专利名称：：筛选ε-聚赖氨酸高产菌的方法
技术领域：
：本发明属于微生物发酵工程领域，具体地说，本发明涉及一种S-聚赖氨酸高产菌的筛选方法。
背景技术：
：随着人们生活水平的日益提高以及对食品安全性的认识和要求的逐步提高，化学防腐剂受到严峻挑战，食品防霉防腐剂的天然化己成为今后的发展趋势。天然食品防腐剂可分为微生物源防腐剂、动物源和植物源防腐剂。微生物食品防腐剂是指通过微生物发酵的方法，从发酵液中提取分离得到的有抑菌作用的物质。目前，国际上批准使用的微生物食品防腐剂仅有乳酸链球菌素、纳他霉素和e-聚赖氨酸。乳酸链球菌素能有效抑制引起食品腐败的许多革兰氏阳性细菌，而对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌无效；而pH值、温度、光照、氧化物及重金属对纳他霉素的稳定性影响较大，因此在一定程度上限制了它们的应用。s-聚赖氨酸Opolylysine)是由微生物合成的L-赖氨酸同聚物，由s，氨基与cc-羧基通过肽键连接而成，其聚合度一般为2535。它是日本酒井平一和岛昭二两位博士大量筛选有价值的放线菌时发现的一种新型聚合物，进一步研究发现其具有强烈的抑菌能力，可以作为防腐剂用于食品的保鲜。作为新型的天然防腐剂，s-聚赖氨酸已于2003年IO月被FDA批准为安全食品保鲜剂。除了作为食品防腐剂，e-聚赖氨酸的应用已拓展至医学、化妆品及高吸水性材料等。日本窒素公司已将s-聚赖氨酸的微生物发酵实现工业化，年产千吨s-聚赖氨酸的现代化工业装置已建成投产，市:4规模达数十亿日元。但国内还处于实验室研发阶段，主要是进行s-聚赖氨酸产生菌的筛选及采取各种诱变方法选育得到高产菌。s-聚赖氨酸产生菌的筛选方法十分复杂，传统的方法是从土壤中筛选，通过平板分离，获得纯培养物，然后对每个纯培养物进行摇瓶发酵，从发酵液中检验是否成德拉根道夫(+)反应，再通过液相色谱的方法进一步验证。这样的筛选方法存在着筛选目标不确定、工作量大、周期长、筛选效率低等缺点。2002年；Nishikawa等人采用一种简便的方法筛选土壤中s-聚赖氨酸产生菌，在SG培养基中加入0.002%碱性染料美蓝，s-聚赖氨酸与染料通过静电作用而在平板上形成肉眼可见的特殊透明圈，从而简化了筛选过程。但这种方法仍存在很多不足，美兰对s-聚赖氨酸产生菌有很大的抑制作用，而且周期长。而关于目测筛选高产菌的方法因各种菌而异，有的可通过抗生素耐受或敏感性来筛选，有的可通过氨基酸营养缺陷型筛选。聚赖氨酸高产菌的直接目测筛选方法报道的还有一种就是，通过在培养集中加入AEC进行筛选。因为s-聚赖氨酸的生物合成是以赖氨酸为前体物，再通过聚合酶的催化生成s-聚赖氨酸。因此增强赖氨酸代谢流将有助于提高s-聚赖氨酸的产量。天冬氨酸激酶(AK)是赖氨酸生物合成途径中的关键酶，其活性受末端产物赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。因此可以通过筛选赖氨酸的结构类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)的抗性菌株来遗传性地解除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制，进而积累大量赖氨酸，再由s-聚赖氨酸聚合酶聚合，从而达到高产s-聚赖氨酸的目的。但是AEC的价格十分昂贵,lg的价格就需要1000多元，而试验的需要量也较大，因此成本太高。s-聚赖氨酸高产菌的筛选工作量很大，传统的方法是将诱变处理后随机挑取获得的每个纯培养物进行摇瓶发酵，筛选得到高产菌。这种方法随机性很高，而且工作量大，筛选效率很低。
发明内容针对上述现有技术的缺陷，本发明提供一种直观、简单、快速的s-聚i赖氨酸高产菌的筛选方法，该方法能克服传统筛选方法的不足，不但可高:效直观地将s-聚赖氨酸产生菌与其他微生物区分开来，而且可以取代繁琐的摇瓶发酵筛选方法，在平板上简单直观地筛选s-聚赖氨酸产生菌的高产菌。本发明工艺简单、工作量小、周期短、筛选效率较高。本发明的技术方案如下提供一种筛选s-聚赖氨酸高产菌的方法，其特征在于，在培养基中添加带电荷的指示剂，根据所述指示剂与s-聚赖氨酸的特殊反应所形成的透明圈径或聚集圈径的大小，筛选S-聚赖氨酸高产菌。发明方法的原理是S-聚赖氨酸带有很多正电荷，遇到带负电荷的指示剂时，由于静电作用异性相吸，因此形成色素聚集圈；而遇到带正电荷的指示剂时，由于静电作用同性排斥，因此形成色素透明圈，从而，通过在培养基中添加带电荷的指示剂，可以选择性地从不同土壤样品中筛选S-聚赖氨酸产生菌，然后根据所述指示剂与s-聚赖氨酸的特殊反应所形成的透明圈径或聚集圈径的大小，选择性地从平板上筛选s-聚赖氨酸高产菌。