专利名称：：一种用于治疗大肠癌的药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及化学领域，尤其涉及组合物，特别是一种用于治疗大肠癌的药物组合物。
背景技术：
：现有技术中，用于治疗大肠癌的药物组合物的作用均不理想。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于治疗大肠癌的药物组合物，所述的这种用于治疗大肠癌的药物组合物要解决现有技术中用于治疗大肠癌的药物组合物的作用不理想的技术问题。本发明一种用于治疗大肠癌的药物组合物，所述的药物组合物由5-氮脱氧胞苷和雷帕霉素组成。进一步的，所述的5-氮脱氧胞苷和雷帕霉素的质量比在66.7:l到249.6:l范围之间。进7步的，所述的药物组合物中含有药学上可接受的载体。进一步的，所述的药物组合物的剂型为药学上可接受的任何一种剂型。本发明的作用原理是5-氮脱氧胞苷(5-aza-dC，5-aza-2，-deoxycytidine)是目前已知最强的Dnmt(DNAmethyltransferase，DNA甲基化酶)特异性抑制剂，相对分子质量228.21。在DNA合成时掺入到新合成的DNA中，与DmM共价结合，抑制DNA甲基化并活化相关基因(尤其是抑癌基因)，进而抑制细胞增值，促进凋亡和诱导分化。雷帕霉素(rapamycin，RPM,商品名Sirolimus)是美国H0MEPRODUCTS公司研制开发的抗移植排异反应的药物，1999年9月经美国FDA批准上市。RPM是从吸水性链霉菌(str印tomyceshygroscopicus)发酵液中提取出来的一种大环内酯类抗生素(分子式C5tH79NO,3，相对分子质量914.2)，具亲脂性，易溶于乙醇、氯仿、丙酮等有机溶剂，微溶于水，不溶于乙醚。最初RPM被研究作为低毒性的抗真菌药物，1977年发现RPM具有免疫抑制作用，1989年开始把雷帕霉素作为治疗器官移植排斥反应的新药进行试用，近年来又发现其具有抗肿瘤作用。从目前动物实验及临床应用的效果看，雷帕霉素是一种疗效好、低毒、无肾毒性的新型免疫抑制剂，能抑制多种细胞的增生，临床用于治疗器官移植后免疫排斥反应，以及心血管支架术后的血管再狭窄。RPM在哺乳动物细胞内的靶点是mTOR(mammaliantargetofmpamydn，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)，两者的结合可阻断mTOR介导的信号传导通路。本发明将5-氮脱氧胞苷和雷帕霉素组合，可下调大肠癌细胞mTOR及其下游p70s6K、4E-BP1蛋白磷酸化水平，从而抑制了大肠癌细胞增殖活力，同时阻滞了大肠癌细胞生长周期，进而起到抑制人大肠癌细胞生长，减低小鼠太肠癌的发生率和减小肿瘤体积的作用。本发明和己有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明将5-氮脱氧胞苷和雷帕霉素组合，比单独使用5-氮脱氧胞苷或雷帕霉素来治疗大肠癌，更能明显抑制人大肠癌细胞生长，能够显著地减低小鼠大肠癌的发生率和减小肿瘤体积。图l是本发明的实施例中的SW480细胞的一个WesternBlot检测结果图。图2是本发明的实施例中的SW480细胞的另一个WesternBlot检测结果图。图3是本发明的实施例中的SW480细胞的另一个WesternBlot检测结果图。图4是本发明的实施例中的HCT116的一个WesternBlot检测结果图。图5是本发明的实施例中的HCT116的另一个WesternBlot检测结果图。图6是本发明的实施例中的HCT116的另一个WesternBlot检测结果图。图7是本发明的实施例中的HT29的一个WesternBlot检测结果图。图8是本发明的实施例中的HT29的另一个WesternBlot检测结果图。图9是本发明的实施例中的HT29的另一个WesternBlot检测结果图。图IO是本发明的实施例中的一个SW480细胞的周期检测图谱。图1—1是本发明的实施例中的另一个SW480细胞的周期检测图谱。图12是本发明的实施例中的另一个SW480细胞的周期检测图谱。图13是本发明的实施例中的另一个SW480细胞的周期检测图谱。图14是本发明的实施例中的一个HCT116细胞的周期检测图谱。图i5是本发明的实施例中的另一个HCT116细胞的周期检测图谱。