专利名称：肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物制剂技术领域，具体涉及一种肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒。
本发明提供了一种肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒。本发明的试剂盒是由试剂1和试剂2组成的，其中试剂1为(0.5-9％)柠檬酸三钠 0-300mmol/L(0-5.5％)Na2HPO40-300mmol/L(0-4％) NaAc0-300mmol/L(0-7.8％)CAPSO 0-300mmol/LNaN30-0.1％(0-4.7％)NaH2PO40-300mmol/L试剂2为(0.5-6.5％)柠檬酸0-300mmol/L(0-10％) HAc 0-300mmol/L(0-0.3％) HCl 0-300mmol/L(0-0.2％) 苯甲酸0-12mmol/L(0.1-2％) CNPF 0-5mmol/L本发明的另一所要解决的技术问题是提供了上述肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤1.用不同种类、不同浓度、不同pH的缓冲系统，测定同份样品中AFU活性，初选出相对满意的缓冲系统；实验研究中各物质浓度范围如下柠檬酸三钠 0-300mmol/L 柠檬酸 0-300mmol/LNa2HPO40-300mmol/L HAc 0-300mmol/LNaAc0-300mmol/L HCl 0-300mmol/LCAPSO 0-300mmol/L 苯甲酸 0-12mmol/LNaN30-0.1％ CNPF0-5mmol/LNaH2PO40-300mmol/L2.对初选出的缓冲系统，逐一完成缓冲液浓度和pH对酶活性的影响试验，以及各系统中底物CNPF的稳定性实验，进一步缩小缓冲系统的可选范围；3.择优选用能提高CNPF稳定性的缓冲系统，实验求出该系统中酶反应产物CNP的摩尔吸光度(ε)，并求出该系统中CNPF浓度对AFU活性的影响曲线，在此基础上确定下一步实验的CNPF的浓度范围；制备在此范围内不同CNPF浓度的缓冲系统，经过对血清AFU活性测定，用Linewear-Burk双倒数作图法，求出在该系统中AFU对CNPF的米氏常数Km值；结合CNPF浓度对AFU活性的影响曲线，确定试剂中CNPF的配制浓度；4.经过上述选择，配制成选定的缓冲系统和底物浓度的试剂，经37℃加热试验，并通过与其他糖苷类试剂的比较，进一步确定CNPF在该系统中的稳定性；
5.作重复性试验和线性试验；本发明的试剂盒既可作稳定的双试剂(试剂1和试剂2)直接使用，也可将试剂1与试剂2按4∶1的比例混合，作稳定的单试剂直接使用。通常，本发明的试剂盒采用连续监测法，必要时也可加用终止液，改为两点比色法。检测参数为主波长405nm 次波长600nm光 径1cm 温度 37℃延滞时间 90秒 监测时间 90秒试剂1 200μl试剂2 50μl样品 25μl 计算因数 3207如改用单试剂操作，只需将试剂1与试剂2按规定比例混合均匀，即得稳定的液体单试剂。
如所用仪器不含有405nm波长，可将主/次波长改为410nm/600nm，计算因数改为3337，其余测定参数不变。
本发明的检测效果如下最低检测限0.6U/L方法灵敏度ΔA405nm/min＝3.12×10-4/U，即F＝3207批内精密度CV＝1.72-3.7％天间精密度CV＝4.64％线性范围达250U/L(正常参考范围10-35.5U/L)方法比较与经典的PNPF两点法比较，两者结果显著相关，r＝0.955，P＜0.01，y＝0.32x+0(y为PNPF两点法，x为本法，均以U/L表示)。回归分析表明，本法显著提高了酶对底物的水解速率，达PNPF两点法的三倍以上。
AFU测定试剂盒在临床用于肝癌诊断的试验如下1.我们以健康人血清中AFU X+3S为诊断临界值，对原发性肝癌(PHC)的诊断敏感性为84.9％。但是，急性黄疸型肝炎、慢活肝、肝硬化病人血清中AFU水平与PHC病人有明显交叠。为解决这一鉴别诊断中的问题，我们对这四组病人进行了随访观察。除PHC组外，其余三组病人经过对症治疗约十天后，血清AFU逐渐下降，而未经抗癌治疗或手术切除的PHC病人血清中AFU保持在持续高值，与其余三组病例的血清AFU水平明显分离。这一现象的发现，显著提高了血清AFU测定对PHC诊断的特异性。
2.血清AFU水平与肝癌大小不相关。有文献报道，小肝癌病人组，血清AFU升高的阳性率在70％以上，而同组病人AFP升高者仅37.5％。说明血清AFU对小肝癌的诊断敏感性远远高于血清AFP。
