专利名称：：一种微生物不对称拆分制备(s)-苯乙二醇的方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体的说，本发明涉及一种微生物不对称拆分制备(s)-苯乙二醇的方法。
背景技术：
：(s)-苯乙二醇，不仅是液晶材料中不可缺少的手性原料，可用于转化合成光学纯的环氧化合物、叠氮化合物和氨基醇等，是很多光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体。如，(s)-苯乙二醇，作为手性双膦的前体，在合成不对称加氢生成前手性链烯的催化剂铑离子复合物中起重要作用；另外，(S)-苯乙二醇也是立体选择性聚合物的起始手性合成子。因此，开展苯乙二醇拆分方法的研究非常有意义。(R,S)-苯乙二醇和(S)-苯乙二醇的化学结构分别为(R,S)-苯乙二醇(S)-苯乙二醇苯乙二醇结构中含有两个羟基，利用化学制备光学纯苯乙二醇需要对羟基进行选择性保护，易生成其它衍生物，拆分难度较大，反应中所添加的手性催化剂和保护剂具有毒性，不利于环保，因此生物法制备光学纯苯乙二醇成为研究的热点。目前，生物法制备光学纯(S)-苯乙二醇的方法主要有以下两种利用近假丝平滑酵母(Cam/Wa/7ara;w//a^IFO0708)全细胞立体选择性转化外消旋苯乙二醇，得到(S)-苯乙二醇；和利用脂肪酶不对称转酯拆分外消旋苯乙二醇，得到产物(S)-苯乙二醇。但利用氧化葡萄糖酸菌属(G/"amo6fl"w)微生物进行选择性氧化消旋底物中的(R)-苯乙二醇，从而得到产物(s)-苯乙二醇的方法尚未见到报道。
发明内容本发明的目的在于，提供一种微生物不对称拆分制备(s)-苯乙二醇的方法，获得光学纯的(S)-苯乙二醇。本发明提供的方法，使用氧化葡萄糖酸菌属(G/wco"o6""")微生物选择性氧化外消旋苯乙二醇中的(R)-苯乙二醇，从而获得(S)-苯乙二醇。根据本发明，所述氧化葡萄糖酸菌属(G/wcowo&"w)微生物优选为氧化葡萄糖酸杆菌(G/wcowo6ac^ar少&ra)AW2卵J。根据本发明，所述选择性氧化反应的时间为4120小时，优选的为26小时。根据本发明，所述选择性氧化反应的底物浓度为125g/L，优选的为510g/L。根据本发明，所述选择性氧化反应的pH为5.58，优选为5.56.5。根据本发明，所述选择性氧化反应的温度为2535'C,优选为28'C。使用本发明提供的方法制备(S)-苯乙二醇，光学纯度可提高至90~100%e.e.，且产率也可以达到约38%。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。在本发明的下述实施例中，使用的氧化葡萄糖酸杆菌菌株DSM2003为商业化的微生物，在国际的一些微生物保藏中心和有关部门均能够购买。在本发明的下述实施例中，使用的外消旋苯乙二醇购于Fluka公司；(R)-苯乙二醇，(S)-苯乙二醇标准品，购于Sigma-Aldrich公司；(R,S)-苯乙二醇标准品，购于Lancaster公司。在本发明的下述实施例中，(R)-苯乙二醇、(S)-苯乙二醇、(R，S)-苯乙二醇标准样品均采用高效液相色谱法(HPLC)检测，具体检测条件如下色谱柱为ChiralcelOB-H(4.6X250mm，5—，流动相中，正己烷异丙醇=90:10(v/v)，流速0.8ml/min;柱温3(TC;柱压常压；紫外检测波长220nm;进样体积1^1。该检测条件下，(R)-苯乙二醇的保留时间为9.2min，(S)-苯乙二醇的保留时间为11.3min。苯乙二醇的光学纯度通过对映过量值(％e.e.)来评价，具体计算方法如下(S)-苯乙二醇的对映过量值f^g.^:^1^""卯％残余苯乙二醇及恣M鹇!f^戶^"^W卵^5。(S)-苯乙二醇产率泡娜4"做鬼反应后(S)-对映体的浓度；反应后(R)-对映体的浓度；反应前(S)-和(R)-对映体的浓度之和；实施例l、菌株培养分别按以下配方，配制种子培养基和发酵培养基DSM2003株种子培养基取8.0g山梨醇，2.0g酵母提取物，O.lgKH2P04,0.05gMgS047H20，pH6.0，加入蒸馏水中，配成100ml培养基。DSM2003株发酵培养基取8.0g山梨醇，2.0g酵母提取物，O.lgKH2P04,0.05gMgS047H20，pH6.0加入蒸馏水中，配成100ml培养基。