专利名称：大肠癌遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体大肠癌遗传易感性的试剂盒， 通过同时检测与大肠癌密切相关的5， 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、谷胱甘肽硫转移酶T1基因 (GSTT1)、谷胱甘肽硫转移酶M1基因(GSTM1)、细胞色素P450 2E1基因(CYP2E1)、错配修fe基因(hMLHl) 上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体大肠癌遗传易感性。
背景技术：
大肠癌为结肠癌和直肠癌的总称，指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的癌变， 是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率较高。当癌细胞繁殖时，光滑的肠壁变得粗糙、肿大及变硬，最后发生 溃疡。溃疡区容易出血或发展成一个狭窄区，妨碍排便。如果任由这种情形发展下去，癌细胞会沿着肠壁 扩散，并通过它扩散至邻近腹部器官，还可能进入血液循环，从而扩散到身体其它部分。
..MTHFR的主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有重要生物学功能的5-甲基 四氢叶酸。大肠癌受多种因素影响，其中叶酸水平高低对大肠癌易感性影响较大。当MTHFR基因变异时， 叶酸代谢通路发生改变，并且与叶酸摄入水平协同作用，导致大肠癌易感性也随之发生变化。MTHFR基 因第5号外显子上的一个C/T多态位点(C677T)突变，导致蛋白第222个氨基酸由Ala(A)变为Val(V)。 该多态位点的基因型有CC、 CT、 TT，其中CC被确定为风险基因型，与大肠癌的患病风险有关。在叶酸 水平足够高，能够满足机体进行必须的DNA和蛋白质甲基化的基础上，当携带风B佥基因型(CC)时，与 TT基因型相比，MTHFR耐热性增强，酶活性增强，有利于5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸。 5,10-亚甲基四氢叶酸的量减少不利于dUMP转变成dTMP,导致DNA合成中可能会掺入碱基U(阻碍DNA 合成)。DNA分子中的U碱基容易被一些酶剪切，从而造成DNA损伤。此时，大肠癌发生风险上升。
GSTM1酶活性的降低或缺火会增强个体对氧化应激产物和致癌物质的敏感性，使机体容易发生氧化 应激损伤和各种癌变。该基因的多态性与酶活性的改变有关，因此也与各种炎症及癌症有关，其中包括肺 癌、慢性胰腺炎、头颈癌、肝癌和大肠癌等。Null/Present是GSTM1常见的多态性，该多态有二种基冈型， +/+、 +/_和-/-，分别代表无等位基因缺失，缺失一个等位基因，缺失两个等位基因(完全缺失型)，其中完 全缺火型与火肠癌的发病相关。当GSTM1基因发生完全缺失时，人肠上皮细胞内无GSTM1表达，因此 也无GSTM1的解毒活性，造成环境毒素和致癌物质堆积，易发生DNA突变和染色体畸变，患大肠癌的 风险闪此显著增加。
GSTT1酶活性的降低或缺失会增加个体对氧化应激产物和致癌物质的敏感性，使机体容易发生氧化应 激损伤和各种癌变。该基因的多态性与酶活性的改变有关，冈此也与各种炎症及癌症有关，其中包括多发 性硬化(MDS)、再生障碍性贫血、白血病、宫颈癌、乳腺癌等。在结肠和直肠上皮细胞中，GSTT1也是最 重要的解毒酶之一，与GSTM1之间有相互补偿作用，所以GSTT1基闪多态性ili'是大肠癌的风险闵素。 基因缺失(Null)是GSTT1常见的多态位点之一，该多态导致GSTT1酶活性显著下降。该位点有三种基因 艰，+/+、 +/-、 -/-，分别代表无等位基因缺失、缺失一个等位基因，缺失两个等位基闪(完全缺失型)，其 中完全缺失型与大肠癌的发生有关。当GSTT1基因发生完全缺失时，大肠上皮细胞内无GSTT1表达，因 此也无GSTT1的解毒活性，造成环境毒素和致癌物质积累，易发生DNA突变和染色体畸变，患火肠癌的 风险因此显著增加。
CYP2E1是细胞色素P450(CYP450)家族的一员，是药物代谢的核心体系成员之一。CYP2E1基因上的 Rsa f(C-1053T)多态位点，位T CYP2E1基因的启动于区域，等位基因用cl和c2表示。cl等位基因存在 Rsa I的酶切位点，c2等位基闪时Rsa I酶切位点消失。该基闪位点多态有cl/cl(CC)、 cl/c2(CT)和c2/c2(TT) 三种基因型，其中c2/c2基因型与大肠癌的发生有关。Rsal位点多态会影响基因的转录调节，c2邻位基因 使得CYP2E1转录增加，CYP2E1表达也随之增加，激活更多的致癌物，易导致大肠上皮细胞癌变。因此， 当携带风险基因型(c2/c2)时，大肠癌发生风险上升。
hMLHl基闪是错配修复基闪中的一种，参与DNA复制过程中碱基错配修复通路，具有错配识别和指 导随后的修复过程的作用。hMLH]基因缺陷可导致部分癌基因及抑癌基因突变，,',引发癌症。目前研究最多的是该基闪在消化道癌症中的作用，特别是:人肠癌。有研究表明，50-70%的遗传性非息肉病性结直肠癌 (HNPCC)病人有可鉴别的hMLH 1和hMSH2突变，而近20%的散发性大肠癌存在hMLH 1突变。位于hMLH 1 基闪第12号外显子上的T1151A多态位点，引起编码蛋A的第384个氨基酸由Val[V]变为Asp[D]。该多 态位点存在三种基因型TT、 TA禾I1AA,其中AA基因型为风险基因型。当携带风险基因型(AA)时， hMLHl蛋白空间构象改变，基冈损伤修复功能受到影响，火肠癌的患病风险增火。
发明内容
基于5， 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、谷胱甘肽硫转移酶T1基因(GSTT1)、谷胱甘肽硫转 移酶M1基因(GSTM1)、细胞色素P450 2E1基因(CYP2E1)、错配修复基因(hMLHl)上的5个SNP位点多态 性可用来评估个体大肠癌遗传易感性的基础上，本发明提供一种检测个体大肠癌遗传易感性的试剂盒。
该试剂盒包括
检测MTHFR基因上C677T SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测GSTT1基因上SNP多态性基因型的电泳检测引物对； 检测GSTM1基因上SNP多态性基因型的电泳检测引物对； 、 检测CYP2E1基因上Rsa I SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； .检测hMLHl基因上T1151A SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、去离子水等)； 荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。 本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常规的合成技术进行合成。 本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探绅，对可用常规的探针合成 技术进行合成。 " 本发明试剂盒的组分和含量包括
