专利名称：大肠癌术后复发易感性检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及编码肌浆网/内质网钙离子ATP酶2(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase type2，SERCA2)的ATP2A2基因的二个转录本的表达比值及其与大肠癌术后复发的相关性。本发明还涉及检测ATP2A2的二个转录本的表达比值的方法和试剂盒。
背景技术：
大肠癌包括直肠癌和结肠癌，是全球第三大恶性肿瘤，全世界每年大肠癌的新发病例约为80万例，每年有50万人死于大肠癌。大肠癌是我国第四位常见恶性肿瘤，目前我国每年约有13万人新发大肠癌，其发病率正在逐年上升。上海市是我国大肠癌发病率和死亡率最高的城市，2003年大肠癌已经成为上海第二常见恶性肿瘤，而且结肠癌在大肠癌中所占的比例正逐步上升。
随着多学科综合治疗模式的广泛推广，大肠癌的治疗效果也明显改善，近年国外文献报道结肠癌根治性切除后5年生存率为60-80％；而直肠癌根治性切除后5年生存率为50-70％，但是不同病理分期大肠癌的预后存在显著的差异。I期大肠癌的5年生存率在90％以上，而对于高危II期和III期的进展期大肠癌患者而言，即使采用标准的辅助治疗手段，其5年生存率也仅在30-70％之间；因此对接受标准治疗方案的进展期大肠癌患者而言，有必要寻找更好的预后指标来进行预后判断，从而使这些患者可以接受更新的治疗方案或方法。因此预测大肠癌预后和治疗效果的分子标记物一直是研究的热点。选择性剪接是高等真核细胞在转录后水平调控基因表达以及产生蛋白质组多样性的重要机制。肿瘤癌基因、抑癌基因、肿瘤转移抑制基因可发生选择性剪接，与肿瘤发生发展关系密切。通过同一样本同一基因不同剪切本的表达比值差异寻找其乳腺癌相关性，因此个体状态差异影响最小，这比选择看家基因作为内参的相对定量研究更为有效，结果更有应用价值。
综上所述，为了准确地判断大肠癌术后的预后情况，或辅助诊断大肠癌术后复发的易感性，本领域迫切需要寻找大肠癌术后复发有关的标志物，并开发检测大肠癌术后复发的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的就是提供一种辅助诊断(尤其是尽早进行预后判断)大肠癌术后复发的方法及检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种新的检测大肠癌术后复发的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种体外(非诊断性的)检测样品编码肌浆网/内质网钙离子ATP酶2(ATP2A2)的二个转录本的表达比值的方法，它包括步骤 (a)测定样品中ATP2A2基因的转录本1和转录本2的表达量； (b)根据下式得出二个转录本的表达比值 Qt＝Q1/Q2， 式中，Qt＝样品中二个转录本的表达比值， Q1＝ATP2A2基因转录本1的表达量； Q2＝ATP2A2基因转录本2的表达量。
(c)将Qt与基准值Qc进行比较，其中Qc＝20。
在另一优选例中，步骤(a)中通过PCR方法测定表达量。
在另一优选例中，所述的转录本1具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；而转录本2具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，提供了一种方法，包括步骤 (a)测定样品中ATP2A2基因的转录本1和转录本2的表达量； (b)根据下式得出二个转录本的表达比值 Qt＝Q1/Q2， 式中，Qt＝样品中二个转录本的表达比值， Q1＝ATP2A2基因转录本1的表达量； Q2＝ATP2A2基因转录本2的表达量。
(c)将Qt与基准值Qc进行比较，其中Qc＝20， 其中，所述的转录本1具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；而转录本2具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种检测大肠癌术后复发易感性的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增ATP2A2转录本1和ATP2A2转录本2的引物，所述的引物扩增出长度为100-2000bp的扩增产物。
在另一优选例中，所述的转录本1具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；而转录本2具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的引物包括 (i)具有SEQ ID NO2和3所示核苷酸序列的、用于转录本1的引物；和 (ii)具有SEQ ID NO5和6所示核苷酸序列的、用于转录本2的引物。
在本发明的第三方面，提供了一种对个体的大肠癌术后复发易感性进行辅助性诊断的方法，它包括步骤 (a)检测该个体的ATP2A2基因中转录本1和转录本2，并根据下式得出二个转录本的表达比值 Qt＝Q1/Q2， 式中，Qt＝样品中二个转录本的表达比值， Q1＝ATP2A2基因转录本1的表达量； Q2＝ATP2A2基因转录本2的表达量； (b)将Qt与对照值Qc进行比较，当Qt小于Qc时就就表明该个体大肠癌术后复发的可能性高(如大于40％，较佳地大于50％)。
在另一优选例中，所述的转录本1具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；而转录本2具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
