用于检测肠癌的标记物及其应用的制作方法

本申请为分案申请，原申请的申请号为201410403598.9，申请日为2014年8月15日，发明名称为“用于检测肠癌的标记物及其应用”。本发明属于生物学和医学检验领域，涉及用于检测肠癌的标记物，还涉及所述标记物在检测肠癌中的应用以及相关的试剂盒和检测方法。
背景技术：
：肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，占60％。随着人民生活方式和膳食结构的改变，结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势,发病多在40岁以后，男女之比为2:1。目前.结直肠癌早期诊断的方法包括大便隐血检测(fecaloccultbloodtest,fobt)、结肠镜检测(colonoscopy)、粪便dna突变检测和粪便rna特异性基因检测等，钡灌肠(double-contrastbariumenema，dcbe)等。结肠镜检测被认为是诊断结直肠癌的金标准，但是它为侵入性检查，需要肠道准备，检查过程中有发生并发症如出血及穿孔危险，患者接受性不高，且花费较大。大便隐血检测虽然为非侵入性检测，但是检查结果容易受饮食等因素的影响，并且对于筛查结直肠癌而言.粪便隐血检测的灵敏度和特异性不够理想。成熟的microrna(mirna)是一类不编码蛋白质的单链的rna，由18－24个碱基组成，与相应的mrna结合导致mrna分解或沉默，从而起到对基因的调节作。近年来的研究显示，mirna的特异性表达与肿瘤的发生和发展有关，某些mirna甚至可以起到抑癌基因或癌基因的作用。环氧化酶(cox)是前列腺素合成过程中的重要限速酶，cox2在正常组织中不表达，但可在各种刺激因素的作用下诱导表达，故又被称为诱导型早期反应基因，与肿瘤的发生、发展密切相关，近年来的研究发现，cox2在大部分头颈肿瘤中过表达，cox2也是肠癌的生物标志之一。因此，如果能够研发出的相应的肠癌试剂盒使之能够应用于科研领域，将极大地促进肠癌筛查研究及科研成果的转化，对于肠癌的诊疗必将起到巨大的推动作用。技术实现要素：本发明人研究发现，mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a的上调表达与人类多种肿瘤(如肠癌)的发生、发展相关，提示对检测粪便和血清mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a的表达检测可以成为肿瘤如肠癌检测的指标之一。本发明提供用于检测肠癌的引物、探针和试剂盒(尤其是用于检测粪便和血清mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a和cox2)的核酸及检测方法。本发明包括以下技术方案：1.肠癌检测试剂盒，其包含选自seqidno:9-27所示的引物和/或探针。2.上述1所述的试剂盒，其包含选自seqidno:9-15所示的一种或多种引物。3.上述1或2所述的试剂盒，其包含seqidno:23所示的引物。4.上述1－3中任一项所述的试剂盒，其包含seqidno:24和/或27所示的探针。5.上述1－4中任一项所述的试剂盒，其包含选自seqidno:16－22和25－26所示的一种或多种引物。6.上述1－5中任一项所述的试剂盒，其包含选自以下的一组或多组引物和探针：seqidno:9、16、23和24；seqidno:10、17、23和24；seqidno:11、18、23和24；seqidno:12、19、23和24；seqidno:13、20、23和24；seqidno:14、21、23和24；seqidno:15、22、23和24；和seqidno:25-27。7.上述1－6中任一项所述的试剂盒，其中所述探针带有荧光标记。8.上述7所述的试剂盒，其中所述探针的5'用fam标记，而所述探针的3'用tamrm标记。9.试剂在制备肠癌检测试剂盒中的用途，其中所述试剂用于测定选自以下的一种或多种标记物：mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a和cox2，所述试剂优选选自seqidno:9-27所示的一种或多种引物和/或探针。10.肠癌检测方法，包括检测样品中选自以下的一种或多种标记物的水平：mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a和cox2，所述样品优选为粪便和/或血清样品，优选使用选自seqidno:9-27所示的一种或多种引物和/或探针检测所述标记。本发明的试剂盒和方法采用水解探针法taqman技术的设计方法(图1)，除了一对特异性引物，用taqman探针法增加一条与模版互补的基因特异性探针(通常20—30bp)，特异性高。此外，探针上5'端和3'端还可以分别标记一个荧光报告基团，增强灵敏度。本发明的引物、探针、试剂盒和方法适用肠癌患者的检测和诊断。用于肠癌检测的引物和探针优选为：(1)用于检测mirna-92a的逆转录引物、探针及检测引物如下所示：mirna-92a-rt(逆转录引物)：5'-gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagccaggcc-3'；mirna-92a-f：5'-ctgctgctattgcacttgtcc-3'；通用下游引物(mirna-92a-r)：5'－gctcaaccagtgaggcgtc-3'；通用探针(mirna-92a-b)：5'-cgcctgccgttcgcactggat-3'；(2)用于检测mirna-135b的逆转录引物、探针及检测引物如下所示：mirna-135b-rt(逆转录引物)：5'-gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagctcacat-3'；mirna-135b-f：5'-tgctgctatggcttttcattcct-3’；通用下游引物(mirna-135b-r)：5'-gctcaaccagtgaggcgtc-3'；通用探针(mirna-135b-b)：5'-cgcctgccgttcgcactggat-3'；(3)用于检测mirna-18a的逆转录引物、探针及检测引物逆转录引物如下所示；mirna-18a-rt(逆转录引物)：5'-gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagcctatct-3'；mirna-18a-f(检测用上游引物)：5'-ctgctgtaaggtgcatctagtgc-3'；通用下游引物(mirna-18a-r)：5'-gctcaaccagtgaggcgtc-3'；通用探针(mirna-18a-b)：5'-cgcctgccgttcgcactggat-3'；(4)用于检测mir-221的逆转录引物、探针及检测引物如下所示：mir-221-rt(逆转录引物)：5'-gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagcgaaacc-3'；mir-221-f(上游引物)：5'-gctgcagctacattgtctgctg-3'；通用下游引物(mir-221-r)：5'-gctcaaccagtgaggcgtc-3'；通用探针(mir-221-b)：5'-cgcctgccgttcgcactggat-3'；(5)用于检测mirna-19的逆转录引物、探针及检测引物如下所示：mirna-19-rt(逆转录引物)：5'-gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagctcagtt-3'；mirna-19-f(上游引物)：5'-tgctgctgtgcaaatctatgcaa-3'；通用下游引物(mirna-19-r)：5'-gctcaaccagtgaggcgtc-3'；通用探针(mirna-19-b)：5'-cgcctgccgttcgcactggat-3'；(6)用于检测mirna-223的逆转录引物、探针及检测引物如下所示：mirna-223-rt(逆转录引物)：5'-gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagctggggt-3'；mirna-223-f(上游引物)：5'-ctgctgctgtcagtttgtcaaat-3'；通用下游引物(mirna-223-r)：5'-gctcaaccagtgaggcgtc-3'；通用探针(mirna-223-b)：5'-cgcctgccgttcgcactggat-3'；(7)用于检测mirna-301a的逆转录引物、探针及检测引物如下所示：mirna-301a-rt(逆转录引物)：5′-gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagcgctttg-3′；mirna-301a-f(上游引物)：5′-ctgctgccagtgcaatagtattgt-3′；通用下游引物(mirna-301a-r)：5′-gctcaaccagtgaggcgtc-3′；通用探针(mirna-301a-b)：5′-cgcctgccgttcgcactggat-3′t：(8)用于检测cox2的引物和探针如下所示：cox2-b(探针)：5′-tcctcaaaagattcatagggcttcagc-3′；cox2-f(上游引物)：5′-cacttgaccagagcagagagatga-3′；cox2-r(下游引物)：5′-tagagcgcttctaactctgcagc-3′。microrna所述引物的序列是根据microrna数据库(ht中：//www.mirbase.org/)中报道的核苷酸序列mirna-92a(mimat0000092)、mirna-135b(mimat0000758)、mirna-18a(mimat0000072)、mirna-221(mimat0000278)、mirna-19(mimat0000073)、mirna-223(mimat0000280)、mirna-301a(mimat0000688)以及genebank数据库中的cox2序列(jn793538)为模板设计的。表1列出了所述mirna的核苷酸序列。表1mirna名称序列(登录号)seqidno：hsa-mir-92uauugcacuugucccggccugmimat00000921mirna-135buauggcuuuucauuccuaugugamimat00007582mirna-18auaaggugcaucuagugcagauagmimat00000723mirna-221agcuacauugucugcuggguuucmimat00002784hsa-mir-19augugcaaaucuaugcaaaacugamimat00000735hsa-mir-223ugucaguuugucaaauaccccamimat00002806hsa-mir-301acagugcaauaguauugucaaagcmimat00006887cox2序列(序列号：jn793538)如下：cacttgaccagagcagagagatgaaataccagtcttttaatgagtatcgcaaacgttttctgctgaagccctatgaatcttttgaggaacttacaggagagaaggaaatggctgcagagttagaagcgctcta(seqidno:8)。本文的试剂盒可以检测的样品为来自肠癌疑似患者(如病人)的粪便、咽喉拭子、泄殖腔拭子、组织样本、血清或血浆、疱疹液、脑脊液或病毒分离培养物标本，优先为粪便，其次优先选择血清。