一种治疗大肠癌的药物组合物及其制备方法

专利名称：：一种治疗大肠癌的药物组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明属于医药领域，具体涉及一种治疗大肠癌的药物组合物及其制备方法。
背景技术：
：大肠癌是较常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率列为恶性肿瘤的46位，尽管治疗措施不断改进，其整体治疗水平却仍然徘徊在20世纪70年代水平，治疗手段主要有手术、放疗、化疗、生物反应调节治疗等。由于大肠癌早期无明显的临床症状，如出现症状和体征.多数已属中晚期.失去手术机会。中晚期肿瘤患者一般采用放化疗，患者多因体质或放化疗之毒副作用，而难以承受。术后5年生存率在50%55%之间，属于较低水平。目前也有很多采用中医辨证施治的方法治疗大肠癌炎的报道，如中国专利申请CN1209337A(981141280.5)公开了"一种抬疗大肠癌药"处方为鹿角12g、鳖甲胶12g、薏苡仁30g、败酱草15g、三七6g、紫香蘑60g、制麦麸30g、人参10g、当归12g。服用3-6个月，本品对不同阶段的大肠癌、均可改善症状、增进食欲，睡眠良好、体重增加、精神乐观。如中国专利申请CN101264221A(200810105831.X)公开了"一种治疗大肠癌的中药组合物及其制备方法"其原料为归尾5-15份、槐花20-30份、黄芩10-20份、红花15-20份、香附10-15份、甘草20-25份、马齿苋10-15份、防风20-30份、五灵脂10-20份、山药15-25份、桔梗5-10份、白术15-25份、五味子10-25份、知母15-20份；该药物具有清热利湿、行气活血、化瘀解毒、温补脾肾等作用，用于大肠癌引起的腹部阵痛、便中夹血、面色苍白、少气乏力等症。
发明内容本发明所解决的技术问题是提供一种用于治疗大肠癌的药物组合物。该药物组合物是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂鸦胆子5-11份、喜树果5-11份、薏苡仁和/或红藤8-16份、莪术8-16份、人参和/或党参5-16份。经发明人长期临床总结，以鸦胆子8份、喜树果8份、薏苡仁12份、莪术12份、人参8份治疗效果最明确。其中喜树果为珙桐科植物喜树CamptothecaacuminateDecne的果实。应用时，可将原料药直接粉碎后制成散剂，或将粉碎后的粉末装胶囊制成胶囊剂；或将粉碎后的粉末加入可接受的辅料压制成片剂。本发明药物组合具有清热解毒、活血散结、益气扶正等功效，在长期临床观察和系列实验研究中显示了良好的抗癌效应，尤其对大肠癌治疗效果明确。主治大肠癌(癌)毒瘀内阻，兼气虚者，症见腹痛，痛点固定，剌痛拒按，腹部包块，腹胀，乏力，纳差，舌质紫暗或有瘀点、瘀斑，舌苔白而腻，脉细涩。用于大肠癌或大肠癌术后辩证属(癌)毒瘀内阻，兼体虚者。本发明所解决的第二个技术问题是提供该药物组合物的制备方法，其步骤如下A、原料采用乙醇或水提取，收集提取液，备用；B、将步骤A所得提取液按照药剂学常规方法制剂。其中，步骤A中提取条件为以6-10倍量的乙醇或水提取1-3次，每次1-2.5小时。若采用乙醇提取，乙醇浓度为65-95%。(乙醇百分比表示2(TC时容量的比例。)步骤B中处理提取液的方法为a、浓縮提取液，得浓縮液；b、加浓縮液3-6倍量水，静置，过滤；c、滤液浓縮，加防腐剂，调pH至6-7。若提取液是以乙醇提取，可先挥至无醇味再行浓縮，为节约成本，也可以回收其中的乙醇至提取液无醇味再行浓縮。提取液经过上述处理再加入药学上可接受的辅料制备成具体的剂型，如颗粒剂、胶囊剂、片剂或口服液等剂型。该方法根据原料药的特性，采用合理的方法提取其中的主要活性成分，使得治疗效果更稳定、可控。图1为本发明药物工艺流程图。具体实施例方式以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。本发明药物组合物是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂鸦胆子5-11份、喜树果5-11份、薏苡仁和/或红藤8-16份、莪术8-16份、人参和/或党参5-11份。在该用量范围内浮动均可以实现清热解毒、活血散结、益气扶正的作用，可用于治疗大肠癌，或用于大肠癌术后辩证属(癌)毒瘀内阻，兼体虚者。经发明人长期确定鸦胆子8份、喜树果8份、薏苡仁12份、莪术12份、人参8份的治疗效果更明确、更稳定。为了便于服用，可将上述药物组合物加入药学上可接受的辅料制成常用制剂，如颗粒剂、片剂、胶囊剂或口服液等。如可将原料药直接粉碎后制成散剂，或将粉碎后的粉末装胶囊制成胶囊剂；或将粉碎后的粉末加入可接受的辅料压制成片剂。也可以将原料提取后获得药效成分更稳定，更明确的提取物，并采用常规制剂技术制成散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂或口服液、水煎剂、丸剂等剂型。提取工艺可采用如下工艺以65-95%乙醇提取原料，为提取完全，可以6-10倍量的乙醇提取1-3次，每次1-2.5小时。得到提取液后，将提取液挥至无醇味，浓縮得浓縮液；b、加浓縮液3-6倍量水，静置，过滤；c、滤液浓縮，加防腐剂，调pH至6-7，再加入药学上可接受的辅料进行制剂。