在本发明的第四方面，提供了一种ATP2A2基因转录本1和ATP2A2基因转录本2的用途，其中所述的转录本1具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；而转录本2具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，其特征在于，它们被用于制备检测大肠癌术后复发易感性的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的试剂是以下引物 (i)具有SEQ ID NO2和3所示核苷酸序列的、用于转录本1的引物；和 (ii)具有SEQ ID NO5和6所示核苷酸序列的、用于转录本2的引物； 或者所述的试剂盒包括以下引物 (i)具有SEQ ID NO2和3所示核苷酸序列的、用于转录本1的引物；和 (ii)具有SEQ ID NO5和6核苷酸序列的、用于转录本2的引物。
在另一优选例，所述的检测样品来自于人。
具体实施例方式 本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的进行了测定和分析。首次发现和证明了ATP2A2的二个转录本的表达比值与大肠癌术后复发密切相关，该比值在高复发组和低复发组中的分布存在显著性差异(P＜0.05)，因此可作为辅助性检测大肠癌术后复发(或其易感性)的特异性指标。在此基础上完成了本发明。
具体而言，当转录本1与转录本2的比值小于20，发生术后复发的可能性远大于转录本1与转录本2的比值大于20的人群。
ATP2A2基因 ATP2A2基因编码肌浆网/内质网钙离子ATP酶2(sarco/endoplasmicreticulum Ca2+ATPase type2，SERCA2)，它是一种钙泵，负责调节细胞内钙离子的浓度，在维持细胞钙离子信号传导上起到关键作用。ATP2A2的序列是已知，其详细序列和一些相关信息可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/。为了方便起见，在SEQ ID NO1和4给出ATP2A2中转录本1和转录本2的相关核苷酸序列。
ATP2A2也称为“ATPase，Ca++transporting，cardiac muscle，slowtwitch 2”。
ATP2A2缺乏可以引起疣状肢端角化症(acrokeratosis verruciformis)和达里耶病(Darier disease，毛囊角化病)。迄今为止所报道的ATP2A2基因突变超过140多种，包括错义突变、无义突变、同义突变、剪切位点突变、移码突变、单个碱基缺失或插入及动态突变等，但是对于ATP2A2基因而言没有所谓的热点突变，这些突变位点分散在整个ATP2A2基因中。同时有报道称ATP2A2基因突变可能与肺癌和肠癌有一定相关性，但未见通过ATP2A2基因2个转录本比值来鉴定疾病相关报道。
本发明人对ATP2A2基因研究过程中，意外发现了ATP2A2的二个转录本的表达比值是与大肠癌术后复发易感性关联性非常高的标志。具体而言，当转录本1与转录本2的比值小于20时，发生术后复发的可能性远大于转录本1与转录本2的比值大于20的人群，其中小于20的病人发生了复发率大于50％，而大于20复发率小于25％。
基于本发明的新发现，ATP2A2的二个转录本有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)用于辅助性判断或辅助诊断大肠癌术后复发，和用于制备检测大肠癌术后复发易感性的试剂或试剂盒。
ATP2A2蛋白的多聚核苷酸可用于大肠癌术后复发易感性的辅助诊断。在诊断方面，ATP2A2蛋白的多聚核苷酸可用于检测ATP2A2的转录本1和转录本2的表达量，并据此判断表达量比值。如ATP2A2 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断ATP2A2的表达量。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用ATP2A2蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测ATP2A2蛋白的转录产物。
最方便的检测本发明ATP2A2的二个转录本的表达比值的方法，是通过用ATP2A2基因特异性引物扩增样品的ATP2A2 mRNA，得到扩增产物；然后测定二个转录本的表达比值。
应理解，在本发明首次揭示了ATP2A2基因的二个转录本的表达比值与大肠癌术后复发的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增ATP2A2的二个转录本的引物，进而得出表达比值。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5′端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物对应于ATP2A2的二个转录本。种优选的引物对具有SEQ ID NO2-3(用于转录本1)，以及SEQ ID NO5-6(用于转录本2)的序列。
虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-2000bp，较佳地为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。