图16是本发明的实施例中的另一个HCT116细胞的周期检测图谱。图17是本发明的实施例中的另一个HCT116细胞的周期检测图谱。图18是本发明的实施例中的一个HT29细胞的周期检测图谱。图19本发明的实施例中的另一个HT29细胞的周期检测图谱。图20本发明的实施例中的另一个HT29细胞的周期检测图谱。图21本发明的实施例中的另一个HT29细胞的周期检测图谱。图22是DMS0作用组中小鼠大肠癌的大体在体示意图。图23是DMSO作用组中小鼠大肠癌的大体离体示意图。图24是DMS0作用组中腺癌及部分粘液腺癌病理图(10X20)。图25是DMS0作用组中腺癌及部分粘液腺癌病理图(10X40)。图26是Rapamycin作用组中小鼠大肠癌的大体离体示意图。图27是Rapamycin作用组中小鼠大肠癌的另一个大体离体示意图。图28是R邵amycin作用组中小鼠大肠癌的另一个大体离体示意图。图29是Rapamycin作用组中的中分化腺癌病理(10X20)病理图。图30是Rapamycin作用组中的中分化腺癌病理(10X20)另一个病理图。图31是R即amycin作用组中的高分化腺癌病理(10X20)病理图。图32是5-aza-dC作用组中小鼠大肠癌的大体离体示意图。图33是5-aza-dC作用组中小鼠大肠癌的另一个大体离体示意图。图34是5-aza-dC作用组中的高分化腺癌病理(10X40)的病理示意图。图35是5-aza-dC+RPM作用组中小鼠大肠病变的大体离体示意图。图36是5-aza-dC+RPM作用组中小鼠大肠病变的另一个大体离体示意图。图37是5-aza-dC+RPM作用组中高分化腺癌病理(10X20)的病理示意图。具体实施例方式实施例l细胞培养SW480细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,SIBC)的培养基为RPMI-1640完全培养液(10%胎牛血清，100U/ml青/链霉素)，HT29和HCT116细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，SIBC)的培养基为McCOY，S5AMEDIUM(Sigma，USA)完全培养液(10%胎牛血清，100U/ml青/链霉素)，三者的培养条件均为95%空气、5%C02、95%湿度、37'C恒温。实施例2MTT比色实验完全培养液稀释单细胞悬液至2xl04/ml3xl04/ml，以100(al/孔接种至96孔培养板。培养24h后，在细胞处于对数生长期时，弃原培养液，加入各组干预药物工作液(分别设以下药物干预组5-aza-dC5pmol/L、5—aza-dC10|amol/L、RPM10nmol/L、5—aza—dC5pmol/L+RPM10nmol/L、5-aza-dC10|Limol/L+RPM10nmol/L;在5-aza-dC5^imol/L+RPMlOnmol/L联合作用组，5-aza-dC与RPM的质量比为124.8:1，在5-aza-dC10|umol/L+RPM10nmol/L联合作用组，5-aza-dC与RPM的质量比为249.6:1)，对照组加入完全培养液，以及0.5y。PBS、0.5%二甲基亚砜(DMSO)。继续培养24、48、72、96h后，每孔加入5mg/mlMTT(methylthiazolylbluetetrazoliumbromide,(3-(4，5-dimethylthiazol-2画yl)-2，5-diphenytetra-zolium,Calbiochem，SanDiego，CA，USA)溶液20^1，37。C温育4h后弃上清，加入100inl/孔DMSO，避光室温摇床振荡20min。酶标仪双波长(570nm、630nm)测定各孔吸光度(A)值并记录结果。每组复测5L，重复试验三次，结果以；土SD表示。结果见表l。表l5-aza-dC、RPM单独及联合作用对三种细胞活力的影响(；土SD。/。)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由上表可知，5-aza-dC和RPM联合作用比单独使用5-aza-dC和RPM能够明显降低上述三种大肠癌细胞的活力。