以下通过药学实验证明本发明药物组合物的有益效果。发明人对本发明药物组合物的抗大肠癌作用及其机制进行了研究，发现该药物组合物对人大肠癌HT-29裸鼠移植瘤具有确切的抑瘤效果，可抑制人大肠癌HT-29移植瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，能抑制肿瘤血管生成，有抗肿瘤浸润侵袭的潜在作用，其机制可能与其改善人大肠癌HT-29移植瘤细胞及细胞核形态，诱导癌细胞重新分化逆转，降低肿瘤组织FLK-1、VEGF、TGF-P1、匪P-2、uPA的表达水平，促进肿瘤组织Caspase-3、TIMP-2的表达，增大Bax/Bcl-2的含量相对比值，促进肿瘤组织Endostatin、TMP的表达以及降低FLK-1、VEGF、匪P的表达有关，其中以Endostatin、FLK-l的影响较大。CFK临床常规使用，基本无毒。实验资料如下下述药效学实验是采用如下配比的原料药鸦胆子800g、喜树果800g、薏苡仁1200g、莪术1200g、人参800g，按照图1所示流程制备而得的稠浸膏，每g稠浸膏含生药8.96g。成品放于4t:冰箱保存。该稠浸膏以下简称肠复康。实验一、对人大肠癌HT-29抑瘤效应的实验研究1、实验材料1.1实验动物BALB/c-皿/nu裸小鼠，雌雄各半，46周龄，体重1822g，由四川省抗菌素研究所动物房提供(合格证川实动管第90号)，在SPF条件下饲养。1.2实验瘤株人大肠癌HT-29细胞株，由四川大学华西医院移植免疫室提供。1.3实验用药1.3.1受试药物肠复康，每g稠浸膏含生药8.96g。1.3.2阳性对照药注射用5-氟脲嘧啶(5Fu)，江苏南通制药厂生产，批号011210。甲酰四氢叶酸f丐(CF)，山西普德药业有限公司生产，批号20020101。1.4主要试剂与仪器1.4.1细胞培养材料T-25培养瓶，含20%NBC(小牛血清)的DMEN培养基，0.25%TN(胰蛋白酶)。1.4.3主要仪器ES-J系列电子分析天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司，电热恒温水浴箱(北京医疗设备厂)。2、实验方法2.l瘤株复苏及传代复苏从细胞库中取出人大肠癌HT-29冷冻细胞，37t:下溶解，将细胞悬液加入5ml培养基内，1000rpm离心，510min后弃上清夜，将细胞置于20%NBS-DMEM培养基中，接种于T-25培养瓶。传代待细胞长满瓶后，弃培养基，用0.25%TN消化，当细胞变圆，间距变大时，用含小牛血清的培养基终止消化，离心冼涤，在按1传23瓶比例接种。2.2动物造模将含5X106癌细胞的悬液0.5ml分别于两只裸鼠腹背侧部皮下注射，SPF条件下饲养，所有饮用水、饲料及笼具均经无菌消毒处理。待肿瘤长至直径O.51.Ocm，断颈处死裸鼠，无菌剥离瘤体，浸入生理盐水中，剪成1.Omm左右直径碎块，用16号套管针于40只裸鼠腹背侧部各移植23块。2.3实验分组及给药裸鼠接种后第6天，随机分成如下5组并给药空白对照组生理盐水0.2ml，灌胃。阳性对照组5Fu25mg/Kg，CF2mg/Kg，腹腔注射。肠复康低量组肠复康4.48g/Kg，灌胃。肠复康中量组肠复康8.96g/Kg，灌胃。肠复康高量组肠复康17.92g/Kg，灌胃。5Fu、CF用生理盐水各配成0.2ml注射，每天给药1次，共5天后停药，停药后第29天起重复注射5天。肠复康浸膏各剂量均用生理盐水配成0.2ml使用，每天给药1次，每给药6天后停l天，共8周。肠复康低、中、高剂药量均表示含生药剂量，各相当于成人临床用药量的5倍、10倍、20倍。2.4瘤重、抑瘤率检测移植分组后第60天(即末次给药后第2天)，处死裸鼠，剥离瘤体后称重(W)，计算抑瘤率(I):1=(对照组W-治疗组W)/对照组WX100X。3、统计方法计量资料均以X士SD表示。所有指标分析经SPSS11.0统计软件包处理。组间比较采用LSD(方差齐)或Tamhane(方差不齐)。4、实验结果4.1—般状况观察裸鼠接种2周内，癌体基本成椭圆形，2周后逐渐不规则，表面凹凸不平。空白组瘤体生长较快，肠复康高剂量组生长最慢。特别在后期，空白组裸鼠显得尤为消廋。饮食、活动方面各组无明显差异，仅每次肠复康灌胃lh内，裸鼠拥挤少动，其后恢复正常。实验过程中，除空白组和5Fu+CF组外，各组均有一只裸鼠因灌胃不当死亡。4.2各用药组对裸鼠移植瘤的抑瘤作用，见表1。表1各组裸鼠移植瘤瘤重及抑瘤率比较组别鼠数(只)瘤重(g)抑瘤率(%)空白对照组81.0213±。.2339——肠复康髙量组0.3471±0.0699AA'▲66.01肠复康中量组0.5386±0.1107AA47.26肠复康低量组0.6829±0.232633.135Fu+CF组80.6875±0.286032.68注A与空白组比较P<0.01，a与5Fu+CF组比较P<0.05。从表l可见，肠复康浸膏抑瘤作用与剂量呈正相关趋势，其中低剂量组抑瘤率33.13%，高剂量组抑瘤率达66.01%，高于5Fu+CF组抑瘤率32.68%。肠复康高剂量组移植瘤瘤重显著小于空白对照组和5Fu+CF组(P<0.01、P<0.05)。结果显示肠复康对人大肠癌具有良好的抑瘤效应。实验二、对人大肠癌HT-29移植瘤病理形态的影响1实验材料1.1瘤体取实验一中空白对照组、阳性对照组、肠复康各剂量组共37只人大肠癌HT-29裸鼠移植瘤瘤体。