一种肿瘤治疗性疫苗纳米载体的微流体制备方法

一种肿瘤治疗性疫苗纳米载体的微流体制备方法
【专利摘要】本发明属于微流体及微反应器技术在药物制剂方面的研究领域，具体涉及一种肿瘤治疗性疫苗纳米载体的微流体制备方法。本发明首次采用了Tesla结构芯片制备载有负电性蛋白的纳米粒，该方法工艺简单，制备的复合物粒径小，分散均匀，可重复性好，且能够扩大聚乙烯亚胺及其衍生物与抗原蛋白复合形成纳米粒的质量比范围，从而扩大了其在肿瘤疫苗中的应用前景。
【专利说明】
一种肿瘤治疗性疫苗纳米载体的微流体制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于微流体及微反应器技术在药物制剂方面的研究领域，具体涉及一种肿 瘤治疗性疫苗纳米载体的微流体制备方法。
【背景技术】
[0002] 目前，我们常见的阳离子多聚物有壳聚糖、鱼精蛋白、多聚赖氨酸、多聚组氨酸、多 胺树突状物、聚丙烯亚胺树突状物、聚乙烯亚胺(PEI)等。其中聚乙烯亚胺(PEI)从二十世纪 以来就成为了载体领域的研究热点。
[0003]聚乙烯亚胺(PEI)由于其正电性能够结合核酸形成纳米粒，保护核酸免于降解，且 其"质子海绵效应"能够实现核酸的内吞体逃逸，因而被广泛应用于核酸载体。PEI和带负电 的蛋白，二者通过静电作用结合形成纳米粒，我们的前期研究证实了PEI作为载体与蛋白抗 原形成的复合物可以有效的提高抗原提呈效果，在肿瘤疫苗的开发中有巨大的潜能。
[0004] 现有的方法制备PEI及其衍生物与负电性蛋白纳米粒是通过涡旋的大体积混合方 法，但是这种方法会受很多条件的影响，不同的实验人员，不同的操作手法等，从而使实验 的可控性和重复性较差，制备的纳米粒子也不够均一。因此，我们急需寻找一种方法来提高 PE I及其衍生物与抗原蛋白复合物制备的可控性和可重复性。
[0005] 微流体技术是指在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的技术，是在微电子、微 机械、生物工程和纳米技术基础上发展起来的一门全新交叉学科。近年来，微流体技术在化 学、医药及生命科学等领域上造成了革命上的冲击。
[0006] 微流体作为一种较为新颖的技术，在研究微流控制备药物纳米载体对于提高药物 的效果有一定意义。另外，微流体作为一种综合型的研究领域，应用范围广泛，为研发制剂 提供了新的途径，具有商业化、工业化的潜力。通过不同芯片的设计，可以更为丰富地改变 制剂的方法，从而提供了更多的思路。

【发明内容】

[0007] 为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种肿瘤治疗性疫苗 纳米载体的微流体制备方法。
[0008] 为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 本发明的第一方面，提供一种载有负电性蛋白的纳米粒的制备方法，包括步骤：
[0010] (1)将负电性蛋白溶解，获得蛋白溶液；
[0011] (2)将载体材料溶解，获得载体材料溶液；
[0012] (3)将蛋白溶液和载体材料溶液分别从不同通道入口栗入到Tesla结构芯片中，微 混合，获得载有负电性蛋白的纳米粒。
[0013] 所述负电性蛋白可是抗原蛋白。
[0014] 所述负电性蛋白可以选用0VA或BSA等带负电的蛋白作为模型蛋白。
[0015] 优选地，步骤（1)中，采用缓冲溶液进行溶解。所述缓冲溶液选自PBS或者HEPES。所 述缓冲溶液的pH为7.4。所述缓冲溶液的浓度可以是1~10mM。
[0016]优选地，所述载体材料选用阳离子多聚物材料。
[0017] 进一步优选地，所述阳离子多聚物材料选自聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺衍生物。
[0018] 优选地，所述聚乙烯亚胺的分子量范围是423Da~75kDa。
[0019] 优选地，所述聚乙烯亚胺衍生物选自可降解PEI、PEG修饰的PEI、或疏水性PEI。
[0020] 优选地，步骤(2)中采用水进行溶解。
[0021] 优选地，步骤(3)中，所述蛋白和载体材料的质量比例范围是(0.01~1):1。
[0022]优选地，步骤(3)中，所述蛋白溶液的浓度范围是1~1 Omg/ml。
[0023]优选地，步骤(3)中，所述载体材料溶液的浓度范围是:0.01~5mg/ml。
[0024] 优选地，步骤(3)中，所述Tesla结构芯片含有Tesla结构单元、入口通道和出口通 道。