实施例3细胞总蛋白的提取接实施例2，5-aza-dC10|umol/L、RPM10nmol/L、RPM10nmol/L+5-aza-dClOpmol/L作用48h后，以RIPA裂解法抽提细胞总蛋白，具体步骤如下细胞裂解缓冲液(Tris.HCl，50mmol/L，pH7.5;NaCl，150mmol/L;NP-40,1°/。；脱氧胆酸钠，0.5%;SDS，0.1%;EDTA，1mmol/L;PMSF，1mmol/L;Leupeptin，2pg/ml)100|nl悬浮细胞团；涡旋30s，冰上静置5min，重复三次；14000rpm4。C离心10min，收集上清液，即为总蛋白。实施例4免疫印迹接实施例3，雷帕霉素靶蛋白mT0R、底物-核糖体蛋白S6激酶p70s6K使用7%SDS-PAGE电泳；真核细胞启动子4E结合蛋白14E-BP1使用SDS-PAGE为12%。所用抗体如下兔抗人GAPDH抗体(1:1000，Sigma)，兔抗人mTOR抗体(1:1000，#2972，CellSignaling,USA)，兔抗人磷酸化mTOR抗体(Ser2448，1:1000，#2971，CellSignaling,USA)，兔抗人p70s6K抗体(1:500，#9202,CellSignaling,USA)，兔抗人磷酸化p70s6K抗体(Thr421/Ser424，1:1000，#9204S,CellSignaling,USA)，兔抗人4E-BP1抗体(1:500，#9452，CellSignaling,USA),兔抗人磷酸化4E-BPl抗体(Thr70，1:500，的455S,CellSignaling,USA)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1:2000，#7404，CellSignaling,USA)。每组实验重复三次。蛋白条带以SnmrtView生物电泳图像分析软件进行密度扫描，以磷酸化蛋白(P-4E-BP1、P-p70s6K、P-mTOR)与相应总蛋白(T-4E-BP1、T-p70s6K、T-mTOR)条带密度的比值进行磷酸化蛋白相对定量，结果以；士SD表示。结果见图l、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8和图9。由图l、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8和图9可知，5國aza-dC和RPM联合作用比单独使用5-aza-dC和RPM能够明显下调大肠癌细胞mTOR及其下游p70s6K、4E-BP1蛋白磷酸化水平。实施例5细胞周期检测对数生长期细胞以无血清培养基(RPMI-1640，McCOY，S5AMEDIUM)培养24h使之同步化。更换培养液为含有不同药物(5-aza-dC10]Limol/L、RPM10nmol/L、5-aza-dC10|imol/L+RPM10nmol/L)的完全培养液，继续培养48h。以0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗漆，4。C无水乙醇固定后，制成约106个/ml的单细胞悬液，与含1%RNA酶的Tris-HCL缓冲液(pH7.4)共同孵育10min，以碘化丙啶(PI)染色后，进行流式细胞仪检测。根据相对不同DNA含量的细胞分布图，拟合各周期细胞的百分率。每组复测8个样品，重复试验三次，结果以5士SD表示。结果见表2和图10、图11、图12、图13、图14、图15、图16、图17、图18、图19、图20、图21。表2SW480、HT29、HCT116细胞周期检测结果(X±SD%)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由上表可知，5-aza-dC和RPM联合用药对SW480、HT29、HCT116三种细胞的生长周期均有显著作用，但作用位点不同。可将SW480细胞阻滞于G2期；将HT29细胞阻滞于S期及G2期；将HCT116细胞阻滞于S期。实施例6动物试验从中科院松江实验动物基地购买S-ICR小鼠150只(SCXK(沪)2003掘3)，清洁级，雌性，近交系，体重1820g。饲养一周后开始大肠癌造模试验，给予0.4%二甲肼(DMH)0.05ml/10g，每周1次，颈后皮下注射，共22周。于第16周起给予各组干预药物。每组动物25只。