的研究意义和临床价值。通过文献和专利检索，没有发现关于将微型化磁通门传感器用于血清肿瘤标志物检测的相关研究成果O
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器。该生物传感器采用MEMS加工工艺制作，能够与配套的检测电路制作在一起，实现整个系统的小型化、低成本，并使检测系统具有高灵敏度和响应速度，且易于大批量生产。该生物传感器的检测灵敏度可以检测血清肿瘤标志物高达lng/ml的抗原。为了实现上述目的，本发明所述血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器包括微型化磁通门传感器、生物芯片、施加轴向磁场的螺线管线圈、以及与微型化磁通门传感器连接的信号采集系统，其中所述生物芯片位于微型化磁通门传感器的敏感轴上，所述生物芯片由位于玻璃基片上的Au膜、位于Au膜上的生物敏感膜、位于生物敏感膜上的磁性标签组成。优选的，所述的Au膜为派射的Cr/Au薄膜,其厚度为100-500nm,用于修饰自组装膜。优选的，所述的生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC+NHS活化形成，生物敏感膜可以连接各种单克隆抗体，单克隆抗体可以和被检测的抗原结合。优选的，所述的磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠。可以和经生物素修饰的单克隆抗体或多克隆抗体相结合。生物素修饰的单克隆抗体或多克隆抗体可以和被检测的抗原结合。
优选的，所述施加轴向磁场的螺线管线圈，该螺线管线圈为一绕制在PVC上的螺线管线圈，通过外接的直流电源产生轴向均匀磁场；微型化磁通门传感器的敏感轴放置在螺线管线圈的轴向位置上，生物芯片与微型化磁通门传感器的敏感轴位于同一平面且紧密相连。所述的信号采集系统能够实现在激励线圈中施加一使磁芯处于饱和状态的交流电流以及对接收线圈的输出信号经滤波后得到的二次谐波信号进行检测。二次谐波信号大小与外部磁场成正比，因此可测量磁性标签产生的磁场大小与检测抗原之间的关系。本发明提供的生物传感器，其检测抗原的原理是采用双抗夹心法。采用自组装膜技术固定单克隆抗体，单克隆抗体与抗原结合，带有链酶亲和素的磁性标签与生物素化的多克隆抗体结合，由于抗原-抗体的免疫反应，磁性标签被标记到Au膜的表面上。一旦有极微量的被检测生物分子(抗原)存在时，在外磁场作用下，磁性标签产生的弥散磁场将导致传感器的电压信号变化，从而实现对相应生物分子的高灵敏度检测。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果(I)磁传感器的制备技术可与半导体的CMOS技术兼容，从而可实现集成磁传感器阵列，成本低、价格便宜，易于批量生产；(2)信号可通过集成的CMOS电路得到处理，直接将生物信息转换为电信号，可实现即时分析，并具有很高的检测灵敏度；(3)生物样品本身不带磁性，能提供一个很低噪声的磁测量环境，相对于突光分子、放射性同位元素、酶等标签，磁性标签非常稳定；(4)在单一化验中，阵列传感器可实现对多目标分析物的同时检测，具有快速、高灵敏探测的优势。(5)本发明中的血清肿瘤标志物检测系统具有检测速度快、可重复使用、无特殊环境和存放要求、体积小、灵敏度高等优点；不需要依赖于操作人员的生物学医学经验以及庞杂、昂贵的荧光检测设备，就可实现特定的生化分析或疾病诊断，这将有利于实现便携式、成本低廉、快速诊断的生物医学疾病检测系统，必将产生巨大的经济效益和社会价值。
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显图I为本发明的结构示意图。图2为沿图I所示A-A剖面图。图3为沿图I所示B-B剖面图。图4为本发明的生物芯片原理图。 图中I为玻璃基片，2为激励线圈，3为接收线圈，4为磁芯，5为引脚,6为聚酸亚胺绝缘材料，7为激励线圈的底层线圈，8为激励线圈的连接导体，9为激励线圈的顶层线圈，10为接收线圈的底层线圈，11为接收线圈的连接导体，12为接收线圈的顶层线圈。13为玻璃基片，14为Au膜，15为自组装膜，16为EDC+NHS活化层，17为单克隆抗体，18为抗原，19为单克隆抗体或多克隆抗体，20为磁珠,21为生物素,22为链酶亲和素。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。本实施例提供一种血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器。该生物传感器包括微型化磁通门传感器、生物芯片、施加轴向磁场的螺线管线圈、以及与微型化磁通门传感器连接的信号采集系统。所述微型化磁通门传感器位于玻璃基片上，可以采用现有技术实现，比如专利申请号为200910046099.8的中国专利中记载的传感器，当然也可以采用其他能实现本发明功能的微型化磁通门传感器。以下申请号为200910046099. 8记载的传感器结构来说明本发明的实施例。