所述带电荷的指示剂可以选自带负电荷的苋菜红、诱惑红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰或带正电荷的中性红。上述指示剂中，最优选的是中性红。本发明方法中，所述带电荷的指示剂优选以配制成溶液的形式加入培养基中。指示剂的浓度要适宜。如果指示剂的浓度太低,形成的聚集圈或透明圈不清晰明显；但如果浓度太高，又会因为一定的毒性作用而抑制菌体生长。因此须确定合适的指示剂浓度，以此形成的聚集圈或透明圈既清晰明显又不会对菌体的生长造成很大的抑制。发明人根据试验结果，确定带负电荷的指示剂中，苋菜红的浓度可以是0.002%0.012%;诱惑红的浓度可以是0.002%0.010%;亮蓝的浓度可以是0.002%0.010%;拧檬黄的浓度可以是0.002%0.010%;溴酚兰的浓度可以是0.002%0.010%。而带正电荷的中性红的浓度可以是0.0005%0.0025%，优选0.0015%。.本发明方法所得的e-聚赖氨酸粗品对细菌、放线菌和酵母菌都有明^的抑菌作用，其中对枯草芽孢杆菌的抑制最强。本发明方法的指示剂浓度确定过程如下SG固体培养基的组成是(g/L):甘油10，琼脂20，酵母膏0.10，NaH2P04'2H200.884，MgS04'7H200.25，(NH4)2S040.66，痕量矿物溶液140ml，加水定容至1L，其中pH为7.0。所述痕量矿物溶液的组成是(g/L):NaCl1，FeS04'7H200.1，CaCl22H200.1，明矶0.01，CuS04'5H200.01，CoCl2.6H200.1，H3B030.01，ZnS04'7H200.1，NH4Mo7024-4H200.01。指示剂溶液的配制50.1%溴酚兰准确称取0.1克溴酚兰溶于100ml20%乙醇；0.1%百里酚蓝准确称取O.l克百里酚蓝溶于100ml20。/。乙醇；0.05%溴百里酚蓝准确称取0.05克溴百里酚蓝溶于100ml20%乙醇；0.1%中性红准确称取0.1克中性红溶于100ml60%乙醇；0.2%甲基红准确称取0.2克甲基红溶于100ml60。/。乙醇；0.1%酚红准确称取0.1克酚红溶于100ml20%乙醇；0.1%甲酚红准确称取O.l克甲酚红溶于100ml50。/。乙醇；0.1%酚酞准确称取0.1克酚酞溶于100ml60%乙醇；0.1%百里酚酞准确称取0.1克百里酚酞溶于100ml90%乙醇；0.8%亮蓝准确称取0.8克亮蓝溶于100ml无菌蒸馏水；0.8%柠檬黄准确称取0.8克柠檬黄溶100ml于无菌蒸馏水；0.8%诱惑红准确称取0.8克诱惑红溶于100ml无菌蒸馏水；0.8%苋菜红准确称取0.8克苋菜红溶于100ml无菌蒸馏水。将SG固体培养基12rC灭菌20min，灭菌后，待温度降至6(TC左右时加入上述各指示剂溶液，使其终浓度均达0.002%，混匀后倒入90mm平板，制成各指示剂平板。将s-聚赖氨酸标准品配制成浓度为lg/L，并用无菌过滤膜过滤。灭菌后的牛津杯放置各指示剂平板中，牛津杯中加入200ul浓度为lg/L的s-聚赖氨酸标准品溶液及对照无菌水。室温下放置，l天后观察平板。由于s-聚赖氨酸是聚阳离子化合物，带有很多正电荷，可以与带电荷的指示剂发生静电作用，在平板上显现特殊现象，如表1所列。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实验结果表明在苋菜红、诱惑红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰平板上，装有S-聚赖氨酸标准品的牛津杯周围形成一个清晰明显的色素聚集圈，因为S-聚赖氨酸带有很多正电荷，而苋菜红、诱惑红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰带负电荷，由于静电作用异性相吸，故形成色素聚集圈；而在中性红平板上，装有s-聚赖氨酸标准品的牛津杯周围形成一个十分清晰明显的色素透明圈，因为s-聚赖氨酸带有很多正电荷，而中性红带正电荷，由于静电作用同性排斥，故形成色素透明圈。在所有指示剂平板中装有无菌水的牛津杯周围没有聚集圈及透明圈的形成。发明人还发现，采用例如百里酚蓝、溴百里酚蓝、甲基红、酚红、甲酚红、酚酞或百里酚酞等指示剂，也能在平板上形成色素聚集圈，但不够清晰，因为百里酚蓝、溴百里酚蓝、甲基红、酚红、甲酚红、酚酞、百里酚酞的解离程度很小，带负电荷少，因此形成的色素聚集圈不够清晰。