[0025 ] 优选地，所述Te s la结构芯片含有5个Te s la结构单元。
[0026] 本发明的第二方面，提供了前述方法在制备粒径小且分散均匀的载有负电性的蛋 白纳米粒中的用途。
[0027] 优选地，所述纳米的粒径范围在1~lOOOnm。
[0028] 优选地，所述纳米粒的粒径多分散指数Pdl均小于0.6。
[0029] 本发明的第三方面，提供了由前述方法制备获得的载有负电性蛋白的纳米粒。
[0030] 本发明的第四方面，提供了前述制备方法或由前述方法制备获得的载有负电性蛋 白的纳米粒在制备肿瘤疫苗中的用途。
[0031] 本发明的第五方面，提供了 Tesla结构芯片在制备纳米粒中的用途。
[0032] 优选地，所述纳米粒为载有负电性蛋白的纳米粒。
[0033] 优选地，所述纳米粒的粒径范围在1~1 OOOnm。
[0034]优选地，所述纳米粒的粒径多分散指数Pdl均小于0.6。
[0035] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0036] 本发明首次采用了 Tesla结构芯片制备载有负电性蛋白的纳米粒，该方法工艺简 单，在较高质量比条件下制备的粒子粒径小，分散均匀，PDI均小于0.6;另外由于是一个机 械的过程，所以重现性较好，并且有较好的生物学效果，扩大了聚乙烯亚胺类结构肿瘤疫苗 纳米载体的制备范围，从而扩大了其在肿瘤疫苗中的应用前景。
【附图说明】
[0037]图1:本发明实施例1中PEI溶液和OVA溶液灌注到Tesla结构芯片中的示意图。
[0038]图2 :本发明实施例1不同质量比条件下微流体制备的PEI -0VA纳米粒的粒径和 PdI〇
[0039] 图3 :本发明实施例1不同质量比条件下微流体制备的PE I -OVA纳米粒的电势 ZetaPotential〇
[0040] 图4:采用Tesla的结构芯片制备的PEI-0VA纳米粒的生物学效果。
[0041 ] 图5:不含Tesla结构的Non-Tesla结构芯片的示意图。
[0042] 图6:分别采用Te s 1 a结构芯片和Non-Te s 1 a结构芯片制备的PE I -0VA测粒径，粒径 多分散指数Pdl(Polydispersity Index)结果。
[0043]图7:分别采用Tesla结构芯片和传统的涡旋方法制备的PEI-0VA测粒径结果。
[0044]图8:采用Te s 1 a结构芯片和传统的涡旋方法制备的PE I -0VA粒径多分散指数Pd I (Polydispersity Index)结果。
[0045] 图9:PDP的结构式示意图。
[0046] 图10:分别采用Tesla结构芯片和传统的涡旋方法制备的H)P-〇VA测粒径结果。 [0047]图11:采用Tesla结构芯片和传统的涡旋方法制备的PDP-0VA粒径多分散指数Pdl (Polydispersity Index)结果。
[0048] 图12:PEG_PEI结构示意图。
[0049]图13:分别采用Tesla结构芯片和传统的涡旋方法制备的TOG-PEI-0VA测粒径结 果。
[0050]图14:采用Tesla结构芯片和传统的涡旋方法制备的PEG-PEI-0VA粒径多分散指数 Pdl (Polydispersity Index)结果。
[0051 ]图15:采用Tesla结构芯片制备的PEG-PEI-0VA的生物学效果。
[0052] 图16: Tesla结构芯片示意图。
[0053]图17:分别采用Tesla结构芯片和传统的涡旋方法制备的C12-PEI-BSA测粒径结 果。
[0054]图18:分别采用Tesla结构芯片和传统的涡旋方法制备的C12-PEI-BSA粒径多分散 指数Pdl(Polydispersity Index)结果。
[0055] 图19:C12_PEI的结构示意图。
[0056]图20:采用Tesla的结构芯片制备的H)P-〇VA纳米粒的生物学效果。
【具体实施方式】
[0057] 纳米粒
[0058] 纳米粒是指由天然或合成的高分子载体材料制成的，粒度在纳米数量级（1~ lOOOnrn)的固态凝胶微粒。纳米粒包括纳米球、纳米囊、纳米胶束、纳米脂质体、纳米乳剂和 纳米凝胶等。
[0059] 本发明的纳米粒的粒径范围在1~lOOOnrn范围内。
[0060]载有负电性蛋白的纳米粒的制备方法
[0061 ]本发明的载有负电性蛋白的纳米粒的制备方法，包括步骤：
[0062] (1)将负电性蛋白溶解，获得蛋白溶液；
[0063 ] (2)将载体材料溶解，获得载体材料溶液；