取氧化葡萄糖酸杆菌(G/wco朋^"MOJc;^am)的DSM2003株，加入种子培养基中，在28"C下，200rpm振荡培养24h，获得种子培养液，然后，以10%的接种量将种子培养液加入到发酵培养基中，于2530。C，100300rpm，培养24小时，收获发酵液。将发酵液离心，收集菌体沉淀，并用磷酸缓冲液洗涤菌体两次，弃去上清，获得菌体沉淀。实施例2、反应时间对制备(S)-苯乙二醇的影响在外消旋苯乙二醇(底物)浓度为10g/L的40ml0.1mol/L磷酸缓冲液中，加入0.3g实施例1获得的DSM2003的湿菌体，进行选择性氧化反应，反应器间，间歇调节pH5.5，反应温度28°C。按表1所示，每隔一定时间取样，样品离心后收集上清，使用等体积的乙醚萃取，收集有机相，检测其中的(R)-苯乙二醇、(S)-苯乙二醇和(R,S)-苯乙二醇含量，计算(S)-苯乙二醇的光学纯度和产率，结果如表1所示。表l、反应时间对制备(s)-苯乙二醇的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表l的结果可见，在pH5.5，28。C的条件下，以10g/L的消旋苯乙二醇为底物进行转化，反应22—120小时后，(S)-苯乙二醇的光学纯度均可达到95%以上，优选的反应时间为26小时，(S)-苯乙二醇的光学纯度达到99.9%以上，且产率可达31.2%。实施例3、底物浓度对制备(S)-苯乙二醇的影响按表2所示，在不同外消旋苯乙二醇(底物)浓度的10ml0.1mol/L磷酸缓冲液中，加入一定量实施例1获得的DSM2003的湿菌体，进行选择性氧化反应，反应维持pH6.0，反应温度28°C。36小时后停止反应，离心反应液，收集上清，用等体积的乙醚萃取，收集有机相，检测其中的(R)-苯乙二醇、(S)-苯乙二醇和(R,S)-苯乙二醇含量，计算(S)-苯乙二醇的光学纯度和产率，结果如表2所示。表2、底物浓度对制备(S)-苯乙二醇的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表2的结果可见，在反应初始pH6.0，28。C的条件下，当底物浓度为l~25g/L，湿菌体浓度为50-200g/100g底物时，反应液中(S)-苯乙二醇的光学纯度达到90。/。以上，优选的底物浓度为5~10g/L，光学纯度达到99.9%以上的同时，产率也可以达到32%以上。实施例4、反应初始pH对制备(S)-苯乙二醇的影响按表3所示，在不同pH条件的、外消旋苯乙二醇(底物)浓度为5g/L的10ml0.1mol/L磷酸缓冲液中，加入0.05g实施例1获得的DSM2003的湿菌体，进行选择性氧化反应，反应温度28°C。24小时后停止反应，离心反应液，收集上清，用等体积的乙醚萃取，收集有机相，检测其中的(R)-苯乙二醇、(S)-苯乙二醇和(R,S)-苯乙二醇含量，计算(S)-苯乙二醇的光学纯度和产率，结果如表3所示。表3、初始pH对制备(S)-苯乙二醇的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表3的结果可见，在28'C的条件下，当pH范围为5.58时，反应液中(S)-苯乙二醇的光学纯度均可达到90%以上，优选的pH范围为5.5~6.5，光学纯度达到99.9%以上，且产率可达38.5%。实施例5、反应温度对制备(S)-苯乙二醇的影响按表4所示，在不同的反应温度下，在外消旋苯乙二醇(底物)浓度为5g/L的10ml0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)中，加入0.05g实施例1获得的DSM2003的湿菌体，进行选择性氧化反应。24小时后停止反应，离心反应液，收集上清，用等体积的乙醚萃取，收集有机相，检测其中的(R)-苯乙二醇、(S)-苯乙二醇和(R,S)-苯乙二醇含量，计算(S)-苯乙二醇的光学纯度和产率，结果如表4所示。表4、反应温度对制备(S)-苯乙二醇的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表4的结果可见，在反应温度为2535。C的条件下，反应液中(S)-苯乙二醇的光学纯度均可达到卯％以上，优选的反应温度为28°C,光学纯度达到99.9%以上，且产率可达38.5%。