由于本发明的ATP2A2的二个转录本的表达比值与大肠癌术后复发具有非常高的关联性，因此不仅可用于在手术之前就早期辅助性判断或辅助诊断大肠癌术后复发，而且可以未雨绸缪地使一些携带者采取合理的预防和治疗措施，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。当然，复发与否最终还应当用常规检测方法进行确诊。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 1.1研究对象 病例样本全部收集具有随访资料的39例2004年手术的结直肠癌冰冻组织。对照样本选自南方中心样本库中年龄、性别匹配，无结肠癌病史的个体。
在知情同意的基础上随机收集了39个病人和40个正常对照个体的结肠样本。
1.2实验方法和结果 ATP2A2具有两个转录本(NM_170665.2，转录本1，SEQ ID NO1；NM_001681.2，转录本2，SEQ ID NO4)。
根据GenBank中ATP2A2的核酸序列，设计和合成以下引物。具体引物如下表1所示。其中SEQ ID NO2和3所示的引物用于扩增转录本1(SEQ ID NO1)；SEQID NO5和6所示的引物用于扩增检测转录本2(SEQ ID NO4) 表1引物序列表 对于收集的具有随访资料的39例2004年手术的结直肠癌冰冻组织，抽提采组织RNA，反转录扩增获得cDNA，通过引物1、2获得检测转录本1(SEQ ID NO1)；通过引物3、4获得检测转录本2(SEQ ID NO4)(PCR反应条件95℃15min；94℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，30cyc；72℃7min，4℃∞)。
纯化PCR产物，通过标准DNA进行精确定量，建立标准曲线，通过实时荧光定量PCR检测组织标本中ATP2A2两个转录本的表达量(实时荧光定量PCR反应条件50℃2min；95℃10min；95℃15sec，57℃30sec，72℃30sec并信号收集，40cyc；95℃15sec，60℃15sec，95℃15sec，60℃上升至95℃过程中进行信号收集)，按以下方法确定二个转录本的表达比值 Qt＝Q1/Q2， 式中，Qt＝样品中二个转录本的表达比值， Q1＝ATP2A2基因转录本1的表达量； Q2＝ATP2A2基因转录本2的表达量。
结果 首次发现两个转录本的mRNA表达量的比值Qt与结直肠癌进展密切相关，转录本1和转录本2的比值低的样本发生复发转移显著高于比值高的样本(p＝0.033)。
实施例2 数据分析 对于实施例1中获得的测试数据，通过受试者工作特征曲线(receiveoperating characteristic curve，ROC曲线)，选择20作为转录本1和转录本2表达比值的切点，进行进一步分析。
结果表明，当小于20的时候64.7％的病人发生了复发和转移(11/17)，当大于20的时候只有27.3％的病人发生了复发和转移(6/22)，比值比4.889(95％CI，1.246-19.190，p＝0.019)。
这表明，将参照对照Qc确定为20非常合适。
实施例3 分支链DNA信号放大技术测定 基于表1的引物(SEQ ID NO2-3和5-6)，应用分支链DNA信号放大技术(B-DNA技术)，不经PCR，定量检测新鲜标本或石蜡包埋组织样本ATP2A2两个转录本。通过转录本1和转录本2表达比值对预后进行判断。
结果表明，当两个转录本的mRNA表达量的比值Qt大于20时，转录本1和转录本2的比值低的样本发生复发转移显著高于比值高的样本(p＝0.033)。
实施例4 大肠癌术后复发易感性检测试剂盒 如实施例1所述，转录本1和转录本2的比值与大肠癌术后复发易感性相关，因此可据此设计合成引物，以病人的RNA为模板进行检测。
制备一试剂盒(100人次)，它含有
随机挑选50个人构成的测试组，其中包括未知是否大肠癌术后复发的对象、已知大肠癌术后复发病人、经检测至随访时无大肠癌术后复发病人、和正常人(5个)。
按实施例1的方法从结肠样品中抽提RNA，然后按以下方法确定二个转录本的表达比值 Qt＝Q1/Q2， 式中，Qt＝样品中二个转录本的表达比值， Q1＝ATP2A2基因转录本1的表达量； Q2＝ATP2A2基因转录本2的表达量。
检测结果 当Qt小于20的时候，63％的病人发生了复发和转移(19/30)，当大于20的时候只有24％的病人发生了复发和转移(5/25)。
因此，这表明通过检测ATP2A2的基因转录本1和转录本2的表达量比值Qt，可进行大肠癌术后复发的辅助性检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海人类基因组研究中心
复旦大学附属肿瘤医院
<120>大肠癌术后复发易感性检测方法和试剂盒
<130>081329
<160>6
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>145
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
actcgcttgt gcagaaaaca ttgttccaga ttcaatcgac tgggtttatg tcccttcaca 60
tagtttttaa ggttatttat ttaaatgtct aatgtatttt attgtaacag acattgtttt 120
gccaacattg cctatttcag tggca145
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>2
actcgcttgt gcagaaaaca 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>3