1.3仪器LDZ4-0.8自动平衡微型离心机(北京医用离心机厂)TS-12G自动脱水机(湖北省医用电子仪器厂)BMG-III型病理组织包埋冷冻台(常州郊区中威电子仪器厂)病理组织漂烘处理仪(常州郊区中威电子仪器厂)BH-20LYMPUS光学显微镜Mias-2000图象分析系统(四川大学)2实验方法2.1肿瘤病理形态学检查瘤体取下后立即用10%中性福尔马林固定48小时，梯度酒精系列脱水，石蜡包埋，常规切片35um，HE染色，光学显微镜下观察。2.2肿瘤细胞核形态定量检测切片经HE染色。200倍光镜下选取癌细胞均匀丰富的5个视野，由Mias-2000图像系统每个视野采集30个癌细胞核的形态图像，并分析处理结果。3统计方法计量资料均以X±SD表示。所有指标分析经SPSS11.0统计软件包处理。组间比较采用LSD(方差齐)或Tamhane(方差不齐)。4实验结果4.1各用药组对裸鼠移植瘤病理形态的影响镜下见空白组移植瘤中心有不同程度的坏死，癌细胞丰富，中等大小，呈卵圆形、梭形、三角形及不规则形，胞浆较少，呈淡蓝色，大多数细胞内有一个核，部分细胞内有两个及以上的核，核中等，呈卵圆形、梭形、三角形及不规则形，核膜厚，染色质丰富，染色深，核仁明显且大，有l-3个，核分裂多见；5Fu+CF组癌组织中心坏死程度减轻，癌细胞中等偏大，呈卵圆形、梭形、三角形，胞浆有所增多，淡红色，细胞内多核减少，核中等偏大，呈卵圆形、梭形、三角形，核膜较厚，染色质较丰富，染色较深，核仁明显较大，有1-2个，核分裂较多见；肠复康组癌组织中心坏死程度减轻，高剂量组更为明显，癌细胞较大，呈圆形、卵圆形，少许呈梭形，胞浆较丰富，呈淡红色，细胞内几乎只有一个核，核偏大，呈圆形、卵圆形，少许呈梭形，核膜变薄，染色质少，染色浅，几乎呈空泡状，核仁较明显、较大，大多数只有1核仁，核分裂可见。4.2各用药组对裸鼠移植瘤细胞核形态定量的影响，见表2。表2各组移植瘤细胞核形态定量比较组另lj鼠数(只)形状因子梭仁面积/梭面积(％)空白对照组80.8783±0.0102111.82±4.183肠复康高量组70.8985±0.01754A7.50±1.108Ai肠复康中量组70.8811±0.013237.086±1.085aA肠复康低量组70.8788±0.015709.100±1.633A注A与空白组比较P<0.05，AA与空白组比较P<0.01。由表2可知，肠复康各组肿瘤细胞核形状因子随剂量递增，高剂量组明显大于空白组(P<0.05)，提示肠复康可改善人大肠癌细胞核形态，使之规则。从核仁面积/核面积变化来看，肠复康各组均较空白组减小，并有统计学差异(P<0.05、P<0.01)。实验三、抗人大肠癌HT-29细胞增殖作用及机理研究1实验材料1.1瘤体取实验一中空白对照组、阳性对照组、肠复康各剂量组共37只人大肠癌HT-29裸鼠移植瘤瘤体。1.2试剂Ki-67、FLK-l、TGF-P:单抗及VEGF多抗均购自SANTACRUZ公司。[OO94]1.3仪器BH-20LYMPUS光学显微镜，Mias-2000图像分析系统(四川大学)。2实验方法2.1免疫组化染色瘤体取下经福尔马林固定、梯度酒精脱水、石蜡包埋后，分别行Ki-67、FLK-1、TGF-Pi单抗及VEGF多抗的免疫组化染色。具体操作按试剂盒说明进行，主要染色过程如下1)切片脱蜡至水，用PBS液(0.01mol/L，pH值7.4)冲洗3次X5min。2)3%11202室温孵育IO分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min。3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。4)10%的正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育IO分钟。倾去血清，勿洗，滴加1:100比例稀释的一抗(Ki-67、FLK-1、TGF-P!及VEGF抗体)，37。C孵育1小时。5)PBS冲洗，5分钟X3次。6)滴加第二代生物素标记二抗工作液，37t:或室温孵育30分钟。7)PBS冲洗，5分钟X3次。8)滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37t:孵育30分钟。9)PBS冲洗，5分钟X3次。10)显色剂显色(DAB或AEC)。11)自来水充分冲洗，苏木精复染，封片。2.2指标检测Ki-67阳性细胞数200倍光镜下计数5个视野阳性细胞数，求取每个视野平均数。VEGF、FLK-1、TGF-P:染色面积和积分光密度(IOD):200倍视野下，选取每张切片中VEGF、FLK-1、TGF-P!着色最明显的10个视野，以Mias-2000图象系统采集图像并半定量检测3种染色阳性物质的面积和积分光密度，求取每视野的平均值，表示以上3种物质的3统计方法计量资料均以X士SD表示。所有指标分析经SPSS11.0统计软件包处理。组间比较采用LSD(方差齐)或Tamhane(方差不齐)。并行多元线性回归分析。4实验结果4.l各用药组对裸鼠移植瘤Ki-67表达的影响见表3。表3各组裸鼠移植瘤Ki-67表达计数比较组另lj鼠数(只)Ki-67值(个/200f)空白对照组815.4750^2.3002肠复康高量组77.6714±1.9500A"肠复康中量组712.1714±1.9268A肠复康低量组714.9714±4.41125Fu+CF组89.4000±3.8781AA注A与空白组比较P<0.05，AA与空白组比较P<0.01，*与5Fu+CF组比较P>0.05。