[0064] (3)将蛋白溶液和载体材料溶液分别从不同通道栗入到Tesla结构芯片中，微混 合，获得载有负电性蛋白的纳米粒。
[0065] 所述负电性蛋白可以是抗原蛋白。
[0066] -实施例中，所述负电性蛋白选用0VA。另一实施例中，所述负电性蛋白选用BSA。 但所述负电性蛋白并不限制于具体的0VA或BSA，只要带负电的蛋白均可。0VA，全称 Ovalbumin，是指鸡卵白蛋白，BSA是指牛血清白蛋白。
[0067]步骤（1)中，溶解时，采用缓冲溶液。所述缓冲溶液选自但不限于PBS或者HEPES。所 述缓冲溶液的pH可以为7.4。所述缓冲液的浓度可以是1~10mM。
[0068]本发明的载体材料用于负载负电性蛋白。所述载体材料可选用但不限于阳离子多 聚物材料。阳离子多聚物材料和带负电的蛋白通过静电作用结合形成纳米粒。所述阳离子 多聚物材料可选自但不限于聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺衍生物。
[0069]本发明一实施例中，列举了聚乙烯亚胺作为载体材料。实施例中具体使用的聚乙 稀亚胺的分子量为25kDa。本发明对于聚乙稀亚胺的分子量没有特殊的限制。聚乙稀亚胺的 分子量范围可以是423Da~75kDa。聚乙烯亚胺的分子量范围可以是423Da~25kDa。聚乙烯 亚胺的分子量范围还可以是25kDa~75kDa。
[0070] 当选择聚乙烯亚胺作为载体材料时，溶解蛋白时，可选用HEPES缓冲溶液。所述缓 冲溶液的浓度可以是ImM，pH为7.4。
[0071] 本发明一实施例中，列举了聚乙烯亚胺衍生物：可降解PE I (PDP)作为载体。PDP是 一种加二硫键修饰的可降解PEI，其结构式如式I所示，具体可参见图9所示。可参考文献： M.A.Gosselin,ff.Guo,and R.J.Lee ,"Efficient gene transfer using reversibly cross-linked low molecular weight polyethylenimine"Bioconjugate Chemistry, vol ·12，ηο .6，pp.989-994,2001。具体地，PDP是用含有二硫键的3,3，_二硫代双丙亚胺酸二 甲酯二盐酸盐(DTBP)修饰的PEUDP中PEI的分子量为800Da。
[0072] 当选择TOP作为载体材料时，溶解蛋白时，可选用HEPES缓冲溶液。所述缓冲溶液的 浓度可以是1〇11^，？!1为7.4。
[0073]本发明一实施例中，列举了聚乙烯亚胺衍生物:PEG修饰的PE I (PEG-PEI)作为载 体，其结构式如式Π 所示，具体可参见图12所示。所述PEG-PEI中，PEG与PEI的摩尔比例是 10:1 ;PEG的分子量是5000，PEI的分子量是SSOOOJEG与PEI的摩尔比例还可以是1:1JEG与 PEI的摩尔比例范围在（1~10):1均可。
[0074]当选择PEG-PEI作为载体材料时，溶解蛋白时，可选用HEPES缓冲溶液。所述缓冲溶 液的浓度可以是1〇11^，？!1为7.4。
[0075]本发明一实施例中，列举了聚乙烯亚胺衍生物：疏水性PEI (Cl2-PEI)作为载体。 C12-PEI是十二烷基修饰的PEI，其结构式如式III所示，具体可参见图19所示。所述C12-PEI 中，C12来自溴代十二烷，PEI分子量是423Da。这只是发明人在具体实验中所列举的例子，但 是并不限于此，只要是疏水性烷基修饰的PEI均可。
[0076]步骤(2)中，溶解时采用水。
[0077]步骤(3)中，蛋白和载体材料的质量比例范围是(0.01~1):1。蛋白和载体材料的 质量比例范围还可以是(0.01~0.24): 1。蛋白和载体材料的质量比例范围可以是(0.01~ 0.12):1〇
[0078] 蛋白溶液的浓度范围可以是1~10mg/m 1。蛋白溶液的浓度范围还可以是1~5mg/ ml。蛋白溶液的浓度范围还可以是5~10mg/ml。
[0079] 载体材料溶液的浓度范围可以是:0.01~5mg/ml。载体材料的浓度范围还可以是 0.125~3mg/ml。载体材料的浓度范围可以是0.05~5mg/ml。载体材料的浓度范围还可以是 0·01~0·12mg/ml。
[0080] 一实施例中，当选择聚乙烯亚胺作为载体材料时，蛋白和载体材料的质量比例范 围可以是(0.01~0.24): 1。此时，蛋白溶液的浓度范围可以是10mg/ml。载体材料的浓度范 围可以是0.125~3mg/ml。
