专利名称：肝癌遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体肝癌遗传易感性的试剂盒， 通过同时检测与肝癌密切相关的细胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)、微粒体环氧化物酶基因(EPHX1)、谷 胱甘肽硫转移酶M1基因(GSTM1)和谷胱甘肽硫转移酶T1基因(GSTT1)上的单核苷酸多态性位点基因型. 来评估个体肝癌遗传易感性。
背景技术：
肝癌是由于肝脏受外界环境中的各种有害因素(主要是化学致癌物)和体内某些致癌物的长期作用， 使肝细胞或胆管上皮细胞等发生过度增生，导致正常结构遭受破坏而形成的一种恶、性肿瘤。肝癌是我国常 见的恶性肿瘤之一，是位居第二的癌症"杀手"，常见于中年男性，高发年龄为40 49岁，男女发病之比 为6:1。肝癌的平均病程是两年半，但其早期症状不明显， 一般在出现症状后患者的生存时间仅为6个月。 因其恶性度高、病情进展快，人称"癌中之王"。
大量国内外关联研究表明，肝癌与遗传因素关系密切，该疾病的遗传易感性研究主要集中于I相代谢 酶和II相代谢的相关基因。
外来化合物在体内的代谢包括I相代谢酶介导的活化过程和II相代谢酶介导的解毒过程。细胞色素 P450是研究较多的I相代谢酶，该酶系有100多种同工酶。许多化学物质通过细胞色素P450酶的氧化作 用后，毒性不是减弱，反而增强，如苯并芘就是通过细胞色素P450酶的氧化代谢活化后才具有致癌活性 的。CYP1A1基因11e462Val是位于该基因第7号外显子处的A/G多态位点，该位点位于该酶的血红素结合. 区。该多态位点具有三种基因型Ile/Ile、 Ile/Val和Val/Val，其中Ile/Val和Val/Val是肝癌的易感 基因型。研究表明，CYPlAl酶蛋白462位氨基酸由Ile变为Val，增加了酶的活性，导致具有致癌能力的 环氧化物浓度增加，引起DNA的损伤及染色体畸变，导致肝癌的发病风险。
环氧化物水解酶是体内重要的II相代谢酶，在机体各种器官和组织中都可以表达，主要存在于细職内 质网和胞液中。该酶的主要功能是催化各种具有活性的外源性环氧化物以及I相代谢过程中所产生的各种 不稳定的环氧化物水解，形成可溶性的物质而排出体外。环氧化物由于带有强极性的碳-氧键而高度活化， 易于和DNA、蛋白质等生物大分子共价结合，形成加合物而导致细胞毒性或遗传物质突变。EPHX1基因 Tyrll3His位点是该基因第3号外显子处的一个多态位点，该多态位点的基因型有三种Tyr/Tyr、Tyr/His、 His/His，其中His/His被确定为风险基因型，与肝癌的发病有关。研究显示，Hisll3His纯合子编码的 EPHX1酶的活性会降低40%，从而使环氧化物水解速率减慢，过多的环氧化物在体内蓄积，后者可与DNA 鸟嘌呤的N7位点共价结合，引起DNA单链的断裂。因此，风险基因型携带者由于对具有致癌作用的环氧 化物的代谢缓慢，而增加了肝癌的易感性。
GSTM1是体内生物#转化第11时相重要的转移酶，它通过直接结合于化学致癌物或通过与谷胱甘肽结合 而发挥解毒功能。Null/Present是GSTM1常见的多态性，该多态有三种基因型，+/+、 +/_和-/-,分别代 表无等位基因缺失，缺失一个等位基因，缺失两个等位基因(完全缺失型)，其中完全缺失型(Null)与 肝癌的发病相关。国内外众多研究表明，完全缺失型者的肝脏不能表达谷胱甘肽硫转移酶M1，机体的解毒 功能降低，因此纯合型缺失者在接触大量致癌物时，不能使致癌物转化为毒性低、水溶性强的代谢产物而 及时有效地排出体外。这些未排除体外的致癌物可与机体内重要的肿瘤抑癌基因形成DNA加合物，易引起 肿瘤抑癌基因变异和功能丧失，从而增加了肝癌的发病风险。
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GSTT1是体内重要的II相代谢酶，它通过直接结合于化学致癌物或通过与谷胱甘肽结合而发挥解毒功 能。Null/Present是GSTT1常见的多态性，该多态有三种基因型，+/+、 +/_和-/-,分别代表无等位基因 缺失，缺失一个等位基因，缺失两个等位基因(完全缺失型)，其中完全缺失型(-/-)与肝癌的发病相关， 是肝癌的风险基因型。GSTT1基因的缺失多态，使该基因功能丧失，机体的解毒功能降低，使得致癌物不 能转化为毒性低、水溶性强的代谢产物而及时有效地排出体外，致癌物质在体内积累，浓度增加。积累的 致癌物可与机体内重要的肿瘤抑癌基因形成DNA加合物，易引起肿瘤抑癌基因变异和功能丧失，从而增加 了肝癌的发病风险。
发明内容
基于细胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)、微粒体环氧化物酶基因(EPHX1)、谷胱甘肽硫转移酶Ml基 因(GSTM1)、谷胱甘肽硫转移酶T1基因(GSTT1)上的4个SNP位点多态性可用来评估个体肝癌遗传易感 性的基础上，本发明提供一种检测个体肝癌遗传易感性的试剂盒。
该试剂盒包括
检测CYP1A1基因上11e462Val SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测EPHX1基因上Tyrll3His SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测GSTM1基因上SNP多态性基因型的电泳检测引物对； 检测GSTT1基因上SNP多态性基因型的电泳检测引物对；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCL溶液、PCR反应缓冲液、去离子水等)； 荧光定量PCK反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、反应缓冲液、去离子水等)。 . 本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常^的合成技术进行合成。 本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对可用常规的探针合成 技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括-
1. 荧光定量PCR反应套装 . 10 X荧光定量PCR反应缓冲液2pl， 25mM dNTP混合液0.2|al，