由表3所示，增殖细胞核抗原Ki-67计数以空白组最多，阳性物质着色于癌细胞核内，并主要存在于有核分裂的细胞内，各用药组Ki-67表达均有所减少，其中肠复康高剂量组Ki-67计数最少，虽与5Fu+CF组比较无统计学差异，但已显著少于空白对照组(P<0.01)。提示肠复康可抑制人大肠癌细胞增殖，高剂量作用更明显。4.2各用药组对裸鼠移植瘤VEGF表达的影响，见表4。表4各组移植瘤VEGF表达比较组别鼠数(只)面积总和积分光密度总和空白对照组859634.50±20747.6411278482±1692359.15肠复康髙量组735096.00±15380.2"7569071.5±3165135.2f。肠复康中量组739463.29士12595.2"8550176.90士22S1582.00。肠复康低量组742786士23784.329311415.3士265739LS3注A与空白组比较P<0.05，AA与空白组比较P<0.01。由表4所示，VEGF主要表达在肿瘤细胞胞浆，内皮细胞也有部分表达。肠复康各剂量组移植瘤VEGF的表达均小于空白组，高剂量组染色面积和积分光密度最小，与空白组比较有统计学差异(P<0.01)，提示肠复康可抑制大肠癌表达VEGF，高剂量作用较明显。4.3各用药组对裸鼠移植瘤FLK-1表达的影响，见表5。表5各组移植瘤FLK-1表达比较组别鼠数(只〕面积总和(,"积分光密度总和空白对照组81259.75士693.69272155.00±142215.52肠复康高量组7593.57±280.57。181718.57±83510.75。肠复康中量组7755.14±321.55213406.。。±73292.25肠复康低量组71064.14士504.29263288.29±110116.88注A与空白组比较P<0.05。镜下可见VEGFR(FLK-1)阳性细胞呈局灶性分布，主要散在于肿瘤的边缘，而FLK-l阳性物质主要位于细胞膜，部分见于胞浆内。由表5可知，肠复康各用药组FLK-1表达量均较空白对照组减少，其中肠复康高剂量组FLK-l最少，与空白组比较有统计学差异(P<0.05)。提示肠复康浸膏可抑制人大肠癌FLK-l的表达。4.4各用药组对裸鼠移植瘤TGF-P工表达的影响，见表6。表6各组移植瘤TGF-13i表达比较组另lj鼠数(只)面积总和(,2)枳分光密度总和空白对照组8105368.13±20664.8626733549.00±4274956.49肠复康高量组77574.14±W19949543.00±5423030.74。肠复康中量组14±32754.00。。16497203.00±6686150.34。。肠复康低量组768223.14±14032.5严16916500.00±2976686.68"注A与空白组比较P<0.05，AA与空白组比较P<0.01。由表6可知，肠复康各剂量组裸鼠移植瘤TGF-P工表达均较少，从TGF-P工染色面积和积分光密度比较看，肠复康各剂量组均明显少于空白组并有统计学差异(P<0.05、P<0.01)，其中以中剂量组减少更为显著。提示肠复康浸膏可抑制人大肠癌TGF-13工的生成。综合以上指标，对空白对照组、肠复康各剂量组移植瘤Ki-67阳性细胞数(Y)和VEGF、FLK-1、TGF-Pi表达水平(积分光密度X"X2、X3)行多元线性回归分析，呈显著正相关(r=0.291，P=0.033)，回归方程为Y=4.499+3.892X10—l^l.632X10—5X2+4.318X10—8X3，XpX^Xg的标准回归系数分别为0.258、0.438、0.067。实验四、诱导人大肠癌HT-29细胞凋亡及机理研究[one]l实验材料1.l瘤体取实验一中空白对照组、阳性对照组、肠复康各剂量组共37只人大肠癌HT-29裸鼠移植瘤瘤体。1.2免疫组化试剂盒Caspase-3、Bax、Bcl_2单抗均购自SANTACRUZ公司。1.3仪器Mias-2000图像分析系统(四川大学)，其余材料同实验一。2实验方法2.l免疫组化染色瘤体取下后经福尔马林固定、梯度酒精脱水、石蜡包埋，常规切片35um，分别行Caspase-3、Bax、Bcl-2单抗的免疫组化染色。具体操作按照各试剂盒说明及参照实验三免疫组化染色过程进行。2.2凋亡细胞数检测参照文献报道的检测方法。细胞凋亡的判断标准在HE切片上，典型凋亡细胞的形态学特征为细胞固縮，圆形或椭圆形，或胞浆向外突出，失去与邻近细胞的连接，核固縮，胞浆呈强酸性。细胞凋亡的另一种形式是凋亡小体，其形态学特征为圆形或椭圆形小体，胞浆均匀红染，内含或不含核碎片。细胞凋亡的定量检测选择细胞形态和组织结构清晰的HE染色组织切片，随机计数5个高倍视野(40X)癌组织中凋亡细胞和凋亡小体数，取1个视野平均数为凋亡细胞数。2.3免疫组化指标检测200倍视野下，选取每张切片中Caspase-3、Bax、Bcl-2单抗着色最明显的10个视野，以Mias-2000图象系统采集图像并半定量检测3种染色阳性物质的面积和积分光密度，求取每视野的平均值，表示以上3种物质的含量。3统计方法计量资料均以X±SD表示。所有指标分析经SPSS11.0统计软件包处理。组间比较采用LSD(方差齐)或Tamhane(方差不齐)。