[0081] -实施例中，当选择可降解PEI作为载体材料时，蛋白和载体材料的质量比例范围 可以是(0.01~1):1。此时，蛋白溶液的浓度范围可以是5mg/ml。载体材料的浓度范围可以 是0.05~5mg/ml。
[0082] 一实施例中，当选择PEG修饰的PEI作为载体材料时，蛋白和载体材料的质量比例 范围可以是(0.01~0.12):1。此时，蛋白溶液的浓度范围可以是lmg/ml。载体材料的浓度范 围可以是0.01~0.12mg/ml。
[0083] -实施例中，当选择疏水性PEI作为载体材料时，蛋白和载体材料的质量比例范围 可以是(0.03~0.08):1。此时，蛋白溶液的浓度范围可以是lmg/ml。载体材料的浓度范围可 以是 0.03 ~0.08mg/ml。
[0084] 在微流控装置中，流体由于受到管道尺寸的束缚，处于层流状态。当多种可互溶的 流体处于微流管道中时，汇合后仍处于层流状态。当雷诺数较小时，其混合依靠分子扩散。 这种混合特点，一方面使得混合可控，易于重复，另一方面，则造成混合效率低。对于电性较 强的阳离子聚合物和DNA，由于双方的静电吸引力足够大，可以克服扩散不足带来的影响。 而本发明所涉及的负电性蛋白（例如，抗原蛋白）一般电性较弱，与PEI及其衍生物之间的吸 引力较低，因此必须优选出能够促进混合的芯片及操作条件。
[0085] Tesla结构芯片
[0086] Tesla结构芯片是指具有"Tesla结构单元"的芯片。Tesla结构芯片，示意图可参见 图16 Jesla结构芯片除了核心的"Tesla结构单元"，一般还包括入口通道和出口通道。入口 通道一般用于栗入微流体，微流体在"Tesla结构单元"进行微混合后，在出口通道流出。入 口通道可以有一个或多个，例如两个、三个或三个以上。出口通道一般有一个。本发明对于 "Tesla结构单元"的个数并无限制，可优选采用五个。"Tesla结构单元"的弯曲分流通道会 引起流体的二次碰撞，可以有效地促进液体的混合。本发明对于Tesla结构芯片的尺寸没有 特别的限制。一实施例中，Tesla结构芯片的宽200μπι，高llOynuTesla结构芯片，成本低，装 置简单，不需要额外提供能量。Tesla结构芯片属于现有技术。但是采用Tesla结构芯片来制 备纳米粒，特别是制备载有负电性蛋白纳米粒，是本发明的关键创新点，在本发明中首次获 得报道。
[0087]蛋白溶液和载体材料溶液栗入时的总灌注流速范围可以是:80~112.5μ1 /min。蛋 白溶液和载体材料溶液栗入时的总灌注流速范围还可以是:80~1 ΟΟμΙ/min。蛋白溶液和载 体材料溶液栗入时的总灌注流速范围还可以是：1〇〇~112.5μ1/η?η。
[0088] 一实施例中，当选择聚乙烯亚胺作为载体材料时，蛋白溶液和载体材料溶液栗入 时的总灌注流速是112.5μ 1 /min。
[0089] -实施例中，当选择可降解PEI作为载体材料时，蛋白溶液和载体材料溶液栗入时 的总灌注流速是80μ1/η?η。
[0090] 一实施例中，当选择PEG修饰的PEI作为载体材料时，蛋白溶液和载体材料溶液栗 入时的总灌注流速是lOOyl/min。
[0091 ] -实施例中，当选择疏水性PEI作为载体时，蛋白溶液和载体材料溶液栗入时的总 灌注流速是lOOyl/min。
[0092]本发明还进一步提供了前述方法在制备粒径小且分散均匀的载有负电性蛋白纳 米粒中的用途。所述纳米的粒径范围在1~1 〇〇〇nm。所述纳米粒的粒径多分散指数Pd I均小 于Ο · 6〇
[0093] 本发明还进一步提供了由前述方法制备获得的载有负电性蛋白纳米粒。
[0094] 前述方法或由前述方法制备获得的载有负电性蛋白纳米粒均可以用于制备肿瘤 疫苗。
[0095 ]本发明还进一步提供了 Te s 1 a结构芯片在制备纳米粒中的用途。所述纳米粒可以 为载有负电性蛋白纳米。所述纳米粒的粒径范围在1~lOOOnm。所述纳米粒的粒径多分散指 数Pdl均小于0.6。
[0096] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0097] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0098] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998;METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.ffassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0099] 实施例1采用Tesla结构芯片制备PEI-0VA纳米粒