25rnM MgC12溶液1. 2^1， 5units/Vl Taq DNA聚合酶0. 05pl， 20MM特异性引物对每条引物各0.225^1， IO幽特异性荧光探针对每条探针各0.25^1， 去离子水10.65^1。
2. 电泳检测套装
10X PCR反应缓冲液2.5jxl， 25mM dNTP混合液0. 2pl， 25mM MgCh溶液1. 5ji1， 5units/nl Taq DNA聚合酶0. 125fil， 20pM电泳检测引物对每条引物各0.25pl， 去离子水18. 675^1， 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:电泳检测分型
使用检测试剂盒中的电泳检测套装，反应的体系为总体积25nl，包含浓度为12.5ng/pl的DNA模板 lpl、 IOXPCR反应缓冲液2.5^il, 25mMdNTP混合液0.2pl， 25mMMgC12溶液1.5^1, 5units/pl Taq DNA 聚合酶0.125^1， 20nM电泳检测引物对每条引物各0.25)x1,去离子水18.675^1。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94°C、 12分钟，进行30个循环的94°C、 30秒，6(TC、 30秒，72°C、 30秒，然后进行72。C、 IO分钟。
然后利用电泳技术，进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带数量。
步骤3:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，分别进行2次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为 总体积10nl，包含浓度为20ng/pl的DNA模板2^1、 lpl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. lpl 25mM dNTP 混合液、0.6nl 25mM MgCl2溶液、0.025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20pM的有义引物和反义引物 各0. 225nl 、 10nM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0. 25^1 ，去离子水5. 325pl 。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为5(TC、 2分钟，95°C、 IO分钟，进行60个循环的95°C、 30秒， 60°C、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤4:基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉电泳检测技术的本领域技术人员能够通过辨识电泳图上DNA条带的位置和数量来确定所检测的 SNP位点的基因型。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检测试剂盒进行个体肝癌遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的GSTM1基因和GSTT1基因上的SNP位点进行PCR 扩增和电泳检测，对CYPIAI基因上11e462Val SNP位点、EPHXl基因上Tyrll3His SNP位点进行荧光定量 PCK检测，确定这4个SNP位点的基因型。
步骤3:个体肝癌遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体肝癌遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被检 测者肝癌遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体肝癌遗传易感性分析报告单。
权利要求
1.一种检测个体肝癌遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测细胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上Ile462Val SNP位点、微粒体环氧化物酶基因(EPHX1)上Tyr113His SNP位点、谷胱甘肽硫转移酶M1基因(GSTM1)上SNP位点、谷胱甘肽硫转移酶T1基因(GSTT1)上SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PGR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括1) 荧光定量PCR反应套装10X荧光定量PCR反应缓冲液2W，25raMdNTP混合液0. , 25mM MgC12 溶液1. 2W， 5units/W Taq DNA聚合酶0.00514， 20MM特异性引物对每条引物各0.225W, 10MM特异 性荧光探针对每条探针各0. 25W，去离子水10. 65W。2) PCR反应套装:IOXPCR反应缓冲液2. 5W, 25mMdNTP混合液0. 2W, 25raM MgC12溶液1.5W, 5units/W Taq DNA聚合酶0. 20HM特异性引物对每条引物各0.25W，去离子水18.675W。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC 。
全文摘要
本发明公开了一种检测肝癌遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测细胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)、微粒体环氧化物酶基因(EPHX1)、谷胱甘肽硫转移酶M1基因(GSTM1)和谷胱甘肽硫转移酶T1基因(GSTT1)的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与肝癌遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体肝癌遗传风险。
文档编号C12Q1/68GK101608217SQ200810039259
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司