4实验结果4.l各用药组对裸鼠移植瘤凋亡细胞计数的影响，见表7。表7各组移植瘤凋亡细胞计数比较<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注AA与空白组比较P<0.01，"与5Fu+CF组比较P<0.01，*与空白组比较P>0.05。由表7所示，各用药组凋亡细胞数都比空白组增多，其中肠复康中、高剂量组移植瘤凋亡细胞数显著多于与空白组和5Fu+CF组(P均<0.01)，5Fu+CF组移植瘤凋亡细胞数与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。实验结果提示肠复康具有促进人大肠癌细胞凋亡的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注A与空白组比较P<0.05，AA与空白组比较P<0.01。镜下Caspase-3呈棕黄色，主要表达在肿瘤细胞胞浆。由表8可知，肠复康各剂量组移植瘤Caspase-3表达量均较空白对照组多，其中低剂量组移植瘤Caspase-3含量最多，染色面积及积分光密度均显著大于空白对照组(P<0.01)。提示肠复康浸膏具有促进人大肠癌Caspase-3表达的作用，低剂量作用较强。4.3各用药组对裸鼠移植瘤Bax、Bcl-2表达的影响，见表9。表9各组移植瘤Bax、Bcl-2表达比较<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注A与空白组比较P<0.05，AA与空白组比较P<0.01。镜下Bax、Bcl-2两者阳性部位主要在细胞浆，呈棕黄色。由表9所示，肠复康各用药组移植瘤Bax、Bcl-2含量均较空白组增多。从各组Bax/Bcl-2值比较看，肠复康各剂量组均大于空白组，尤以高剂量组移植瘤Bax/Bcl-2比值最大，与空白组比较有统计学差异(P<0.01)。提示肠复康浸膏可促进人大肠癌Bax、Bcl-2的表达，但对Bax作用更强，具有增大Bax/Bcl-2比值的作用。实验五、抗人大肠癌HT-29移植瘤血管生成及机理研究l实验材料1.1瘤体取实验一中空白对照组、肠复康各剂量组29只人大肠癌HT-29裸鼠移植瘤瘤体。1.2免疫组化试剂CD34、endostatin、匪P-2单抗及VEGF多抗均购自SANTACRUZ公司1.3仪器Mias-2000图像分析系统(四川大学)，其余材料同实验一。2实验方法2.l免疫组化染色瘤体取下后经福尔马林固定、梯度酒精脱水、石蜡包埋，常规切片35um，分别行CD34、endostatin、匪P-2单抗及VEGF多抗的免疫组化染色。具体操作按照各试剂盒说明及参照《实验三》免疫组化染色过程进行。2.2微血管密度MVD检测先用100倍光镜扫视整个切片，寻找血管高密度区，即"热点"，再在200倍光镜下计数3个视野被CD34抗体染成棕黄色的血管环(条)数目，取其1个视野平均数。2.3免疫组化指标检测200倍视野下，选取每张切片中VEGF、FLK-l、Endostatin、匪P、TIMP-2着色最明显的10个视野，以Mias-2000图象系统采集图像并半定量检测5种染色阳性物质的面积和积分光密度，求取每视野的平均值，表示以上5种物质的含量。3统计方法计量资料以X士SD表示。所有指标分析经SPSSll.O统计软件处理。组间比较采用LSD(方差齐)或Tamhane(方差不齐)。并行相关性分析和多元线性回归分析。4实验结果4.1各用药组对裸鼠移植瘤MVD的影响，见表10。表10各组移植瘤MVD值比较组别鼠数(只)MVD值(条/200f)空白对照组816.5625±3.2557肠复康高量组6.3571±1.9355AA肠复康中量组10.2857±2.7297aa肠复康低量组15.(W±2.7077注AA与空白组比较P<0.01.由表10可知，空白组移植瘤血管生成最多，微血管密度MVD最大，镜下观察新生血管基底膜不完整。肠复康各剂量组移植瘤血管数减少，中、高剂量组移植瘤MVD显著小于空白组(P均〈0.01)。提示肠复康浸膏具有抗人大肠癌血管生成的作用，高剂量作用更明显。4.2各用药组对裸鼠移植瘤VEGF、FLK-1表达的影响，见表11。表11各组移植瘤VEGF、FLK-1表达比较组另IJ鼠数(只)VEGF积分光密度总和FLK-1积分光密度总和空白对照组811278482±1692359.15272155.00±142215.52肠复康高量组77569071.6±3165135.181718.57±83510.75。肠复康中量组8550176.90±2261582.00。213406.00±73292.25肠复康低量组79311415.3±2657391.632632肌29±110116.88注A与空白组比较P<0.05，AA与空白组比较P<0.01。由表11所示，VEGF、FLK-1主要表达在肿瘤细胞胞浆，内皮细胞也有部分表达。肠复康各剂量组移植瘤VEGF、FLK-1的表达均小于空白组，高剂量组染色积分光密度均为最小，与空白组比较有统计学差异(P<0.01、P<0.05)，提示肠复康可抑制大肠癌表达VEGF及FLK-1的作用，高剂量作用较明显。分别行MVD与VEGF、FLK-1(积分光密度)的相关性分析得知，MVD值与二者含量均呈正相关，r值分别为0.332、0.498，P值分别为0.039、0.003。