专利名称：：一种标记刺参个体及检测该标记的方法
技术领域：
：本发明涉及水产养殖
技术领域：
，尤其涉及一种标记剌参个体以及检测该标记的方法。
背景技术：
：海参具有很高的营养、保健和药用价值，剌参是可食用的海参中品质最好、分布最广、产量最大的一种，也最具发展前途。不断增加的市场需求导致对野生剌参的过度捕捞，引发剌参种群数量减少、资源枯竭。开展剌参的增殖放流工作，不但有利于恢复剌参资源，增加产量，还可以利用剌参对沉积物的扰动，改善和修复受损底栖环境。对剌参进行标记可以科学、准确地评估增殖放流的效果，更深入地了解其在自然环境中的生长情况、存活率和分布。然而，剌参体壁柔软，缺乏钙质骨骼，对异物有排异反应，故难以使用传统标记方法对其进行标记。国内尚未见标记海参的相关方法。国外已有方法中，包括刻画海参表皮、植入人造橡胶标志物(visibleelastomerimplants)、编码线标签(coded-wiretags)标记、基因标记(geneticmarkers)等。Mercier，A.，Battaglene，S.C.，Hamel，J._F.，(2000).〃Periodicmovement,recruitmentandsize—relateddistributionoftheseacucumberHolothuriascabrainSolomonIslandshydrobiologia440:81-100，(所罗门群岛糙海参周期性分布、补充和与个体大小有关的分布)介绍了一种在海参表皮刻画记号方法，该方法主要是用刀片在海参体壁刻数字或记号进行标记。该种标记在刻画后的几周内消褪，不能有效地标记海参。Battaglene，S.C.andJ.D.Bel1(1999).PotentialofthetropicalIndo—Pacificseacuc咖ber，Holothuriascabra，forstockenhancement.StockEnhancementandSeaRanching:478490606(热带印度-太平洋糙海参的增殖潜力)，介绍了植入人造橡胶标记物(visibleelastomerimplants)及编码线标签(coded-wiretags)标记海参的方法，该方法引起海参的排异反应，致使标记物丢失。Uthicke，S.andJ.A.H.Benzie(2002).Ageneticfingerprintrecapturetechniqueformeasuringgrowthinunmarkableinvertebrates:negativegrowthincommerciallyfishedholothurians(Holothurianobilis).MarineEcology-ProgressSeries241:221-226(用于测量难以标记无脊椎动物生长的基因指纹图谱重捕技术有经济价值的黑乳参的负增长)，介绍了一种基因标记方法，该方法使用基于扩增片段长度多态性的DNA指纹图谱分析技术标记海参，该方法价格昂贵，操作复杂，不宜大规模应用。
发明内容针对现有技术缺乏有效标记剌参的方法，为了克服上述各种现有标记方法的缺陷，本发明的目的在于提供一种容易操作、便于识别、标记保持时间长，而且避免排异反应的标记剌参个体及检测该标记的方法。本发明的技术方案是—种标记剌参个体的方法，包括以下步骤(1)取一定数量的健康剌参暂养在流水水槽中，禁食24-48小时，连续向水槽中充气(空气)；(2)配制浓度为40-160mg/L的茜素络合指示剂(英文名AlizarinComplexonedihydrate，分子式C19H15N08)的染料溶液；(3)将剌参放入所述茜素络合指示剂的染料溶液中浸泡16-48小时，期间连续充气(空气)，停止喂食；所述剌参为幼参或成参。所述茜素络合指示剂的染料溶液，溶剂为海水。其中，海水可以为经过沉淀、沙滤得到的海水。—种检测采用上述标记方法标记的剌参的方法，包括以下步骤(1)刮取小米粒大小剌参的体壁表皮或结缔组织，铺在载玻片上；(2)向剌参体壁表皮或结缔组织上滴加1-2滴10wt%NaCIO水溶液，待体壁表皮或结缔组织溶解后，滴加蒸馏水1-2滴进行稀释，加盖玻片；(3)在荧光显微镜荧光激发波长510-560nm下，观察用上述方法制成的载玻片。所述体壁表皮或结缔组织溶解时间为0.5-2h。本发明的有益效果是1、本发明的标记方法完全是在剌参正常生长状态下进行，无需对剌参进行注射或麻醉，不损伤剌参活体，减少了标记的操作步骤，避免剌参活力降低，降低死亡率。2、本发明所使用的染料价格低廉易得，节省了标记所需费用。3、此外，采用本发明的标记方法，由于染料仅对剌参体壁内骨片染色标记，并未植入外来异物，避免剌参对异物的排异反应，从而延长了标记的保留时间。具体实施例方式下面将结合具体实施例对本发明作进一步描述实施例1:1、标记步骤(1)取15头10士3.46g健康剌参暂养在流水水槽中，禁食24h，连续充气(空气)；(2)将40mg茜素络合指示剂溶解在1000mL过滤海水中，不断搅动，使茜素络合指示剂完全溶解(必要时使用超声波清洗仪加快溶解速度)；(3)将剌参放入溶液中浸泡16h，其间连续充气(空气)，停止喂食。