实施例6、小规模反应器制备(S)-苯乙二醇使用实施例1中制备的DSM2003的菌体沉淀，按下述条件制备(S)-苯乙二醇。在100ml的夹套反应器中，加入40ml、pH5.5的O.lmol/L磷酸缓冲液(外消旋苯乙二醇浓度10g/L)，然后加入0.4g湿菌体，进行选择性氧化反应制备(S)-苯乙二醇，反应温度2『C。反应期间，在线调控pH，保持pH稳定。反应33h后，离心反应液，收集上清，然后用等体积的乙醚萃取，收集有机相，检测其中的(R)-苯乙二醇、(S)-苯乙二醇和(R,S)-苯乙二醇含量，计算(S)-苯乙二醇的光学纯度和产率，结果显示，(S)-苯乙二醇的光学纯度达到99.9%以上，产率达到35.4%。实施例7、制备(S)-苯乙二醇的小试放大使用实施例1中制备的DSM2003的菌体沉淀，按下述条件制备(S)-苯乙二醇。在3.7L的发酵罐反应器中，加入2.0L，pH5.5的O.lmol/L磷酸缓冲液(外消旋苯乙二醇浓度10g/L)，然后加入20g湿菌体(即菌体浓度100g湿菌体/100g底物)，进行选择性氧化反应制备(S)-苯乙二醇，反应温度28°C。反应期间，保持溶氧一定，转速一定，在线调控pH，并保持pH稳定。反应34h后，离心反应液，收集上清，然后用等体积的乙醚萃取，收集有机相，检测其中的(R)-苯乙二醇、(S)-苯乙二醇和(R,S)-苯乙二醇含量，计算(S)-苯乙二醇的光学纯度和产率，结果显示，(S)-苯乙二醇的光学纯度为96.6%，产率为34.4%。综上所述，本发明的使用氧化葡萄糖酸菌属(G/"co"oto"")微生物选择性氧化外消旋苯乙二醇中的(R)-苯乙二醇，从而获得(S)-苯乙二醇的方法，可以获得高纯度的(S)-苯乙二醇，光学纯度达到99.9以上，且产率较高，可达到38%，为理论最好产率的76%。权利要求1、一种微生物不对称拆分制备(S)-苯乙二醇的方法，其特征在于，使用氧化葡萄糖酸菌属(Gluconobacter)微生物选择性氧化外消旋苯乙二醇中的(R)-苯乙二醇，从而获得(S)-苯乙二醇。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸菌属(G/WC0"06a"er)微生物为氧化葡萄糖酸杆菌(G/wamo6a"eroj9;^附)ASM2朋3。3、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述选择性氧化反应的时间为4120小时。4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述选择性氧化反应的时间为26小时。5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选择性氧化反应的底物浓度为l25g/L。6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述选择性氧化反应的底物浓度为510g/L。7、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述选择性氧化反应的pH为5.58。8、如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述选择性氧化反应的pH为5.56.5。9、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述选择性氧化反应的温度为2535'C。10、如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述选择性氧化反应的温度为28'C。11、如权利要求110中任一项所述的方法，其特征在于，所述选择性氧化反应的菌体浓度为50200g湿菌体/100g底物。全文摘要本发明提供了一种微生物不对称拆分制备(S)-苯乙二醇的方法，本发明使用氧化葡萄糖酸菌属(Gluconobacter)微生物选择性氧化外消旋苯乙二醇中的(R)-苯乙二醇，从而获得(S)-苯乙二醇。使用本发明提供的方法制备(S)-苯乙二醇，光学纯度可达到99.9％e.e.以上，产率可达到约38％。文档编号C12P7/22GK101302543SQ200810038899公开日2008年11月12日申请日期2008年6月12日优先权日2008年6月12日发明者林金萍,琼高,魏东芝申请人:华东理工大学