如图1-3所示，本实施例中，微型化磁通门传感器包括玻璃基片I、激励线圈2、接收线圈3、磁芯4、引脚5、聚酰亚胺绝缘材料6，闭合的矩形磁芯4上对称绕制两组相连的三维螺线管激励线圈2，与激励线圈2垂直绕制一组三维螺线管接收线圈3 ;激励线圈2位于玻璃基片I上，由底层线圈7、顶层线圈9通过连接导体8连接形成，激励线圈2的两端连接引脚；接收线圈3位于玻璃基片I上，由底层线圈10、顶层线圈12通过连接导体11连接形成，接收线圈3的两端连接引脚5，激励线圈2和接收线圈3均通过聚酰亚胺绝缘材料6与磁芯4绝缘隔离。磁芯4、激励线圈2和接收线圈3均由聚酰亚胺绝缘、支撑并完全包覆固定为一个整体，与空气隔离，传感器表面仅露出引脚5。磁芯4可以为NiFe薄膜、非晶和纳米晶软磁带材材料，并采用MEMS工艺进行加工。工作时,在激励线圈2中通一交流电流使磁芯4处于饱和状态,没有外部磁场时，接收线圈3没有任何信号输出；当有外部磁场存在时，接收线圈3会有输出信号，信号为偶次谐波，经滤波后可得到二次谐波信号。二次谐波信号大小与外部磁场成正比，因此可测量外部磁场大小和方向。如图4所示，本实施例中，生物芯片由位于玻璃基片13上的Au膜14、位于Au膜14上的生物敏感膜、位于生物敏感膜上的磁性标签组成。本实施例中，Au膜14为溅射的Cr/Au薄膜，其厚度为100_500nm，用于修饰自组装膜。本实施例中，生物敏感膜采用自组装膜15，自组装膜15为11-巯基i^一烷酸，然后经EDC+NHS活化形成活化层16，活化层16可以连接各种单克隆抗体17，单克隆抗体17可以和被检测的抗原结合。本实施例中，磁性标签为链酶亲和素22修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠20。可以和经生物素21修饰的单克隆抗体或多克隆抗体19相结合。生物素21修饰的单克隆抗体或多克隆抗体19可以和被检测的抗原18结合。 本实施例中，施加轴向磁场的螺线管线圈为一绕制在PVC上的螺线管线圈，其直径和长度均为10cm，通过外接的直流电源可以产生O-IOOOe的轴向均匀磁场；微型化磁通门传感器的敏感轴放置在螺线管线圈的轴向位置上，生物芯片与微型化磁通门传感器的敏感轴位于同一平面且紧密相连。
本实施例中，信号米集系统包含信号发生器、功率放大器、滤波器、锁相放大器、波器等，都是一些通用的仪器设备或电路，可以采用现有技术实现，也可以根据需要购买或自行设计，不再详述。本实施例上述的生物传感器制作方法如下(I)制作微型化磁通门传感器详细方法可以采用现有技术实现，比如已有专利号为200910046101. I的发明专利。(2)生物芯片的制作方法如下 在玻璃基片上溅射Cr/Au薄膜，甩光刻胶、烘干、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使Au膜暴露在外面。· Au膜上生物敏感膜的制备。生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11巯基i^一烷酸，然后经EDC+NHS活化形成的。 肿瘤标志物单克隆抗体的固定。将适当浓度的肿瘤标志物单克隆抗体溶液滴入Au膜上面，在蒸汽浴37°C下培育40分钟；然后用PBS溶液清洗、BSA溶液封闭，最后用PBS溶液清洗、室温干燥。 抗原点样。将适当浓度的抗原溶液滴入Au膜表面，在蒸汽浴37°C下培育40分钟，然后用PBS溶液清洗,室温下干燥。 生物素化抗体的固定。将适当浓度的生物素化抗体溶液滴入Au膜表面，室温22°C培育,然后用PBS溶液清洗,室温下干燥。 磁性标签固定。磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠。将适当浓度的磁性标签滴入Au膜表面，室温下培育，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。本发明提供的生物传感器，其检测抗原的原理是采用双抗夹心法。采用自组装膜技术固定单克隆抗体，单克隆抗体与抗原结合，带有链酶亲和素的磁性标签与生物素化的多克隆抗体结合，由于抗原-抗体的免疫反应，磁性标签被标记到Au膜的表面上。一旦有极微量的被检测生物分子(抗原)存在时，在外磁场作用下，磁性标签产生的弥散磁场将导致传感器的电压信号变化，从而实现对相应生物分子的高灵敏度检测。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