给药方式5-aza-dC0.1mg/ml，O.lml/只，每周1次，腹腔注射；RPM0.5|ig/ml，O.lml/只，隔天1次，腹腔注射；5-aza-dC+RPM联合作用组应用5-aza-dC(Umg/ml，O.lml/只，每周1次，腹腔注射，同时应用RPM0.5^g/ml，O.lml/只，每周三次，腹腔注射(在5-aza-dC+RPM联合作用组，5-aza-dC与RPM的质量比为66.7:1);对照组分别给予生理盐水O.lml/只，每周1次，腹腔注射，DMSO0.1ml/只，隔天1次，腹腔注射。其中DMH、5-aza-dC以生理盐水溶解，RPM以DMSO溶解，每次腹腔注射DMSO总量不超过O.lml。至24周分批处死实验动物，解剖后观察大肠病变，按照公式|^=长*宽*高/2]计算肿瘤体积。自病变明显处取材，中性甲醛固定后制作石蜡切片，HE染色后观察。结果见表3，图22、图23、图24、图25、图26、图27、图28、图29、图30、图31、图32、图33、图34、.恩35、图36、图37。表3.24W各组小鼠大肠粘膜病理组织学变化癌前病变浸润癌肿瘤体积肿瘤组别例数LINHIN高分化中分化低分化(l级)(2级)(3级)(L*W*H/2)(mm3)发生率NaCl2406(14)12(18)5(6)1(1)16.375±6.80275%DMSO183(3)10(16)3(3)1(1)16.136±6.85577.78%5sz3-dC203(3)8(14)5(7)4(4)015.734±8.76945%A183(4)7(18)5(14)3(5)06.153±2.192A44,440/0A5A+RPM23即l)10(15)2(2)1(1)03.083土0.629"13.04%''Control200000000%注1.数据以病例数(病灶数)表示。2.WHO工作小组将上皮内瘤变(Intraepithelialneoplasia,IN)分为两级，即低级别(lowgrade)和高级别(highgrade)。低级别上皮内瘤变(LIN)指结构和细胞学异常限于上皮的下半部，相当于轻度和中度异型增生；高级别上皮内瘤变(HIN)则指结构和细胞学异常扩展到上皮的上半部，乃至全层，相当于重度异型增生和原位癌。3.高、中、低分化浸润癌与肿瘤分级的l、2、3级相对应。4.组间比较采用卡方检验，A与NaCl组比较代0.05，A与DMS0组比较AO,01，T与RPM组比较代0.05，*与5-aza-dC组比较代0.05。由上表可知，5-aza-dC禾卩RPM联合作用比单独使用5-aza-dC和RPM能够明显降低大肠癌的发生率，并减小肿瘤体积。由以上可知，本发明的由RPM和5-aza-dC组成的药物组合物能够明显抑制人大肠癌细胞生长，其效果优于5-aza-dC10inmol/L和RPM10nmol/L单独用药。本发明能够减低小鼠大肠癌的发生率，减小肿瘤体积。权利要求1.一种用于治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物由5-氮脱氧胞苷和雷帕霉素组成。2.如权利要求l所述的用于治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于所述的5-氮脱氧胞苷和雷帕霉素的质量比在66.7:l到249.6:l范围内。3.如权利要求1或2所述的用于治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物中含有药学上接受的载体。4.如权利要求1或2所述的用于治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物的剂型为药学接受剂型。全文摘要本发明公开了一种用于治疗大肠癌的药物组合物，所述的药物组合物由5-氮脱氧胞苷和雷帕霉素组成，进一步的，所述的5-氮脱氧胞苷和所述的雷帕霉素的质量比为66.7∶1～249.6∶1。本发明和单独的使用5-氮脱氧胞苷或雷帕霉素来治疗大肠癌相比，能够明显抑制人大肠癌细胞生长，能够显著的减低小鼠大肠癌的发生率和减小肿瘤体积。文档编号A61K31/7068GK101292992SQ20071004017公开日2008年10月29日申请日期2007年4月28日优先权日2007年4月28日发明者张燕捷,房静远申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院