专利名称：一种大肠癌术后辅助治疗的中药组合物的制作方法
一种大肠癌术后辅助治疗的中药组合物
技术领域：
本发明属于运用传统中医理论，在长期临床实践的基础上寻找出ー种中药组合物对大肠癌术后进行辅助治疗的同时，亦能減少化疗药物的副作用的传统医药应用领域。
背景技木目前手术是治疗大肠癌的首选治疗手段，但大肠癌具有较高的术后转移和复发率，除部分早期患者外，均需接受化疗。化疗固然可消灭患者体内的微小转移病变，増加治愈机会，但化疗药物在杀灭肿瘤细胞的同时对正常细胞亦有损伤，故急需运用传统医学理论来寻找ー种中药，在治疗大肠癌术后的同时，亦能明显减少化疗不良反应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是根据传统医学理论，寻找一种对大肠癌术后既有治疗作用，同时又能明显减少不良反应的中药组合物。中医认为大肠癌的发病多为外感六淫、内伤七情、饮食失节、正气亏虚。即本病病位在大肠，发病和脾肾密切相关，脾肾亏虚为主要发病机制，是ー种全身属虚、局部属实的疾病。脾虚、肾亏、正气不足为病之本；湿热火毒、痰毒瘀血为病之标，从中医扶正固本的角度来对大肠癌术后进行辅助治疗。为解决以上问题，本发明采取如下的技术方案选取中药材人參500-700g、白花蛇舌草900-1200g、莪术500_700g、蜣螂虫150-250g、八月炸500-700g ;制得本发明的中药组合物颗粒。本方是在中医药理论指导下的临床验方，经多年临床实践证实疗效良好。
图1-1倒置显微镜下观察FFCT对人结肠癌细胞SW480形态上产生的影响(X400)(细胞分别在空白对照(A)、8. 75mg · mL-Ι的FFCT(B)中和50. 00 μ g · mL-Ι的5-Fu(C)中培育36h)图1-2不同浓度的FFCT对人结肠癌细胞SW480细胞周期的影响(细胞在空白对照(A)或者12. 50mg · Inr1FFCT(B)中培育14h后，PI染色分析)图1-3FFCT对人结肠癌细胞SW480细胞周期的影响(细胞在8. 75mg ·πιじ1的FFCT中分别培育O (A)或ISh(B)后，PI染色分析)图1-4 MTT染色法观察经FFCT培育后的人结肠癌细胞SW480 (Χ400)(细胞分别在空白对照(A)、8. 75mg · mじ1的FFCT(B)中和50. 00 μ g · mじ1的5-Fu(C)中培育36h)图1-5经FFCT作用后的人结肠癌细胞SW480的凋亡情况(细胞分别在空白对照(A)和8. 75mg · Inr1FFCT (B)中培育36h，然后用Annexin V/PI法测细胞凋亡)图2-1经FFCT作用不同时间后SW480结肠癌细胞内caspase-3的活性图2-2经Ac-DEVD-CHO与FFCT共同培育后的人结肠癌细胞凋亡情况(细胞分别在空白对照(A)和含有50 μ M Ac-DEVD-CHO以及8. 75mg · mじ1FFCT的培养液⑶中培育36h，然后用Annexin V/PI法测细胞凋亡)
具体实施方式实施例I抑制人结肠癌SW480细胞增殖的实验研究I. I主要实验材料
I. I. I实验细胞人结肠癌细胞SW480 :购自中科院上海细胞生物研究所。按常规方法进行培养，即用含10%胎牛血清、100U ·πιじ1青霉素、100U ·πιじ1链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37°C，5%C02培养箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。I. I. 2药物与试剂大肠癌术后辅助治疗的中药组合物(以下简称FFCT)，由人參500g、白花蛇舌草900g、莪术500g、螺螂虫150g、八月炸500g的配比组成，清膏2. 5g生药· mじ1,批号20071112 ；5-氟尿嘧啶(5-Fu):天津金耀氨基酸有限公司，O. 025g · πι Λ批号0710052 ；RPMI 1640 培养基Gibco 公司；胎牛血清Gibco公司；胰蛋白酶Amresco公司；噻唑蓝(MTT):Sigma 公司；ニ甲基亚砜(DMSO):上海凌峰化学试剂有限公司，批号060514 ；碘化丙碇(PI) =Sigma公司，配置方法将PI粉末溶解于去离子水中，配制成10. OOmg · mじ1，取 500. 00μ g · mじ1 加上 100μ L Triton X-100, EDTA 3. 70mg、适量 PBS 稀释成10mL，配制成PI储备液，4°C避光保存。临用时取出，用9倍PBS稀释，再加入终浓度为25. 00 μ g · mL 1 的 RNase A ；Triton X-100 :Amresco,南京博金科技有限公司分装；Annexin V/PI 试剂盒Beckton Dickinson 公司；其他试剂均为市售分析纯。