4.3各用药组对裸鼠移植瘤Endostatin表达的影响，见表12。表12各组移植瘤Endostatin表达比较ir^~~鼠数〔只〕面枳总和(,2)积分光密度总和空白对照组肠复康中量组肠复康低量组810577.50±4863.09302415160±1344409.10757242.14±20183.31。。14426018.00±5006211.10。729765.43±11537.67。8253112.40±3121462.44。714719.14±3,.9141413肌10±1010836.97注A与空白组比较P<0.05，AA与空白组比较P<0.01。(方差不齐)镜下Endostatin主要在肿瘤细胞胞浆表达，呈棕黄色。如表12所示，肠复康高剂量组移植瘤Endostatin含量最多，染色面积和积分光密度最大，与空白组比较有显著差异(P<0.01)，肠复康中剂量组也明显促进移植瘤Endostatin表达，其染色面积和积分光密度均明显大于空白组(P<0.05)。行MVD与Endostatin积分光密度相关性分析可知，二者呈显著负相关，相关系数为-0.675，P<0.001。4.4各组用药对人大肠癌匪P-2、TMP-2表达的影响，见表13。表13各组裸鼠移植瘤匪P-2、TIMP-2表达比较iF^~~鼠数〔只)MMP-2积分光密度总禾口~~mff-2积分光密度总和空白对照组肠复康高量组肠复康中量组85844860.10±2135055.692812157.80±903736.9373905419.3±1794321.90。5234876.30±1849324.15。74949959.70±1727808.797993188.30±2420398.10。。75460012.00±1452003.357395046.30±2394216.15。。注A与空白组比较P<0.05。由表13可知，匪P-2表达以空白组移植瘤最多，肠复康各组均减少，其中高剂量组匪P-2染色积分光密度明显小于空白组(P<0.05)。TIMP-2含量以肠复康用药组移植瘤较多，低、中剂量组移植瘤TIMP-2染色积分光密度显著大于空白组(P<0.01)。提示肠复康对人大肠癌移植瘤匪P-2、TIMP-2的调节作用相反，抑制前者表达，促进后者表达。行MVD与匪P-2、TMP-2(积分光密度)相关性分析得知，MVD值与匪P-2含量呈正相关，r=0.347，P=0.033，但MVD值与TIMP-2含量无明显直线相关性(r=-0.086，P=0.329)。综合以上指标，对空白对照组、肠复康各剂量组移植瘤MVD值(Y)和VEGF、FLK-1、Endostatin、匪P-2表达水平(积分光密度X^X^X^Xj行多元线性回归分析，呈显著正相关(r=0.545，P=0.001)，回归方程为Y=9.664+7.298X10—404X10—%_4.33X10—%+3.686X10—XX丄、X2、X3、X4的标准回归系数分别为0.041、0.320、-0.478、0.141。实验六、对人大肠癌HT-29侵袭转移的影响1实验材料1.1瘤体取实验一中空白对照组、肠复康浸膏各剂量组共29只人大肠癌HT-29裸鼠移植瘤瘤体。1.2免疫组化试剂盒匪P-2、TIMP、UPA单抗均购自SANTACRUZ公司。1.3仪器Mias-2000图像分析系统(四川大学)，其余材料同实验一。2实验方法2.1免疫组化染色瘤体取下后经福尔马林固定、梯度酒精脱水、石蜡包埋，常规切片35um，分别行匪P-2、TIMP、UPA单抗的免疫组化染色。具体操作按照各试剂盒说明及参照《实验三》免疫组化染色过程进行。2.2指标检测200倍视野下，选取每张切片中匪P-2、TIMP、UPA着色最明显的10个视野，以Mias-2000图象系统采集图像并半定量检测3种染色阳性物质的面积和积分光密度，求取每视野的平均值，表示以上3种物质的含量。3统计方法计量资料均以X士SD表示。所有指标分析经SPSS11.0统计软件包处理。组间比较采用LSD(方差齐)或Tamhane(方差不齐)。4实验结果4.1各组用药对裸鼠移植瘤匪P-2表达的影响，见表14。表14各组裸鼠移植瘤匪P-2表达比较组别鼠数〔只)面积总和〔,2)积分光密度总和空白对照组肠复康中量组825453.13±9977.615844860.10±2135055.69716973.57±7507.623905419.3±1794321.90。721385.86±7714.674949959.70±1727808.79723399.71±6401.035460012.00±1452003.35注:A与空白组比较P<0.05。由表14可知，匪P-2表达以空白组最多，肠复康各组均有所减少，其中高剂量组匪P-2表达最少，其染色积分光密度与空白对照组比较有统计学意义，P<0.05。提示肠复康具有抑制人大肠癌匪P-2表达的作用，高剂量作用较强。4.2各组用药对裸鼠移植瘤TIMP-2表达的影响，见表15。表15各组移植瘤TMP-2表达比较组另IJ鼠数(只)面积总和(,2)积分光密度总和空白对照组89528.375±3003.342812157.80±903736.93肠复康高量组175%.57±6472.46。5234876.30±1849324.15。肠复康中量组26910.14±89%.62。。7993188.30±2420398.W肠复康低量组723887.43±脱l.21。。