利用颗粒标记物检测分析物的制作方法

专利名称：利用颗粒标记物检测分析物的制作方法
有关的申请本申请要求Yguerabide等人于1996年4月25日递交的申请的优先权。该申请的题目为“利用颗粒标记物检测分析物”，其编号为美国临时申请号60/016,383，包括附图在内的全文特此引入作为参考。发明背景以下为与本方法有关的、业已存在的检测方法概述。同时这亦是对有助于读者理解本发明细节的相关科学所作的总结。但这不应该被认为承认所引述的任一方法先于本发明。引用的方法这里特此引入作为参考，以致使对本发明实践有益的技术步骤和方法不必在此处赘述。因此，申请人特别引入与“结合对”方法学一般方法以及光散射测量方法有关的部分。灵敏的分析物检测方法结合对(亦称为配体受体，分子识别结合等)技术在生物医学的许多应用上起着重要作用，并且在环境科学、兽医学、医药研究、食品和水质量控制等领域正在获得重要地位。为了检测低浓度样品(低于1微微摩尔)，荧光，发光、化学发光或电化学发光标记及检测方法经常被使用。
为了在诊断学领域检测低浓度样品，化学发光和电化学发光方法正在得到广泛应用。通过对发光分子数目或光子产生事件放大多倍以产生“信号放大”从而允许低浓度样品探测，化学发光和电化学发光方法提供了一种探测低浓度样品的方法。
此外，聚合酶链式反应方法和其它相关技术在放大样品中的核酸分析物的数目方面已得到广泛使用。通过加入适当的酶，反应物并使用温度循环方法，核酸分析物分子数目被放大从而使分析物用最熟知的方法检测出来。在发展新的信号产生和探测系统中的高度商业活动，以及利用信号和分析物分子放大的新型仪器和成套测试元件的发展表明灵敏探测方法的重要性及其需求性。
然而，上述信号和分析物分子放大的方法具有一定的局限性，这使得用这些方法进行探测的过程复杂，不易使用，费时并且价格昂贵。化学或酶反应的干扰问题、污染、复杂且多步骤，对单步骤“均一”(非分开的)方法的有限适用性，以及对昂贵和复杂仪器的需求正是能力域研究人员不懈努力以改进的方面。
因此，要求探测分析物的步骤和仪器易于使用，定量，多分析物分析以及价格便宜，这种要求十分巨大。如此的步骤，试剂盒以及仪器将克服现有的信号和分析物分子放大方法的缺点和局限性，且将应用于研究，具体的诊疗场所(医生诊所、急诊室、野外等)以及大量的检验应用中。
本发明的靶是提供一比以前可能的检验方法更易于检测样品中一种或多种低浓度分析物的新方法。本发明无需对信号或分析物分子进行放大就可以检测低浓度的分析物。
本发明提供一探测分析物的信号探测系统，且步骤可以简化，步骤和试剂的量和类型可以减少。本发明提供对样品中单一或多个分析物进行定量探测的方法。本发明亦可大大减少分析所需的不同测试数量及样品材料量。对具体测试数量的减少导致费用降低及废物减少，特别是必须处理的医学相关废物。光散射检测方法及光散射颗粒的性质有关颗粒光散射现象，诊断方法中颗粒标记的应用以及诊断方法中光散射方法的应用已有大量的研究信息。作为与本发明相关的技术，上述信息将在下面的讨论中加以叙述，但这并非承认任何上述信息对于本发明的权利要求而言是优先的。基于上述信息的技术作为背景知识提供于此，有益于理解本发明的新颖性和应用性。
光散射的一般研究包括范围十分广泛。近一百年来，光散射现象得到了深入地研究，光散射研究在人类致力发展的不同方面上的应用十分广泛且多种多样。
光散射的经典理论最初是由Rayleigh发展起来的。该经典理论处理较小的、均一的、非光吸收的、直径约为入射辐射波长1/20或短些的球形颗粒的光散射。由均一，任意大小和组成的球形颗粒所引入的光散射是由较为一般的光散射表象理论处理的，该理论是由Mie在晚些时候发展起来的。Mie理论适用于光吸收及非光吸收颗粒。Mie理论亦表明当颗粒尺寸大大小于入射光波长时，Rayleigh散射方法可以容易地推广到适用于吸收光的颗粒情形。对于这些小直径的颗粒，Mie理论和推广的Rayleigh理论给出相似的结果。光散射(弹性)可以用经典或量子力学观点来处理。经典理论可以给出很好的定量描述。
除描述散射光和其它电磁辐射的基本理论以外，下面的参考文献还提供了历史背景《小颗粒的光吸收和散射》(1983),C.F.Bohren,D.R.Huffman,John Wiley and Sons；《光和其它电磁辐射的散射》(1969),M.Kerker,Academic Press。
下列出版物提供了光散射现象的进一步的背景信息。
Zsigmondy在《胶体和超微显微镜-胶体化学和超微显微术手册》(1914,John Wiley&Sons,Inc.)中描述了金颗粒和其它类型的颗粒不同的光散射性质。
Hunter在《胶体科学基础》(第一卷，105页，1991)中描述了光学显微镜，超微显微镜和电子显微镜在颗粒观察方面的应用。
Shaw等在《胶体和表面化学导论》(第2版，41页，1970)中描述了胶体的光学性质和电子显微术的应用以及暗场显微术，如超微显微术。
Stolz在“Springer Tracts”(130卷)中描述了时间分辨光散射方法。