本发明提供的技术方案通过对少量mirna和cox2的检测即可实现对肠癌的准确诊断，为生产出准确、高效和经济的检测产品提供了可能。建立的肠癌检测模型能较好地区分肠癌个体和健康个体，对于肠癌患者的及时治疗和预防具有重要的临床实际意义。本领域技术人员知晓，可以根据相关标记物(所述mirna和cox2)的序列，对本发明的引物序列和探针序列作出适当调整和修改，这些经过修改的引物序列和探针序列仍可以用于检测所述的标记物。本发明也包括这些等同的技术方案。附图说明图1为探针法检测示意图；图2为mirna-19的最低检测下限；图3为mirna-135b的最低检测下限；图4为mirna-18a的最低检测下限；图5为mirna-221的最低检测下限；图6为mirna-92a的最低检测下限；图7为mirna-223的最低检测下限；图8为mirna-301a的最低检测下限；图9为cox2的最低检测下限；图10为mirna-19a的表达水平；图11为mirna-135b表达水平；图12为mirna-18a表达水平；图13为mirna-221表达水平；图14为mirna-92a表达水平；图15为mirna-223表达水平；图16为mirna-301a表达水平；图17为cox2表达水平。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。实施例1引物和探针设计以及反应体系的建立和优化：1.引物和探针设计：根据相应mirna和cox2的序列，设计引物和探针序列。具体图列如表2所示。表2注释：所述探针的5'用fam标记，而所述探针的3'用tamrm标记。2.肠癌pcr诊断试剂盒的反应体系的建立和优化：2.1标本采集收集经内镜检查确诊的慢性结肠炎、溃疡性结肠炎、肠息肉、腺瘤性息肉、不同分期的大肠癌等系列人群，检测mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a和cox2的表达水平；2.2rna的提取rna提取液购买于美国著名分子生物学公司mrc(molecularresearchcenter)1)样品从-80℃取出后置于冰上(临床样本，置于冰上取回，以约0.5g/2ml离心管分装后冻存-80℃)；2)加入1mltrizollsreagent，漩涡震荡使样品均匀分布，室温静置5min；3)加入200μl氯仿，漩涡震荡混合，室温静置1-2min；以12000rcf于4℃离心15min；4)转移上层均一水相(400μl)至新的离心管中，加入1.5倍体积的无水乙醇(600μl)，用枪缓慢吹打使其充分混匀(不可漩涡震荡)；5)分次取700μl加入rneasy吸附柱中，以>12000rcf/8000g于4℃离心30s，弃滤出液；6)以最大转速4℃离心1min，干燥纯化柱；7)加入30μlrnase-freewater，以>12000rcf/8000g于4℃离心1min，洗脱总rna；8)再次加入30μlrnase-freewater，以>12000rcf/8000g于4℃离心1min，进行二次洗脱(可与第一次洗脱rna收集于同一管)，冰上放置；9)检测所得总rna浓度及纯度。按照以上提供的方法提取rna后将其逆转录成cdna，rna的逆转录体系如下(表3)：表3组分终浓度20×逆转录缓冲液1×mg2+浓度5.0mmol/ldntps(含dutp)0.3mmol/l逆转录酶5u逆转录引物0.15μmol/l模板2μg补水至25μlrna逆转录条件为：16℃30min；42℃35min；80℃5min；4℃保存cdna用于后续pcr扩增。2.3pcr引物浓度的优化在反应体系中，将mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a和cox2的引物浓度分别从0.1μmol/l至0.6μmol/l作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a、cox2最佳引物终浓度分别为0.20μmol/l、0.20μmol/l、0.20μmol/l、0.20μmol/l、0.20μmol/l、0.20μmol/l、0.20μmol/l、0.25μmol/l。2.4镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件不变的前提下，将mgcl2的浓度从2.5mmol/l至5.5mmol/l以0.5mmol/l递增，经过多次重复实验选定3.0mmol/l为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。2.5taqdna聚合酶(taq酶)用量的优化通过比较taq酶用量(以单位unit计)的优化实验结果，选定3u作为试剂盒反应体系中taq酶的用量。2.6dntp浓度的优化通过使用不同浓度的dntp进行检测，综合评估后选0.25mmol/l作为试剂盒反应体系中dntp的使用量。2.7探针浓度的优化在反应体系中，将探针浓度分别从0.05μmol/l至0.2μmol/l作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a、cox2最佳探针终浓度为0.10μmol/l、0.10μmol/l、0.10μmol/l、0.10μmol/l、0.10μmol/l、0.10μmol/l、0.1μmol/l、0.15μmol/l。利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光pcr反应体系为25μl体系，所需各组分及相应浓度见表4。表4.优化后的pcr反应体系注：a.在荧光pcr反应体积不同时，各试剂应按比例调整。b.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。3.