I. I. 3主要仪器SW-CJ-2FD医用型净化工作台苏净集団安泰公司；BB6220三气培养箱Heraeus公司；Axiovert 200倒置显微镜及显微图像系统Zeiss公司；全波长酶标仪Themo公司；PB303-N电子精密天平=Mettler-Toledo仪器(上海)有限公司；Labofage 400R型高速冷冻离心机Heraeus公司；Allegra 21R型高速冷冻离心机Backman公司；FACSCanto 流式细胞仪Beckton Dickinson 公司。I. 2实验方法I. 2. I FFCT及阳性药的加药前处理取FFCT煎煮液(含生药2. 50g · mじ1，批号20071112)，加入一定量的PBS，超声30min,离心(IOOOOr · mirT1，IOmin),取上清液，PBS稀释为125. OOmg · mLベ,高温高压灭菌，加入4°C冰箱保存备用，临用时用培养基进行1:0. 7梯度稀释，作为不加DMSO的供试样品。另取FFCT煎煮液(含生药2. 50g*mじ1，批号20071112)，先加入一定量的DMSO溶解，超声30min，离心(IOOOOr · min' IOmin)，取上清液，再加入一定量的PBS，使DMSO含量约2%，FFCT浓度为125. OOmg · mじ1，0. 22 μ m滤器过滤除菌，4°C冰箱保存备用，用培养基进行1:0. 7梯度稀释，作为加DMSO助溶的供试样品。阳性药5-Fu用PBS稀释为500. OOyg ·πιじ1。此时各组药物浓度应为加药终 浓度的10倍。I. 2. 2 FFCT对结肠癌细胞的细胞增殖抑制作用(MTT法)I. 2. 2. I比较加DMSO助溶的FFCT与不加DMSO助溶的FFCT对结肠癌细胞的增殖抑制作用由于FFCT粗提物中水/醇不溶性成分较多，故用此方法考察这些不溶性成分对于结肠癌细胞是否具有直接的细胞毒作用。取对数生长期大肠癌细胞，常规胰酶消化制成单细胞悬液，并以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液稀释至5 X IO4个·ι じ1，接种于96孔板上，每孔0. ImL0置37。。，5%C02培养箱中培养24h后，弃原培养液，按10%终体积加药，使含药终浓度分别为12. 50、8. 75、6. 13,4. 29mg · mじ1和分别含有DMSO的上述各浓度的含药培养液，另设空白对照组以及
0.2%DMS0的对照组。每组设置6个复孔。另设不同浓度的药物空白对照(即不含细胞，仅含对应的溶液)，以消除样品颜色的干扰。作用72h后，每孔加MTT 10 μ L (5. OOmg · mじ1)继续培养4h，小心吸去上清，加入DMSO 100 μ L，轻轻振荡IOmin后用酶标仪进行測定，測定波长为570nm，參考波长690nm，重复3次实验。按下式计算抑制率抑制率(%)=(对照孔A值-给药组A值)X 100/对照孔A值 (式1_1)由实验结果选择加或不加DMSO助溶进行下面的实验研究。I. 2. 2. 2 FFCT对结肠癌细胞生长的影响按上面的方法加入含不同浓度FFCT的培养液进行SW480细胞的培养，使含药终浓度分别为12. 50,8. 75,6. 13,4. 29和3. OOmg · mじ1，另设空白对照组以及终浓度为50. OOyg ·πιじ1的5-Fu为阳性对照组，每组设置6个复孔。分别培养24h、48h、72h后，每孔加MTT 10. 00 μ L (5. OOmg · mじ1)，继续培养4h后，按上法进行MTT法測定。实验重复3次。按(式1-1)计算抑制率。I. 2. 3 FFCT对结肠癌细胞周期的影响I. 2. 3. I不同浓度的FFCT对结肠癌细胞周期的影响取对数生长期大肠癌细胞，常规胰酶消化制成单细胞悬液，并以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整至I X IO5个·πιじ1，接种于25mL培养瓶中，每瓶2mL。置37°C，5%C02培养箱中培养24h后，弃原培养液，设置4个不同浓度的FFCT组，加入0. 4mL各浓度FFCT稀释液与3. 6mL的RPMI 1640培养液，使含药终浓度分别为12. 50,8. 75,6. 13,4. 29mg · mじ1。另设空白对照组、阳性对照组和阳性对照组(50. OOyg- mじ1)。置37°C，5%C02的培养箱中培养14h后，离心(SOOr^mirr1Jmin)弃上清，收获细胞，PBS洗涤弃上清，再加入PBS，400目尼龙布过滤，再离心(800r · mirT1，5min)弃上清，收获细胞，加入PI染色液，室温避光孵育lh，流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次。