因此，本发明选择觅菜红、诱惑红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰或中性红作为筛选模型的指示剂。指示剂的浓度太低，形成的聚集圈或透明圈不清晰明显，但浓度太高，又会因为一定的毒性作用而抑制菌体生长。因此须确定合适的指示剂浓度，以此形成的聚集圈或透明圈既清晰明显又不会对菌体的生长造成很大的抑制。将SG固体培养基121'C灭菌20min，灭菌后，待温度降至6(TC左右时分别加入苋菜红、诱惑红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰指示剂溶液，使其终浓度为0.0010.015%，加入中性红指示剂溶液，使其终浓度为0.00020.0040%，混匀后倒入90mm平板，制成各浓度各指示剂的平板。将菌株&a/6w/wKCTC9669斜面孢子用无菌水洗涤，制成孢子悬浮:液，经一系列稀释后涂布上述各浓度各指示剂平板。根据平板上的菌株生长情况以及菌落数确定添加指示剂的浓度。试验结果如下表2、3、4、5、6所示。其中作为对照的0.002%美蓝对菌的抑制率为91.8%，菌第九天生长。表2中性红浓度的确定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>抑制率1.583.765.5413.2826.5937.5256.8167.4173.41(%)(其中作为对照的0.002%美蓝对菌的抑制率为91.8%，菌第九天生长)结果表明当中性红的浓度为0.0005%0.0025%时，透明圈清晰明显，而且对菌体的毒性作用小。表3苋菜红浓度的确定苋菜红0.0010.0020扁0細0.0050.0070,0100.0120.015浓度(％)透明圈+-+++++++++++++++++++++++清晰程度菌体生第三第三第四第四第四第四第四第四第五长情况天生天生天生天生天生天生天生天生天生长长长长长长长长长抑制率2.785.618.4310.7515.9421.0328.4232.8958.47(%)结果表明当苋菜红的浓度为0.002%0.012%时，透明圈清晰明显，而且对菌体的毒性作用小。表4诱惑红浓度的确定诱惑红0.0010豫0扁0.0040.0050.0070.0100.0120.015浓度(％)透明圈+-+++++++++++++++++++++++清晰程度菌体生第三第三第四第四第四第四第四第四第五长情况天生天生天生天生天生天生天生天生天生长长长长长长长长长抑制率3.948.6714.6618.6120.4924.3030.7243.2657.11(%)结果表明当诱惑红的浓度为0.002%0.010%时，透明圈清晰明显，而且对菌体的毒性作用小。表5柠檬黄浓度的确定8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结果表明当亮蓝的浓度为0.002%0.010%时，透明圈清晰明显，而且对菌体的毒性作用小。表7溴酚兰浓度的确定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结果表明当溴酚兰的浓度为0.002%0.010%时，透明圈清晰明显，而且对菌体的毒性作用小。本发明方法的具体操作过程如下(1)产正电物质菌株的筛选土壤样品中加入灭菌蒸馏水，过滤后进行一系列稀释。将SG固体培养基121'C灭菌20min，待温度降至6(TC左右时加入配置好的指示剂溶液，混匀后制成平板。将稀释后的土壤样品涂至上述平板，3(TC培养。培养4天后，由于指示剂可以和微生物分泌出来的正电聚合物在平板上形成独特的聚集圈或透明圈，因此可以产正电物质的菌株周围形成了一个聚集圈或透明圈，不产正电物质的菌株则没有该现象，因此可以很灵敏地把产正电物质的菌株筛选出来，得到e-聚赖氨酸产生菌。(2)产生物碱菌株的确定分离得到的产正电物质的菌株接于斜面中，培养5天。取一环孢子接种到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30。C培养3天。用Dragendorff试剂对发酵液进行检测,有两株菌对Dragendorff反应呈阳性。(3)产物组成成分的鉴定将2株生物碱呈阳性的菌株的发酵液进行提取，得到粗品，将粗品劝s-聚赖氨酸标准品装入安瓿管中，加入6mol/LHCl密封，于121。C水解24小时，用薄层层析法分析组成成分。