[0100] (1)首先将带负电的蛋白OVA溶于ImM HETOS，pH = 7 · 4的缓冲溶液中，配置得到 10mg/ml 的 0VA 溶液；
[0101] (2)将分子量为25KDa的支状PEI溶于去离子水中配置得到0.125mg/ml~3.0mg/ml 的PEI溶液；
[0102] (3)将步骤（1)中得到的0VA溶液分装到两支lml注射器中，将步骤(2)中得到的PEI 溶液也同样加入到lml注射器中，排除注射器中的气泡，连接好通路，将0VA溶液和PE I溶液 同时栗入到Tesla结构芯片里进行微混合(灌注方法如图1所示），得到PEI与0VA的复合物溶 液，质量比范围为0.01~0.24,其中Tesla结构芯片的通路的宽是200μπι，高是110μπι，ΡΕΙ溶 液通道的灌注量为1〇〇μ1，控制栗入溶液流速为50yl/min，0VA溶液通道的灌注量为125μ1， 分成两个通道，控制栗入溶液流速为31.25μ1/π?η，制备获得PEI-0VA纳米粒。
[0105]
[0103] 所做的条件如下表1所示。[0104] 表1
[0106]
[0107] 将制备获得的P EI - 0 V A纳米粒进行测粒径，粒径以及粒径多分散指数P d I (Polydispersity Index)如图2所不。电势Zeta Potential结果如图3所不。
[0108] 结论:粒径代表得到PEI-0VA纳米粒的平均粒子大小。Pdl表征得到的纳米粒子大 小的均一情况。电势表征粒子的带电情况，反应制备的粒子的稳定性。随着PEI与0VA质量比 的增加(带正电的PEI增多），复合物电势不断增加。在高质量比条件下，如0.12质量比以上， Pdl变得比较大。但是相比于现有技术中的传统涡旋方法，本实施例的方法能够实现更高质 量比PEI-0VA纳米粒的制备，如0.2，0.24。但用涡旋的方法制备不出来均一的溶液，能看到 絮状物。
[0109] 实施例2采用Tesla结构芯片制备的PEI-0VA纳米粒的生物学效果研究
[0110] 参照实施例1的方法制备获得PEI-0VA纳米粒，PEI与0VA的质量比范围为0.01~ 0.24。将制备的不同质量比的TOI-0VA纳米粒溶液稀释至0VA浓度为0.5mg/ml，取30μ1的 PEI-0VA纳米粒稀释液加到96孔板中与120μ1的树突状细胞液，细胞密度是8X105/ml，37°C 细胞培养箱中共孵育过夜，然后将120μ1的B3Z细胞液加入到孔里，一起共孵育24h，最后用 ELISA试剂盒检测B3Z细胞分泌的IL-2的浓度，考察PEI-0VA纳米粒的抗原提呈效果。
[0111] 实验组：1640+FBS组，是指树突状细胞的培养基里面加了 1640和FBS。
[0112] 结论:结果图4所示，在含有血清的实验组（1640+FBS组)里采用Tesla的结构芯片 制备的PEI-0VA纳米粒相比于对照组IL-2浓度显著提高，有明显的抗原提呈效果。具体地， 本发明采用Tesla的结构芯片制备的PEI-0VA纳米粒相比于对照组抗原提呈效果提高了 14 倍。本发明采用Tesla的结构芯片制备的PEI-0VA纳米粒相比于传统方法抗原提呈效果提高 了 8倍。
[0113] 实施例3采用Non-Tesla结构芯片和Tesla的结构芯片制备PEI-0VA纳米粒的比较
[0114] Non-Tesla结构芯片示意图如图5所示，与实施例1使用的Tesla结构芯片拥有同样 流线长度但不含Tesla结构。
[0115] (1)首先将带负电的蛋白0VA溶于ImM HETOS，pH = 7 · 4的缓冲溶液中，配置得到 1 Omg/ml 的 0VA 溶液；
[0116] (2)将分子量为25KDa的支状PEI溶于去离子水中配置得到0.5mg/ml的PEI溶液；
[0117] (3)将步骤（1)中得到的0VA溶液分装到两支lml注射器中，将步骤(2)中得到的PEI 溶液也同样加入到lml注射器中，排除注射器中的气泡，连接好通路，将0VA溶液和PE I溶液 同时分别栗入到Tesla结构芯片和Non-Tesla结构芯片里进行微混合，得到PEI与0VA的复合 物溶液，质量比为0.04,其中Tesla结构芯片和Non-Tesla结构芯片通路的宽都是200μπι，高 都是110μπι，ΡΕΙ通道的灌注量为100μ1，控制栗入溶液流速为50μ1/π?η，〇νΑ通道的灌注量为 125μ1，分成两个通道，控制栗入溶液流速为31.25μ1/η?η。