(4)16h后，将所有剌参从茜素络合指示剂溶液取出后，15头剌参即正常摄食、活动。l个月后，海参死亡O只，存活率为100%。2、检测步骤(1)刮取小米粒大小剌参的体壁表皮或结缔组织，铺在载玻片上；(2)用普通滴管滴加1滴10wt%NaC10水溶液，待体壁表皮或结缔组织溶解后(lh);用普通滴管滴加蒸馏水l-2滴进行稀释，加盖玻片；(3)在荧光显微镜荧光激发波长510-560nm下观察，其中染色的骨片发出红色荧光，未染色的骨片不可见。1个月后，所有被标记的剌参个体，均可检出荧光标记。实施例2:与实施例1不同之处在于1、标记步骤(1)取30头4.49士1.27g健康剌参暂养在流水水槽中，禁食36h，连续充气(空气)；(2)将160mg茜素络合指示剂溶解在1000mL过滤海水中，不断搅动，使茜素络合指示剂完全溶解(必要时使用超声波清洗仪加快溶解速度)；(3)将剌参放入溶液中浸泡24h，其间连续充气(空气)，停止喂食。(4)24h后，将所有剌参从茜素络合指示剂溶液取出后，30头剌参即正常摄食、活动。l个月后，海参死亡2只，存活率为93.3%。2、检测步骤(1)刮取小米粒大小剌参的体壁表皮或结缔组织，铺在载玻片上；(2)用普通滴管滴加1滴10wt%NaC10水溶液，待体壁表皮或结缔组织溶解后(2h);用普通滴管蒸馏水l-2滴进行稀释，加盖玻片；(3)在荧光显微镜荧光激发波长510-560nm下下观察，被染色的骨片发出红色荧光，未被染色的骨片不可见。1个月后，所有被标记的剌参个体，均可检出荧光标记。实施例3:与实施例l不同之处在于1、标记步骤(1)取20头15士7.26g健康剌参暂养在流水水槽中，禁食48h，连续充气(空气)；(2)将80mg茜素络合指示剂溶解在1000mL过滤海水中，不断搅动，使茜素络合指示剂完全溶解(必要时使用超声波清洗仪加快溶解速度)；(3)将剌参放入溶液中浸泡48h，其间连续充气(空气)，停止喂食。(4)48h后，将所有剌参从茜素络合指示剂溶液取出后，20头剌参即正常摄食、活动。l个月后，海参死亡1只，存活率为95%。2、检测步骤(1)刮取小米粒大小剌参的体壁表皮或结缔组织，铺在载玻片上；(2)用普通滴管滴加1滴10wt%NaC10水溶液，待体壁表皮或结缔组织溶解后(0.5h);用普通滴管蒸馏水1-2滴进行稀释，加盖玻片；(3)在荧光显微镜荧光激发波长510-560nm下观察，被染色的骨片发出红色荧光，未被染色的骨片不可见。1个月后，所有被标记的剌参个体，均可检出荧光标记。表1:实施例中被标记剌参的标记检出和存活情况<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>所有先将剌参禁食一段时间，再使用茜素络合指示剂溶液对剌参进行浸染的标记方法，以及先用NaC10水溶液处理用茜素络合指示剂溶液标记过的剌参体壁表皮或结缔组织，然后再放在荧光显微镜下检测的方法，都将落在本发明的保护范围之内。经实施，共标记剌参65头，从茜素络合指示剂溶液取出后，剌参即正常摄食、活动。1个月后，成活率95.38%，经检测，所有被标记的剌参个体，均可检出标记物。权利要求一种标记刺参个体的方法，其特征在于，包括以下步骤a取健康刺参暂养在流水水槽中，禁食24-48小时，连续向水槽中充气；b配制浓度为40-160mg/L的茜素络合指示剂染料溶液；c将刺参放入所述茜素络合指示剂染料溶液中浸泡16-48小时，期间连续充气，停止喂食。2.根据权利要求1所述的标记剌参个体的方法，其特征在于所述剌参为幼参或成参。3.—种检测采用权利要求1所述方法标记剌参的方法，其特征在于，包括以下步骤a刮取小米粒大小剌参的体壁表皮或结缔组织，铺在载玻片上；b向剌参体壁表皮或结缔组织上滴加10wt%NaClO水溶液，待体壁表皮或结缔组织溶解后，滴加蒸馏水1-2滴进行稀释，加盖玻片；c在荧光显微镜荧光激发波长510-560nm下，观察用上述方法制成的载玻片。4.根据权利要求3所述的标记剌参个体的方法，其特征在于体壁表皮或结缔组织溶解时间为0.5-2h。全文摘要本发明涉及水产养殖
技术领域：
，尤其涉及一种标记刺参个体以及检测该标记的方法。标记时，先将刺参禁食一段时间，然后将其用茜素络合指示剂茜素络合指示剂溶液浸泡16-48小时。检测时，先用NaClO水溶液处理用茜素络合指示剂溶液标记过的刺参体壁表皮或结缔组织，然后再放在荧光显微镜下检测。本发明的标记方法完全是在刺参正常生长状态下进行，无需对刺参进行注射或麻醉，不损伤刺参活体，减少了标记的操作步骤，避免刺参活力降低，降低死亡率。而且所使用的染料价格低廉易得，节省了标记所需费用。文档编号A01K61/00GK101785438SQ20101010539公开日2010年7月28日申请日期2010年1月29日优先权日2010年1月29日发明者刘鹰,杨红生,王清,赵鹏,邱天龙申请人:中国科学院海洋研究所