薄层层析条件为硅胶60铺板,展开剂为正丁醇冰醋酸吡啶水=4:i:i:2(体积比)；显色剂为茚三酮。菌株发酵液的粗品和s-聚赖氨酸标准品在此展开剂中停留在薄层原位点，，但与茚三酮反应呈阳性，而菌株发酵液的粗品和S-聚赖氨酸标品的盐酸水解液，展开后只有一个斑点，其斑点位置与L-赖氨酸标品溶液的斑点一致，说明菌株发酵液的粗品为单一L-赖氨酸的聚合物。'(4)e-聚赖氨酸高产菌的筛选对筛选得到的s-聚赖氨酸产生菌进行诱变处理(NTG诱变过程为将产生菌的孢子混悬在tris缓冲液(pH6.0)中。向悬浮液中加入NTG至lmg/ml，孢子和NTG在37"C下接触60min。所得孢子通过离心分离收集，用磷酸缓冲液(0.05M，pH7.0)洗涤，在液体营养培养基(基本培养基+0.5。/。酵母提取物，pH6.8)中温育过夜。然后离心收集细胞，用磷酸缓冲液(0.05M，pH7.0)洗涤。进行诱变后可得到高产菌株)，适当稀释后涂至中性红平板。培养直到单菌落长出。测量同一平板上菌落周围形成的大小不一的透明圈径，并将这些菌落挑至斜面，培养待孢子长出后，接一环孢子至M3G发酵培养基中进行摇瓶发酵，培养后采用Itzhaki法测定s-聚赖氨酸含量，比较透明圈径与s-聚赖氨酸产量之间的关系。由于同一平板上，透明圈径大的菌株其s-聚赖氨酸产量就越高，因此，可以通过目测直观地从中性红平板上筛选出s-聚赖氨酸高产菌。本发明的筛选方法不但可高效直观地将s-聚赖氨酸产生菌与其他微生物区分开来，而且可以取代繁琐的摇瓶发酵筛选方法，在平板上简单直观地筛选s-聚赖氨酸产生菌的高产菌。本发明工艺简单、工作量小、周期短、筛选效率较高。具体实施例方式实施例1将固体培养基121'C灭菌20min，待温度降至6(TC左右时加入中性红溶液，使其浓度达0.0015%，混匀后制成平板。将筛选得到的s-聚赖氨酸产生菌进行诱变处理，适当稀释后涂至苋菜红平板。30'C培养45天，单菌落长出。取两个平板，测量同一平板上菌落周围形成的大小不一的聚集圈径，并将这些菌落挑至斜面，3(TC培养45天，待孢子长出后，接一环孢子至M3G发酵培养基中进行摇瓶发酵，30'C培养4天，采用Itzhaki法测定s-聚赖氨酸含量，比较同一平板上聚集圈径与s-聚赖氨酸产量之，的关系。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由上表可知同一中性红平板上，透明圈径大的菌株其S-聚赖氨酸产量就越高。因此，可以通过目测直观地从中性红平板上筛选出S-聚赖氨酸高产菌。实施例2将固体培养基121'C灭菌20min，待温度降至6(TC左右时加入苋菜红溶液，使其浓度达0.005%，混匀后制成平板。将筛选得到的s-聚赖氨酸产生菌进行诱变处理，适当稀释后涂至苋菜红平板。3(TC培养45天，单菌落长出。取两个平板，测量同一平板上菌落周围形成的大小不一的聚集圈径，并将这些菌落挑至斜面，30'C培养45天，待孢子长出后，接一环孢子至M3G发酵培养基中进行摇瓶发酵，3(TC培养4天，采用Itzhaki法测定s-聚赖氨酸含量，比较同一平板上聚集圈径与s-聚赖氨酸产量之间的关系。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由上表可知同一苋菜红平板上，聚集圈径大的菌株其S-聚赖氨酸产量就越高。因此，可以通过目测直观地从苋菜红平板上筛选出S-聚赖氨酸高产菌。实施例3将固体培养基121。C灭菌20min，待温度降至60'C左右时加入诱惑红溶液，使其浓度达0.005%，混匀后制成平板。将筛选得到的s-聚赖氨酸产生菌进行诱变处理，适当稀释后涂至诱惑红平板。3(TC培养45天，单菌落长出。取两个平板，测量同一平板上菌落周围形成的大小不一的聚集圈径，并将这些菌落挑至斜面，3(TC培养45天，待孢子长出后，接一环孢子至M3G发酵培养基中进行摇瓶发酵，3(TC培养4天，采用Itzhaki法测定s-聚赖氨酸含量，比较同一平板上聚集圈径与s-聚赖氨酸产量之间的关系。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>量就越高。因此，可以通过目测直观地从拧檬黄平板上筛选出S-聚赖氨酸高产菌。实施例5将固体培养基121"灭菌20min，待温度降至60。C左右时加入亮蓝溶液，使其浓度达0.005%，混匀后制成平板。将筛选得到的e-聚赖氨酸产生菌进行诱变处理，适当稀释后涂至亮蓝平板。30'C培养45天，单菌落长出。