tgccactgaa ataggcaatg 20
<210>4
<211>197
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
tctaccaacc ctgtgcatga ctgatgttgg ggaaaaagaa aagtaaaaaa cttcccaact 60
cactttgtgt tatgtggagg aaatgtgtat taccaatggg gttgttagct tttaaatcaa120
aatactgatt acagatgtac aatttagctt aatcagaaag cctctccaga gaagtttggt180
ttctttgctg caagagg 197
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>5
tctaccaacc ctgtgcatga20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>6
cctcttgcag caaagaaacc20
权利要求
1.一种体外检测样品编码肌浆网/内质网钙离子ATP酶2(ATP2A2)的二个转录本的表达比值的方法，其特征在于，包括步骤
(a)测定样品中ATP2A2基因的转录本1和转录本2的表达量；
(b)根据下式得出二个转录本的表达比值
Qt＝Q1/Q2，
式中，Qt＝样品中二个转录本的表达比值，
Q1＝ATP2A2基因转录本1的表达量；
Q2＝ATP2A2基因转录本2的表达量。
(c)将Qt与基准值Qc进行比较，其中Qc＝20。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中通过PCR方法测定表达量。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转录本1具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；而转录本2具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
4.一种检测大肠癌术后复发易感性的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增ATP2A2转录本1和ATP2A2转录本2的引物，所述的引物扩增出长度为100-2000bp的扩增产物。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的转录本1具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；而转录本2具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物包括
(i)具有SEQ ID NO2和3所示核苷酸序列的、用于转录本1的引物；和
(ii)具有SEQ ID NO5和6所示核苷酸序列的、用于转录本2的引物。
7.一种对个体的大肠癌术后复发易感性进行辅助性诊断的方法，其特征在于，它包括步骤
(a)检测该个体的ATP2A2基因中转录本1和转录本2，并根据下式得出二个转录本的表达比值
Qt＝Q1/Q2，
式中，Qt＝样品中二个转录本的表达比值，
Q1＝ATP2A2基因转录本1的表达量；
Q2＝ATP2A2基因转录本2的表达量；
(b)将Qt与对照值Qc进行比较，当Qt小于Qc时就就表明该个体大肠癌术后复发的可能性高(如大于40％，较佳地大于50％)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的转录本1具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；而转录本2具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
9.一种ATP2A2基因转录本1和ATP2A2基因转录本2的用途，其中所述的转录本1具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；而转录本2具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，其特征在于，它们被用于制备检测大肠癌术后复发易感性的试剂或试剂盒。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的试剂是以下引物
(i)具有SEQ ID NO2和3所示核苷酸序列的、用于转录本1的引物；和
(ii)具有SEQ ID NO5和6所示核苷酸序列的、用于转录本2的引物；或者所述的试剂盒包括以下引物
(i)具有SEQ ID NO2和3所示核苷酸序列的、用于转录本1的引物；和
(ii)具有SEQ ID NO5和6核苷酸序列的、用于转录本2的引物。
全文摘要
本发明公开了一种检测大肠癌术后复发易感性的方法，它包括检测个体的编码肌浆网/内质网钙离子ATP酶2(ATP2A2)的二个转录本的表达比值，并与正常人群的表达比值相比，个体的表达比值低于正常人群的表达比值就表明该个体大肠癌术后复发的可能性较高。本发明还公开了相应的检测试剂盒。
文档编号C12N15/11GK101608231SQ20081003928
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者薇 黄, 蔡三军, 王志敏, 烨 徐, 彭俊杰, 王海丰 申请人:上海人类基因组研究中心, 复旦大学附属肿瘤医院