[0118] 将制备的PEI-OVA测粒径，粒径多分散指数PdI(PolydispersityIndex)，结果如 图6所示。可见采用Tesla结构芯片相比于Non-Tesla结构芯片制备出来的纳米粒，粒径和 Pdl都要小，并且Error bar也要小很多，可见采用Tesla结构芯片在制备纳米粒上的优越 性，重现性好。
[0119]实施例4采用Tesla结构芯片和传统涡旋方法制备PEI-0VA纳米粒的比较 [0120] (1)首先将带负电的蛋白0VA溶于ImM HETOS，pH = 7 · 4的缓冲溶液中，配置得到 10mg/ml 的 0VA 溶液；
[0121] (2)将分子量为25KDa的支状PEI溶于去离子水中配置得到0.125mg/ml~0.5mg/ml 的PEI溶液；
[0122] (3)将步骤（1)中得到的0VA溶液分装到两支lml注射器中，将步骤(2)中得到的PEI 溶液也同样加入到lml注射器中，排除注射器中的气泡，连接好通路，将0VA溶液和PE I溶液 同时栗入到Tesla结构芯片里进行微混合，得到PEI与0VA的复合物溶液，质量比范围为0.01 ~0.04，其中Tesla结构芯片通路的宽是200μπι，高是1 ΙΟμπι，PEI通道的灌注量为100μ1，控制 栗入溶液流速为50μ1/η?η，0VA通道的灌注量为125μ1，分成两个通道，控制栗入溶液流速为 31.25μ1/π?η。所做的条件如下表2所示。
[0123] 表2
[0124]
[0125] (4)用涡旋方法制备0.01~0.04质量比的PEI-0VA纳米粒，将100μ1的相应浓度的 ΡΕΙ溶液加入到 10ml ΕΡ管中，在转速为6(Vortex-2，Genie，Scientific Industries)的条 件下加入125μ1的lOmg/ml的OVA溶液，涡旋20s得到PEI-0VA纳米粒。
[0126] 将制备的PEI-0VA测粒径，粒径结果如图7所示，粒径多分散指数Pdl (Polydispersity Index)结果如图8所不。
[0127] 结论:从粒径上来看，涡旋方法和本发明的采用Tesla结构芯片的微流体方法并没 有大的区别，但是从Pdl上来看，微流体方法制备的纳米粒均要小于涡旋方法制备的纳米 粒，代表粒子分散均一，均一的粒径对于我们研究不同大小的粒子与生物学效果的关系，筛 选处方，确定制备条件有重要的意义，均一的粒径有助于提高制备的可控性以及可重复性， 进一步增强其稳定性。
[0128] 实施例5采用Tesla结构芯片和传统涡旋方法制备H)P-〇VA纳米粒的比较
[0129] (1)首先将带负电的蛋白0VA溶于1 OmM HEPES，pH = 7.4的缓冲溶液中，配置得到 5mg/ml 的 0VA 溶液；
[0130] (2)将rop溶于去离子水中配置得到0.05~5mg/ml的rop溶液；
[0131] (3)将步骤（1)中得到的0VA溶液分装到两支lml注射器中，将步骤(2)中得到的PDP 溶液也同样加入到lml注射器中，排除注射器中的气泡，连接好通路，将0VA溶液和TOP溶液 同时栗入到Tesla结构芯片里进行微混合，得到Η)Ρ与0VA的复合物溶液，质量比范围为0.01 ~l，rop通道的灌注量为100μΙ，控制栗入溶液流速为50μ1/π?η，〇νΑ通道的灌注量为100μΙ， 分成两个通道，控制栗入溶液流速为25μ1/η?η。
[0132] 所有制备的条件如下表3所示：
[0133] 表3
[0134]
[0135] 此外，用涡旋方法制备PDP-0VA纳米粒，将100μ1相应浓度的PDP溶液加入到10ml EP管中，在转速为5(Vortex-2，Genie，Scientific Industries)的条件下加入 100μ1 的5mg/ ml的OVA溶液，涡旋30s，室温静置10min，得到H)P-〇VA纳米粒溶液。
[0136] 将制备的PDP-0VA测粒径，粒径结果如图10所示，粒径多分散指数Pdl (Polydispersity Index)结果如图 11所不。
[0137] 结论：
[0138] 从粒径上来看，涡旋方法和本发明的采用Tesla结构芯片的微流体方法并没有大 的区别，但是从PdI上来看，微流体方法制备的纳米粒均要小于涡旋方法制备的纳米粒，代 表粒子分散均一。
[0139] 实施例6采用Tesla结构芯片制备H)P-〇VA纳米粒的生物学效果研究