取两个平板，测量同一平板上菌落周围形成的大小不一的聚集圈径，并将这些菌落挑至斜面，3(TC培养45天，待孢子长出后，接一环孢子至M3G发酵培养基中进行摇瓶发酵，30'C培养4天，采用Itzhaki法测定s-聚赖氨酸含量，比较同一平板上聚集圈径与s-聚赖氨酸产量之间的关系。平板1菌编号123456789摇瓶发酵相对产量(％)100.091.2120.2118.495.196.9124.576.1118.6透明圈径大小(cm)0.750.701.001.000.700.751.050.600.95平板2菌编号123456789摇瓶发酵相对产量(％)100.079.8108.4118.9128.1114.360.6128.6■1透明圈径大小(cm)0.800.600.900.951.000.950.651.000.85由上表可知同一亮蓝平板上，聚集圈径大的菌株其S-聚赖氨酸产量就越高。因此，可以通过目测直观地从亮蓝平板上筛选出S-聚赖氨酸高产菌。实施例6将固体培养基12rC灭菌20min，待温度降至60'C左右时加入溴酚兰溶液，使其浓度达0.005%，混匀后制成平板。将筛选得到的s-聚赖氨酸产生菌进行诱变处理，适当稀释后涂至溴酚兰平板。3(TC培养45天，单菌落长出。取两个平板，测量同一平板上菌落周围形成的大小不一的聚集圈径，并将这些菌落挑至斜面，30'C培养45天，待孢子长出后，接一环孢子至M3G发酵培养基中进行摇瓶发酵，3(TC培养4天，采用Itzhaki法测定s-聚赖氨酸含量，比较同一平板上聚集圈径与s-聚赖氨酸产量之间的关系。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由上表可知同一溴酚兰平板上，聚集圈径大的菌株其S-聚赖氨酸产量就越高。因此，可以通过目测直观地从溴酚兰平板上筛选出S-聚赖氨酸高产菌。权利要求1.一种筛选ε-聚赖氨酸高产菌的方法，其特征在于，在培养基中添加带电荷的指示剂，根据所述指示剂与ε-聚赖氨酸的特殊反应所形成的透明圈径或聚集圈径的大小，筛选ε-聚赖氨酸高产菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述带电荷的指示剂是苋菜红、诱惑红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰或中性红。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述带电荷的指示剂是中性红。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述带电荷的指示剂是配制成溶液的形式加入培养基中。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的苋菜红的浓度是0.002%0.012%。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的诱惑红的浓度是0.002%0.010%。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的亮蓝的浓度是r0.002%0.010%。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的柠檬黄的浓度是0.002%0.010%。9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的溴酚兰的浓度是0.002%0.010%。10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的中性红的浓度是0.0005%0.0025%。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所添加的中性红的浓度是0.0015%。全文摘要本发明提供一种筛选ε-聚赖氨酸高产菌的方法，其特征在于，在培养基中添加带电荷的指示剂，根据所述指示剂与ε-聚赖氨酸的特殊反应所形成的透明圈径或聚集圈径的大小，筛选ε-聚赖氨酸高产菌。本发明的筛选方法不但可高效直观地将ε-聚赖氨酸产生菌与其他微生物区分开来，而且可以取代繁琐的摇瓶发酵筛选方法，在平板上简单直观地筛选ε-聚赖氨酸产生菌的高产菌。本发明工艺简单、工作量小、周期短、筛选效率较高。文档编号C12Q1/04GK101580865SQ20081003748公开日2009年11月18日申请日期2008年5月15日优先权日2008年5月15日发明者孙湘婷,岩王,陈少欣申请人:上海医药工业研究院