权利要求
1.一种血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器，其特征在于包括位于玻璃基片上的微型化磁通门传感器、生物芯片、施加轴向磁场的螺线管线圈以及与微型化磁通门传感器连接的信号采集系统；其中所述生物芯片位于微型化磁通门传感器的敏感轴上，由位于玻璃基片上的Au膜、Au膜上的生物敏感膜、生物敏感膜上的磁性标签组成的；所述生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜。
2.根据权利要求I所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器，其特征在于，所述Au膜为溅射的Cr/Au薄膜，用于修饰自组装膜。
3.根据权利要求2所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器，其特征在于，所述Cr/Au薄膜，其厚度为100-500nm。
4.根据权利要求I所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器，其特征在于，所述生物敏感膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC+NHS活化形成的，生物敏感膜可以连接各种单克隆抗体，单克隆抗体可以和被检测的抗原结合。
5.根据权利要求4所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器，其特征在于，所述的磁性标签为链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠，可以和经生物素修饰的单克隆抗体或多克隆抗体相结合，生物素修饰的单克隆抗体或多克隆抗体可以和被检测的抗原结合。
6.根据权利要求5所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器，其特征在于，所述的生物芯片采用自组装膜技术固定单克隆抗体，单克隆抗体与抗原结合，带有链酶亲和素的磁性标签与生物素化的多克隆抗体结合，由于抗原-抗体的免疫反应，磁性标签被标记到Au膜的表面上,一旦有极微量的被检测生物分子存在时,在外磁场作用下,生物芯片上的磁性标签产生的弥散磁场将导致微型化磁通门传感器输出电压的变化，从而实现对相应生物分子的高灵敏度检测。
7.根据权利要求1-6任一项所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器，其特征在于，所述的施加轴向磁场的螺线管线圈为一绕制在PVC上的螺线管线圈，通过外接的直流电源产生轴向均匀磁场；微型化磁通门传感器的敏感轴放置在螺线管线圈的轴向位置上，生物芯片与微型化磁通门传感器的敏感轴位于同一平面且紧密相连。
8.根据权利要求1-6任一项所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门传感器，其特征在于，所述微型化磁通门传感器，其磁芯材料为NiFe薄膜、非晶或纳米晶软磁带材材料，并采用MEMS工艺制作。
9.根据权利要求1-6任一项所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门传感器，其特征在于，所述的信号采集系统能够实现在激励线圈中施加一使磁芯处于饱和状态的交流电流以及对接收线圈的输出信号经滤波后得到的二次谐波信号进行检测，二次谐波信号大小与外部磁场成正比，因此可测量磁性标签产生的磁场大小与检测抗原之间的关系。
全文摘要
本发明提供一种血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器。该生物传感器由位于玻璃基片上的微型化磁通门传感器、生物芯片、信号采集系统组成。生物芯片由玻璃基片上的Au膜、生物敏感膜、磁性标签构成。Au膜为溅射的Cr/Au薄膜，生物敏感膜为纳米级厚度的自组装膜，生物敏感膜可以连接各种单克隆抗体。磁性标签为链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠，可以和经生物素修饰的单克隆抗体或多克隆抗体相结合。本发明生物传感器检测原理是采用双抗夹心法，检测灵敏度可以检测血清肿瘤标志物高达1ng/ml的抗原。
文档编号G01N33/574GK102937649SQ201210397978
公开日2013年2月20日 申请日期2012年10月18日 优先权日2012年10月18日
发明者周勇, 雷冲, 雷剑 申请人:上海交通大学