[0140] 参照实施例5的方法制备获得PDP-0VA纳米粒，PDP与0VA的质量比范围为0.01~1。 将制备的不同质量比的PDP-0VA纳米粒溶液稀释至0VA浓度为0.5mg/ml，取30μ1的H)P-〇VA 纳米粒稀释液加到96孔板中与120μ1的树突状细胞液，细胞密度是8 X 105/ml，37°C细胞培 养箱中共孵育过夜，然后将120μ1的B3Z细胞液加入到孔里，一起共孵育24h，最后用ELISA试 剂盒检测B3Z细胞分泌的IL-2的浓度，考察H)P-〇VA纳米粒的抗原提呈效果。
[0141] 如图20所示:实验组：1640+FBS组，是指树突状细胞的培养基里面加了 1640和FBS。
[0142] 由此可见，本发明采用Tesla的结构芯片制备的H)P-〇VA纳米粒相比于对照组抗原 提呈效果提高了 33倍。本发明采用Tesla的结构芯片制备的H)P-〇VA纳米粒相比于传统方法 抗原提呈效果提高了 0.4倍。
[0143] 实施例7采用Tesla结构芯片和传统涡旋方法制备PEG-PEI-0VA纳米粒的比较
[0144] (1)首先将带负电的蛋白0VA溶于1 OmM HEPES，pH = 7.4的缓冲溶液中，配置得到 lmg/ml 的 0VA 溶液；
[0145] (2)将PEG-PEI溶于去离子水中配置得到0.01 -0.12mg/m 1的PEG-PEI溶液：
[0146] (3)将步骤（1)中得到的0VA溶液分装到两支lml注射器中，将步骤（2)中得到的 PEG-PE I溶液也同样加入到lml注射器中，排除注射器中的气泡，连接好通路，将0VA溶液和 PEG-PEI溶液同时栗入到Tesla结构芯片里进行微混合，得到PEG-PEI与0VA的复合物溶液， 质量比范围为0.01~〇.12，PEG-PEI通道的灌注量为80μ1，控制栗入溶液流速为40μ1/π?η， OVA通道的灌注量为80μ1，分成两个通道，控制栗入溶液流速为20μ1/η?η。
[0147] 所有制备条件如下表4所示：
[0148] 表4 [01491
[01501
[0151] 此外，用涡旋方法制备PEG-PEI-0VA纳米粒，将80μ1的0.0 lmg/ml的PEG-PEI溶液加 入到 10ml EP管中，在转速为 10(Vortex-2，Genie，Scientific Industries)的条件下加入 80μ1的OVA溶液，涡旋20s静置lOmin得到PEG-PEI-OVA纳米粒溶液。
[0152] 将制备的PEG-PEI -0VA测粒径，粒径结果如图13所示，粒径多分散指数Pd I (Polydispersity Index)结果如图 14所不。
[0153] 结论：用V0TEX制备的纳米粒子，低浓度比例下直径均在200nm以下，多分散系数在 0.30以下。但在PEG-PEI含量增大后其粒径增大，多分散系数上升，呈现不稳定性；另一边， 利用微流体技术制备的纳米粒子，低浓度比例下粒径分布均在l〇〇nm以下，多分散系数均在 0.15以下，且当浓度比例上升时，纳米粒子仍能保证较优秀的粒径和多分散系数，粒径更为 均一，并且Error bar也要小于涡旋方法制备的纳米粒，证明了该方法的重现性好。
[0154] 实施例8采用Tesla结构芯片制备的PEG-PEI-0VA的生物学效果研究
[0155] 参照实施例7的方法制备获得PEG-PEI-0VA纳米粒，PEG-PEI与0VA的质量比例范围 是0.02~0.08。将制备的不同质量比的PEG-PEI-0VA纳米粒溶液稀释至0VA浓度为O.lmg/ ml，取30μ1的PEG-PEI-OVA纳米粒稀释液加到96孔板中与120μ1的树突状细胞液，细胞密度 是8X105/ml，37°C细胞培养箱中共孵育过夜，然后将150μ1的Β3Ζ细胞液(细胞密度为1.4Χ 106/ml)加入到孔里，一起共孵育24h，最后用ELISA试剂盒检测Β3Ζ细胞分泌的IL-2的浓度， 考察PEG-PEI-OVA纳米粒的抗原提呈效果。
[0156] 结果如图15所示，通过微流体方式制备的不同质量比例的PEG-PEI-OVA纳米粒都 可以促进B3Z细胞分泌IL-2上调。本发明采用Tesla的结构芯片制备的PEG-PEI-OVA纳米粒 相比于对照组抗原提呈效果提高了 8倍。本发明采用Tesla的结构芯片制备的PEG-PEI-OVA 纳米粒相比于传统方法抗原提呈效果提高了 0.5倍。
[0157] 实施例9采用Tesla结构芯片和传统涡旋方法制备C12-PEI-BSA纳米粒的比较
[0158] (1)首先将带负电的蛋白BSA溶于1 OmM HEPES，pH = 7.4的缓冲溶液中，配置得到 lmg/ml 的 BSA 溶液；