1. 荧光定量PCR反应套装
10 X荧光定量PCR反应缓冲液3nl，
25mM dNTP混合液0.3 pl，
25mM MgC12溶液1. 8^1，
5units/nl Taq DNA聚合酶0.075^1，
20HM特异性引物对每条引物各0.225^1，
IOMM特异性荧光探针对每条探针各0.25Ul，
去离子水15.975^1。
2. 电泳检测套装
10X PCR反应缓冲液2.5nl， 25mM dNTP混合液0. 2^1, 25mM MgCh溶液1.5^1， 5units/nl Taq DNA聚合酶0.125^1， 20nM电泳检测引物对每条引物各0. 25^1， 去离子水18. 675^1, 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2:电泳检测分型
使用检测试剂盒中的电泳检测套装，反应的体系为总体积25pl，包含浓度为12. 5ng/nl的DNA模板. 1^1、 IOXPCR反应缓冲液2.5^1， 25mMdNTP混合液0.2^1， 25mMMgC12溶液1.5^1， 5units/nl Taq DNA 聚合酶0.125^1， 20nM电泳检测引物对每条引物各0.25jil，去离子水18.675^1。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94°C、 12分钟，进行30个循环的94°C、 30秒，60°C、 30秒， 72°C、 30秒，然后进行72。C、 IO分钟。
然后利用电泳技术，进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带数量。
步骤3:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，分别进行3次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为 总体积1(^1,包含浓度为20ngAi1的DNA模板2^1、 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1^1 25mM dNTP 混合液、0.6^il 25mM MgCh溶液、0. 025nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20-的有义引物和反义引物 各0.225nl、 10pM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25^1,去离子水5. 325^1。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95°C、 IO分钟，进行60个循环的95°C、 30秒， 60'C、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤4:基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉电泳检测技术的本领域技术人员能够通过辨识电泳图上DNA条带的位置和数量来确定所检测的 SNP位点的基因型。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检测试剂盒进行个体大肠癌遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的GSTT1基因和GSTM1基因上的SNP位点进行PCR. 扩增和电泳检测，对MTHFR基因上C677T SNP位点、CYP2E1基因上Rsa I SNP位点、hMLHl基因上T1151A SNP 位点进行荧光定量PCR检测，确定这5个SNP位点的基因型。
步骤3:个体大肠癌遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体大肠癌遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被 检测者大肠癌遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体大肠癌遗传易感性分析报告单。
权利要求
1.一种检测个体大肠癌遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上C677T SNP位点、谷胱甘肽硫转移酶T1基因(GSTT1)上SNP位点、谷胱甘肽硫转移酶M1基因(GSTM1)上SNP位点、细胞色素P4502E1基因(CYP2E1)上Rsa I SNP位点、错配修复基因(hMLH1)上T1151A SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括1) 荧光定量PCR反应套装IOX荧光定量PCR反应缓冲液3W，25raMdNTP混合液0. 3W， 25mMMgC12 溶液1.8W， 5unitsM Taq DNA聚合酶0.075W, 20ffl特异性引物对每条引物各0.225W， IOHM特异 性荧光探针对每条探针各0. 25^1，去离子水15. 975W。2) PCR反应套装:IOXPCR反应缓冲液2. 5W， 25mM dNTP混合液0. 2W， 25mMMgC12溶液1.5^1， 5unitsA4 Taq DNA聚合酶0. 125W， 2(Ml特异性引物对每条引物各0.25W,去离子水18.675W。 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
全文摘要
本发明公开了一种检测大肠癌遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、谷胱甘肽硫转移酶T1基因(GSTT1)、谷胱甘肽硫转移酶M1基因(GSTM1)、细胞色素P450 2E1基因(CYP2E1)、错配修复基因(hMLH1)的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与大肠癌遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体大肠癌遗传风险。
文档编号C12Q1/68GK101608224SQ20081003926
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司