7395046.30±2394216.lf注A与空白组比较P<0.05，AA与空白组比较P<0.01。由表15可知，肠复康各剂量组移植瘤TMP-2表达量均明显多于空白对照组，中、低剂量组TIMP染色面积及积分光密度均显著多于空白组，P<0.01。提示肠复康具有促进人大肠癌TIMP表达的作用，低、中剂量作用显著。4.3各组用药对裸鼠移植瘤UPA表达的影响，见表16。表16各组移植瘤uPA表达比较<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表16可知，UPA表达以空白组移植瘤最多，肠复康各组均有所减少，中剂』UPA表达最少，其染色面积及积分光密度均明显小于空白对照组(P<0.05、P<0.01)。提示肠复康具有抑制人大肠癌移植瘤UPA表达的作用。实验七、肠复康浸膏的安全性初步研究发明人将上述稠浸膏制成胶囊剂长期应用于临床，无明显毒副作用，因其含有"有毒"成分鸦胆子、喜树果，故通过毒性试验检测其对荷瘤裸鼠的血液学毒性。1急性毒性试验1.1实验材料1.1.1药品肠复康，以生理盐水配成最大浓度的悬浊液，相当于3.36g/ml。所需低浓度液用生理盐水实验时调配。以上均指生药含量。1.1.2动物昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重20士2g，由我校实验动物中心提供(合格证号川实动管第6号)，并在该实验室观察和喂养。1.2实验方法灌胃给药法。本实验中将20只小鼠禁食(不禁水)12小时后，于24小时内以3.36g/ml灌胃2次，每次灌胃0.8ml。按常规饲养，观察10天后处死。1.3实验结果灌胃后10分钟，所有小鼠开始出现少动、畏縮、闭目、不进食，2小时后逐渐恢复正常。观察10天内，除前期有大便略溏外，无死亡和其它异常症状。处死小鼠后肉眼观察重要器官(心肝脾肺肾等)未见异常。小鼠灌胃总剂量为268.8g/Kg/日，即最大耐受量大于268.8g/Kg/日，相当于60Kg体重成人临床每日用量的300倍。2血液学毒性实验2.1实验材料2.1.1动物采用实验一中造模BALB/c-皿/nu裸小鼠，取其空白对照组和肠复康低、中、高剂量组共32只，雌雄各半，体重20±2g。2.1.2药物具体用法同实验一，肠复康浸膏低、中、高剂量分别为60Kg体重成年人临床每日用药的5、10、20倍。空白对照组采用生理盐水给药。2.1.3仪器F-820血球仪(Sysmex公司)，其余材料同实验一。2.2实验方法同实验一，灌胃给药8周后对29只荷瘤裸小鼠摘除眼球取血约160.5lml，行血常规检查。2.3统计方法数据均以X士SD表示。所有指标分析经SPSSll.O统计软件包处理。组间比较采用LSD(方差齐)或Tamhane(方差不齐)。2.4实验结果，见表17。表17肠复康浸膏对荷瘤裸小鼠血常规的影响血红蛋白红细胞白细胞血小板组另寸〔g/L)〔xl。i2/L)(xl09/L)〔xlOl)~空白组~~153.50±14.7210.23±0.856.34±2.76740.63±439.35^+—s,肠复康咼量组146.00±7.429.77±0.605.96±0.871150.00±145.16肠复康中量组149.00±20.7011.14±2.796.37±1.341214.14±248.80肠复康低量组131.57±16.549.48±1.046.77±2.041112.00±401.29A与空白组比较P<0.05。经统计分析表明，荷瘤小鼠血红蛋白、红细胞、白细胞各项组间比较无明显差异(P>0.05)，血小板比较(方差不齐)，各组间亦无明显差异，P>0.05。提示肠复康浸膏常规使用无明显血液学毒性。临床应用发明人采用鸦胆子800g、喜树果800g、薏苡仁1200g、莪术1200g、人参800g，按照图l所示流程制备而得的稠浸膏制成胶囊剂，每粒胶囊剂含生药8.96g。将上述胶囊剂应用于临床治疗中晚期大肠癌55例(治疗组)，并与应用5-Fu(5-氟尿嘧啶)化疗的55例患者对照(对照组)，两组间性别、年龄、病程及治疗前临床、病理分型及中医症状表现经统计学处理，无明显差异，具可比性。1、治疗方法治疗组口服肠复康胶囊剂，每次4粒.1日3次，对照组5-氟尿嘧啶(5-FU)0.75g/日，静滴，共5天，每21天重复。以上2组患者同时观察3个月。2、临床疗效评定标准(1)完全缓解(CR):肿瘤完全消失并持续4周以上，无病灶出现；(2)部分缓解(PR):肿瘤两径乘积减少50%以上并持续4周以上，无新病灶出现；(3)无变化(NC):肿瘤两径乘积减少50%以下或增大25%以上持续4周以上，无新病灶出现；(4)恶化(PD):肿瘤两径乘积增大25%以上或有新病灶出现。其中，CR和PR表示为有效(OR)。3、中医证候症状评定标准按治疗前后症状积分值的变化评定疗效，分为(1)临床痊愈治疗后症状消失，积分降至零；(2)显效部分症状消失，积分降低2/3以上；(3)有效症状好转，积分降低1/32/3;(4)无效无明显改善，积分不变或降低不足1/3。4、生存质量评定以Farnofsky评分评定；肿瘤标记物CEA检测采用ELISA法检测；T细胞亚群测定采用流式细胞仪技术检测。5、治疗结果(1)临床疗效治疗组完全缓解0例，部分缓解12例(占21.8%)，无变化38例(占69.1%)，恶化5例(占9.1%)，总有效率为21.8%;对照组完全缓解0例，部分缓解10例(占18.2%)，无变化31例(占56.4%)，恶化14例(占25.4%).