仪器检测通道的选择：在进行荧光pcr反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。4.pcr条件选择如下：pcr扩增条件：95℃3分钟，1个循环；95℃5秒，60℃45秒，40个循环。实施例2检测mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a、cox2的拷贝数，确定其最低检测下限实验将浓度为106个拷贝/ml的香港中文大学提供的mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a、cox2阳性样品，按10倍梯度稀释到105个拷贝/ml、104个拷贝/ml、103个拷贝/ml、2.5×102个拷贝/ml、102个拷贝/ml，采用实施例1中设计的引物、探针以及建立的反应体系和仪器、扩增条件，进行荧光pcr检测。结果表明，在2.5×103个拷贝/ml时，ct值为32，其它各项指标也符合检测要求。因此，本发明通过优化引物和探针，提高了检测的灵敏性，其检测下限可以达到2.5×103个拷贝/ml，结果见图2-6。实施例3检测样品中mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a、cox2的表达量和确定其特异性实验收集经天津人民医院全结肠镜检查确诊的慢性结肠炎、溃疡性结肠炎、肠息肉、腺瘤性息肉、不同分期的大肠癌等系列人群，选择结直肠癌55例、腺瘤10例、正常人15例，采集其粪便样本，检测mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a、cox2的表达水平及特异性。检测结果判断：55例结直肠癌患者、10例腺瘤患者和15例健康对照者粪便中mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a、cox2表达量见图10-17。对结直肠癌患者、腺瘤患者和健康对照者粪便中mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a、cox2表达水平进行数据处理，结果示于表5，利用spss13.0进行统计分析结果得出：肠癌患者粪便中mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a、cox2表达水平明显高于腺瘤和健康对照者，差异具有统计学意义(p<0.01)，参看图10-17。区分肠癌患者和非肠癌患者粪便中mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a、cox2表达量拷贝数的临界值分别为1360个、66个、1255个、156个、425个、9000个、50个、925个拷贝，见表5。综合结果说明：粪便中mirna-92a、mirna-135b、mirna-18a、mirna-221、mirna-19、mirna-223、mirna-301a、cox2表达水平可以作为肠癌诊断的标志物，具有重要的诊断价值。表5序列表<110>深圳市晋百慧生物有限公司<120>用于检测肠癌的标记物及其应用<160>17<210>1<211>21<212>mirna<213>人<400>1uauugcacuugucccggccug21<210>2<211>23<212>mirna<213>人<400>2uauggcuuuucauuccuauguga23<210>3<211>23<212>mirna<213>人<400>3uaaggugcaucuagugcagauag23<210>4<211>23<212>mirna<213>人<400>4agcuacauugucugcuggguuuc23<210>5<211>23<212>mirna<213>人<400>5ugugcaaaucuaugcaaaacuga23<210>6<211>22<212>mirna<213>人<400>6ugucaguuugucaaauacccca22<210>7<211>23<212>mirna<213>人<400>7cagugcaauaguauugucaaagc23<210>8<211>133<212>dna<213>人<400>8cacttgaccagagcagagagatgaaataccagtcttttaatgagtatcgcaaacgttttc60tgctgaagccctatgaatcttttgaggaacttacaggagagaaggaaatggctgcagagt120tagaagcgctcta<210>9<211>61<212>dna<213>人工的<400>9gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagccaggcc61<210>10<211>61<212>dna<213>人工的<400>11gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagctcacat61<210>10<211>61<212>dna<213>人工的<400>11gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagcctatct61<210>12<211>61<212>dna<213>人工的<400>12gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagcgaaacc61<210>13<211>61<212>dna<213>人工的<400>13gctcaaccagtgaggcgtccacgcctgccgttcgcactggatgcactggttgagctcagtt61<210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