3.血清AFU活性与AFP水平不相关，两者同时检测，互为补偿，可明显提高PHC的发现率。我们在34例AFP阳性的PHC病人中发现，AFU阳性29例，占85.3％；在19例AFP阴性的PHC病人中，AFU阳性16例，占84.2％。说明在无法借AFP检出的PHC病人中，如同时检测AFU，可以减少大约84.2％的病人被漏诊。我们的资料还证明，同时测定AFU和AFP，可使PHC的阳性检出率从单测AFP的64.2％提高到94.3％！4.对肝硬化等病人的随访监护具有重要价值。这些病人如果血清AFU由正常转为持续升高，或者始终保持异常高值不降，应高度警惕并发肝癌。国外报道，凡有上述升高情况者，无一幸免肝癌，其中一例在确诊PHC前66个月，已出现血清AFU升高，嗣后一直持续不降。就此而言，不仅其诊断特异性几达100％，而且具有早期发现肝癌的价值。
5.对PHC的疗效观察和随访具有价值。PHC经手术切除后，血清AFU下降，再度升高提示PHC复发。
6.对影象诊断难以定性的肝占位病变，可协助诊断；不受AFP＞400μg/l持续四周，和＞200μg/l持续八周在时间上的限制，有利于肝癌的早期诊断。
7.其它脏器癌症发生肝转移时，血清中AFU活性也可明显升高，尽管升高程度略低于PHC病人，但仍具有很好的辅助诊断价值。
本发明的试剂盒是一种体外诊断试剂，用来测定人血清(体液)中α-L-岩藻糖苷酶(AFU)活性，对原发性肝癌的诊断和监护，以及监护肝硬化病人是否并发肝癌，独具价值。本发明的试剂盒既适用于全自动生化分析仪，也适用于半自动生化分析仪，需要时还可改为手工操作使用，操作十分简便，适于各种实验室，市场前景广阔。
HAc 63mlNaN31gH2O加至 1000ml
权利要求
1.一种肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒，其特征在于该试剂盒是由试剂1和试剂2组成的，其中试剂1为(0.5-9％)柠檬酸三钠 0-300mmol/L(0-5.5％)Na2HPO40-300mmol/L(0-4％) NaAc 0-300mmol/L(0-7.8％)CAPSO 0-300mmol/LNaN30-0.1％(0-4.7％)NaH2PO40-300mmol/L试剂2为(0.5-6.5％)柠檬酸 0-300mmol/L(0-10％) HAc 0-300mmol/L(0-0.3％) HCl 0-300mmol/L(0-0.2％) 苯甲酸 0-12mmol/L(0.1-2％) CNPF 0-5mmol/L
2.一种如权利要求1所述的一种肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)用不同种类、不同浓度、不同pH的缓冲系统，测定同份样品中AFU活性，初选出相对满意的缓冲系统；实验研究中各物质浓度范围如下柠檬酸三钠 0-300mmol/L柠檬酸 0-300mmol/LNa2HPO40-300mmol/LHAc 0-300mmol/LNaAc0-300mmol/LHCl 0-300mmol/LCAPSO 0-300mmol/L苯甲酸 0-12mmol/LNaN30-0.1％CNPF0-5mmol/LNaH2PO40-300mmol/L(2)对初选出的缓冲系统，逐一完成缓冲液浓度和pH对酶活性的影响试验，以及各系统中底物CNPF的稳定性实验，进一步缩小缓冲系统的可选范围；(3)择优选用能提高CNPF稳定性的缓冲系统，实验求出该系统中酶反应产物CNP的摩尔吸光度(ε)，并求出该系统中CNPF浓度对AFU活性的影响曲线，在此基础上确定下一步实验的CNPF的浓度范围；制备在此范围内不同CNPF浓度的缓冲系统，经过对血清AFU活性测定，用Linewear-Burk双倒数作图法，求出在该系统中AFU对CNPF的米氏常数Km值；结合CNPF浓度对AFU活性的影响曲线，确定试剂中CNPF的配制浓度；(4)经过上述选择，配制成选定的缓冲系统和底物浓度的试剂，经37℃加热试验，并通过与其他糖苷类试剂的比较，进一步确定CNPF在该系统中的稳定性；(5)作重复性试验和线性试验；
3.根据权利要求1所述的一种肝癌诊断监护及肝硬化监护试剂盒，其特征在于该试剂盒为液体型双试剂或液体型单试剂。
全文摘要
本发明属生物制剂技术领域。本发明公开了一种肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒。该试剂盒是一种体外诊断试剂，用来测定人血清中α－L－岩藻糖苷酶(AFU)活性，对原发性肝癌的诊断、监护以及肝硬化的监护具有广泛的临床意义。本发明提供了制备方法。
文档编号C12Q1/25GK1428435SQ01139259
公开日2003年7月9日 申请日期2001年12月27日 优先权日2001年12月27日
发明者张抗 申请人:张抗