I. 2. 3. 2同一浓度的FFCT在不同的作用时间下对结肠癌细胞周期的影响取对数生长期大肠癌细胞，常规胰酶消化制成单细胞悬液，并以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整至1父105个*111じ1，接种于25111し培养瓶中，每瓶2111し置37°C，5%C02培养箱中培养24h后，弃原培养液，设置5个不同作用时间的FFCT组，含药终浓度为8. 75mg · ml/1。另设空白对照组和阳性对照组(50. OOyg* mじ1)。置37 °C，5%C02的培养箱中培养18h后，离心(800r · min—1，5min)弃上清，收获细胞，PBS洗涤弃上清，再加入PBS,400目尼龙布过滤，再离心(800r · min' 5min)，弃上清，收获细胞，加入PI染色液，室温避光孵育lh，流式细胞仪检测细胞周期。Modfit分析细胞周期。实验重复3次。I. 2. 4 FFCT诱导结肠癌细胞凋亡的研究I. 2. 4. I MTT染色法观察细胞凋亡后的形态取对数生长期大肠癌细胞，常规胰酶消化制成单细胞悬液，并以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整至5X IO4个·πιじ1，接种于96孔板上，每孔O. lmL。置37。。， 5%C02培养箱中培养24h后，弃原培养液，设置空白对照组、FFCT组(8. 75mg · mじ1)、阳性对照组(50. OOyg* mじ1)。每组各设3个复孔。置37°C，5%C02培养箱中培养36h后，每孔
10μ L (5. OOmg · mじ1)，继续培养4h，倒置显微镜下观察。I. 2. 4. 2 Annexin V/PI 法测 SW480 结肠癌细胞凋亡取对数生长期大肠癌细胞，常规胰酶消化制成单细胞悬液，并以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整至1父105个*111じ1，接种于25111し培养瓶中，每瓶2111し置37°C，5%C02培养箱中培养24h后，弃原培养液，设置空白对照组、4. 29mg · mじ1FFCT加药36h组、6. 13mg .Hir1FFCT 加药 36h 组、8. 75mg .mじ1FFCT 加药 36h 组、8. 75mg .mじ1FFCT 加药 24h 组、8. 75mg · mじ1FFCT加药12h组、以及50. 00 μ g · mじ15_Fu阳性对照组。收集各组细胞，离心(800r · min^1, 5min)弃上清，收获细胞，PBS洗涤弃上清，再加入PBS，400目尼龙布过滤，再离心(800r5min),弃上清，收获细胞,按照Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(BecktonDickinson)说明书操作。分析Annexin V+/PI_ (早期凋亡细胞)的百分比以及Annexin V+/PI+ (晩期凋亡和死亡细胞)的百分比。实验重复3次。I. 2. 5数据分析实验结果均以均数土标准差(;土 )表示，应用SPSS 11. O进行数据统计学处理。I. 3实验结果I. 3. I FFCT对结肠癌细胞的细胞增殖抑制作用采用MTT比值法I. 3. I. I比较加DMSO助溶的FFCT与不加DMSO的FFCT对结肠癌细胞的细胞毒作用结果见表1-1，加DMSO助溶的FFCT与不加DMSO的FFCT对结肠癌细胞SW480的增殖抑制率相仿，可见FFCT抑制SW480细胞的主要活性组份是其水/醇溶性部位。表1-1加O. 2%DMS0助溶的FFCT与不加DMSO的FFCT对人结肠癌细胞SW480的细胞作用72h后所产生的细胞增殖抑制作用(J±i n=3)
权利要求
1.一种中药组合物在制备大肠癌术后辅助治疗药物中的应用，其特征为该中药组合物由以下中药材组成人参500-700g、白花蛇舌草900-1200g、莪术500_700g、蜣螂虫150-250g、八月炸 500-700g。
2.如权利要求I所述的一种中药组合物在制备大肠癌术后辅助治疗药物中的应用，其特征为药物剂型为颗粒剂。
全文摘要
本发明属于运用传统中医理论，在长期临床实践的基础上寻找出一种中药组合物对大肠癌术后进行辅助治疗的同时，亦能减少化疗药物的副作用的传统医药应用领域。本发明采取如下的技术方案选取中药材人参500-700g、白花蛇舌草900-1200g、莪术500-700g、蜣螂虫150-250g、八月炸500-700g；制得本发明的中药组合物颗粒。本方是在中医药理论指导下的临床验方，经多年临床实践证实疗效良好，现代药理、病理实验的数据经过统计学分析亦表明本方对大肠癌术后进行的辅助治疗确实有疗效。
文档编号A61P37/04GK102727828SQ20121021989
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者丁永芳, 丁蓉, 李灵常, 沈明勤, 王小宁, 霍介格, 黄一平 申请人:江苏省中医药研究院