总有效率为18.2%。(2)中医证候症状疗效治疗组对乏力、纳差、腹痛、便血、泻泄等症状的改善作用明显优于对照组，而对里急后重、消瘦等症状的改善作用不明显。(3)生存质量评分比较治疗组治疗前51.25士9.21，治疗后68.37士11.65;对照组治疗前52.44±10.17，治疗后44.28±8.52。两组治疗前生存质量评分无明显差异，治疗后治疗组FamOfskv评分明显升高，与治疗前比较有显著性差异(P<0.001);而对照组与治疗前比较明显下降(P<0.05)。表明肠复康能够提高肿瘤患者的生存质量，从而达到提高疗效之目的。(4)肿瘤标记物CEA治疗前后的比较治疗组治疗前147.88±89.27(22)，治疗后99.33±57.82(22);对照组治疗前152.62±102.38(17)，治疗后130.53±69.43(17)。2组肿瘤标记物CEA有一定程度下降，但与治疗前比较无明显差异(P>0.05)。(5)T细胞亚群变化比较治疗组治疗前CD3(%)57.89±6.25，CD4(%)35.54±8.37，CD8(%)31.36±5.86，CD4/CD81.16±1.03;治疗后CD3(%)63.38±7.67，CD4(%)42.77±7.01，CD8(%)26.75±6.95，CD4/CD81.75±0.48。对照组治疗前〇03(%)61.96±7.11，CD4(%)34.84±8.3，CD8(%)29.79±6.85，CD4/CD81.31±0.66;治疗后CD3(%)58.61±9.01，CD4(%)32.21±7.69，CD8(%)29.79±8.24，CD4/CD81.27±0.53。综上，治疗组与对照组临床疗效相近(P>0.05)，有效率分别是21.8%和18.2%;治疗组患者临床症状明显改善，体力指数(Farnofsky评分)明显升高，综上表明该药物组合物治疗大肠癌疗效确切。发明人在应用过程中发现人参与党参，薏苡仁与红藤是可以互为代用的，出于对肿瘤患者经济上的考虑，采用党参替代人参，以及采用红藤替代薏苡仁的治疗效果是一样的。因此，本发明药物组合物通常以鸦胆子5-11份、喜树果5-11份、薏苡仁8-16份、莪术8-16份、人参5-16份为原料药，但是从成本考虑，可以采用红藤替换薏苡仁，采用党参替代人参；或者也可以将红藤与薏苡仁混合使用，将党参与人参混合使用，均不影响治疗效果，但是为了保证将党参替换为人参时，最好加倍使用，即若重量配比为鸦胆子8份、喜树果8份、薏苡仁和/或红藤12份、莪术12份、人参8份时，采用党参替换，则使用如下重量配比或鸦胆子8份、喜树果8份、薏苡仁和/或红藤12份、莪术12份、党参16份。权利要求治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂鸦胆子5-11份、喜树果5-11份、薏苡仁和/或红藤8-16份、莪术8-16份、人参和/或党参5-16份。2.根据权利要求1所述的治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂鸦胆子8份、喜树果8份、薏苡仁和/或红藤12份、莪术12份、人参和/或党参8份；或鸦胆子8份、喜树果8份、薏苡仁和/或红藤12份、莪术12份、党参16份。3.根据权利要求1或2所述的治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于所述的制剂为散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、口服液、水煎剂或丸剂。4.一种治疗大肠癌的药物组合物的制备方法，其特征在于其步骤如下A、原料采用乙醇或水提取，收集提取液，备用；B、将步骤A所得提取液按照药剂学常规方法制剂。5.根据权利要求4所述的治疗大肠癌的药物组合物的制备方法，其特征在于步骤A中采用提取条件为以6-10倍量的乙醇或水提取1-3次，每次1-2.5小时。6.根据权利要求4或5所述的治疗大肠癌的药物组合物的制备方法，其特征在于步骤A中采用乙醇提取时，乙醇浓度为65-95%。7.根据权利要求4所述的治疗大肠癌的药物组合物的制备方法，其特征在于步骤B中处理提取液的方法为a、浓縮提取液，得浓縮液；b、加浓縮液3-6倍量水，静置，过滤；c、滤液浓縮，加防腐剂，调pH至6-7。全文摘要本发明属于医药领域，具体涉及一种治疗大肠癌的药物组合物及其制备方法。本发明所解决的技术问题是提供一种全新的药物组合物用于治疗大肠癌，鸦胆子5-11份、喜树果5-11份、薏苡仁和/或红藤8-16份、莪术8-16份、人参和/或党参5-16份。本发明药物组合具有清热解毒、活血散结、益气扶正等功效，在长期临床观察和系列实验研究中显示了良好的抗癌效应，尤其对大肠癌治疗效果明确。该药物组合物主治大肠癌(癌)毒瘀内阻，兼气虚者，症见腹痛，痛点固定，刺痛拒按，腹部包块，腹胀，乏力，纳差，舌质紫暗或有瘀点、瘀斑，舌苔白而腻，脉细涩。用于大肠癌或大肠癌术后辩证属(癌)毒瘀内阻，兼体虚者。文档编号A61K36/9066GK101700394SQ20091031058公开日2010年5月5日申请日期2009年11月27日优先权日2009年11月27日发明者何成诗,刘碧清,杨彦申请人:成都中医药大学