[0159] (2)将C12-PEI溶于去离子水中配置得到0.03-0.0811^/1111的(：12^^1溶液：
[0160] (3)将步骤（1)中得到的BSA溶液分装到两支lml注射器中，将步骤（2)中得到的 Cl 2-PEI溶液也同样加入到lml注射器中，排除注射器中的气泡，连接好通路，将BSA溶液和 C12-PEI溶液同时栗入到Tesla结构芯片里进行微混合，得到C12-PEI与BSA的复合物溶液， 质量比范围为0.03~0.08，C12-PEI通道的灌注量为100μΙ，控制栗入溶液流速为50μ1/π?η， OVA通道的灌注量为100μΙ，分成两个通道，控制栗入溶液流速为25μ1/η?η。
[0161 ]所有制备条件如下表5所示：
[0162] 表5
[0163]
[0164] 此外，用涡旋方法制备C12-PEI-BSA纳米粒，将100μ1的0.03mg/ml的C12-PEI溶液 加入到l〇ml EP管中，在转速为 10(Vortex-2，Genie，Scientif ic Industries)的条件下加 入100μ1的BSA溶液，涡旋20s静置lOmin得到C12-PEI-BSA纳米粒溶液。
[0165] 将制备的C12-PE I -BSA测粒径，粒径结果如图17所示，粒径多分散指数Pd I (Polydispersity Index)结果如图 18所不。
[0166] 结论:从粒径结果来看，微流体方法制备的C12-PEI-BSA纳米粒子要略小于涡旋方 法制备的纳米粒，从Pdl上来看，微流体制备的粒子Pdl即粒子多分散系数普遍小于0.2,这 个数值要小于祸旋方法制备的粒子，同时Error bar略小，进一步证明了微流体制备纳米粒 粒径小，粒子较为均一，重现性较好的优点。
[0167] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出 若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更 动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对 上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种载有负电性蛋白的纳米粒的制备方法，包括步骤： (1) 将负电性蛋白溶解，获得蛋白溶液； (2) 将载体材料溶解，获得载体材料溶液； (3) 将蛋白溶液和载体材料溶液分别从不同通道入口栗入到Tesla结构芯片中，微混 合，获得载有负电性蛋白的纳米粒。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述负电性蛋白选用抗原蛋白。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体材料选用阳离子多聚物材料。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述阳离子多聚物材料选自聚乙烯亚胺或 聚乙烯亚胺衍生物。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的分子量范围是423Da~ 75kDa〇6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺衍生物选自可降解PEI、 PEG修饰的PEI、或疏水性PEI。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述蛋白和载体材料的质量比 例范围是(0.01~1):1。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述Tesla结构芯片含有Tesla 结构单元、入口通道和出口通道。9. 如权利要求1~8任一项所述方法在制备粒径小且分散均匀的载有负电性蛋白的纳 米粒中的用途。10. -种由权利要求1~8任一项所述方法制备获得的载有负电性蛋白的纳米粒。11. 如权利要求1~8任一项所述方法或如权利要求10所述的载有负电性蛋白的纳米粒 在制备肿瘤疫苗中的用途。 12. Tesla结构芯片在制备纳米粒中的用途。
【文档编号】B01J19/00GK106038514SQ201610716254
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月24日
【发明人】邱瑶, 陈剑, 李真珍, 奚春明, 陈龙, 陆海燕, 李方
【申请人】上海交通大学, 上海新亚药业闵行有限公司