Klein和Metz在《摄影科学和工程》(第5卷，5-11,1961)中叙述了明胶中胶体银颗粒的颜色。
Eversole和Broida在《物理评论》(第15卷，1644-1654,1977)中叙述了诸如银、金和铜等不同金属颗粒大小和形状对光散射的影响。
Bloemer等在《物理评论》(第37卷，8015-8021,1988)中叙述了亚微米尺寸银针的光学性质。在Bloemer美国专利5,151,956中描述了该针的应用，在此专利中描述了金属小颗粒对波导中传播的偏振光的表面等离子共振现象。
Wiegal在“Zeitschrift fur Physik”(第136卷，Bd.,642-653，1954)中叙述了胶体银的颜色及电子显微术的应用。探测分析物所用的颗粒，光散射和其它方法的应用近35年以来，在许多不同类型的分析和/或诊断研究中，包括金和银在内的金属颗粒作为相差增强工具或光吸收标记而得到应用。上述应用的大部分集中在细胞免疫化学研究领域，该领域应用金颗粒或银增强金颗粒作为标记物来研究细胞，亚细胞或组织的结构。在这些研究中，常常使用电子显微术探测和定位金属颗粒，包括扫描、透射电镜术及BEI(背散射电子成像)。这些方法利用金属电子密度性质或金属的高原子序数，依靠密度较高的金属产生大量的二次和背散射电子以利于金颗粒的探测(见Hayat，免疫金银染色参考文献，第1页和第1、6、15章；及Hayat，胶体金参考文献第1、5、7章等)。
在光学显微研究中，对于金和银增强金颗粒的应用有许多报道。例如，在1978年，用光学显微术探测了用作免疫金染色的金颗粒。1995年出版的有关光学显微术中金颗粒的应用的评论(见Hayat,免疫金银染色参考文献，第3页)讨论了上述1978年的工作并提出了下列分析“Geoghehan等于1978年首先在石蜡切片中利用胶体金溶胶的红色或粉红色进行光学显微免疫金染色。在半薄树脂切片中，利用光学显微术在包含高浓度标记抗原的细胞器内观察到直径为14nm的金颗粒散射的红光(Lucocq和Roth,1984年)。由于光学显微术免疫金染色灵敏度不如其它免疫细胞化学技术，该技术未得到广泛应用；金颗粒沉积产生的粉红色难以观察”。本段表明如何理解在诊断和分析研究中应用金及其它金属颗粒的光散射特性。本段特别指出“在半薄树脂切片中，利用光学显微术在包含高浓度标记抗原的细胞器内观察到直径为14nm金颗粒散射的红光”。
然而，用白光照明时，14nm金颗粒散射光主要为绿光。由于颗粒在光学显微镜下呈红色，这表明探测到纯散射光以外的某些相互作用。在光学显微镜下所观察到红光可能主要为透射光而非散射光。当金颗粒在细胞组织切片或其它表面的靶位积累足够多时，透射光所产生的红光将被观察到(亦见，J.Roth(1983)，《免疫细胞化学》，2,p.217；及Dewaele等(1983)，《免疫化学技术》，第2卷，第1页，编者为Bullock和Petrusz,Academic Press)。
在上面所提到的引文中，光学显微术中免疫金染色的灵敏度似乎被认为不如其它方法的高，而且金颗粒作为标记物在光镜中的应用未得到广泛接受，由Gao所著1995年出版的评论书中，第12章第198页上涉及相同题目的一段文字引用于下“胶体金最初仅作为标记物在电子显微术(EM)中应用，由于其电子致密性质及二次电子发射特征(Horisberger,1979)。在光学显微术(LM)中直接观察胶体金受到限制。虽然使用高浓度的免疫金，细胞可以被这种试剂染成红色，但在光镜水平由于胶体金尺寸太小而无法探测(Geoghegan等，1978年；Roth,1982年；Holgate等，1983年)。”在上述两段引文中，在光学显微术下对胶体金探测的灵敏度被认为是低的，金颗粒的银增强方法被发展起来以克服这一觉察到的缺点。下面是1995年出版的评论书中的另一段文字“在5微米石蜡切片中，引入结合免疫球蛋白的银增强胶体金颗粒(20nm)导致了光学显微术免疫金染色的真正突破(Holgate等，1983年)。这一方法显著地增加了利用光学显微术探测抗原的灵敏度，效率和精度。使用IGSS，在光镜下可观察到直径为1nm的金颗粒。满足IGSS方法的薄切片亦可在光镜下观察到，特别是在使用相差或表面偏振照明的情形下(Stierhof等，1992年)。”银增强金颗粒方法得到广泛的应用，该增强方法将金颗粒标记物转化为一个金属大颗粒或者尺寸为若干微米或更大的结构。这些结构主要由银组成。在明场光学显微镜下，如此扩大的颗粒可以更容易地被肉眼探测到。用高分辨激光共焦光学显微术和表面偏振光学显微术已经观察到一个个放大了的颗粒。见同一著作26页和203页。
然而，即使使用银增强技术，该领域的研究人员指出该方法的灵敏度和特异性仍达不到其它方法的水平。例如，在T.I.Vener等刊登在《分析生物化学》，198卷，第308-311页，(1991年)上的文中，作者讨论了一高灵敏分析物探测新方法-胶乳杂交分析(LHA)。在该方法中，他们采用充满了很多高荧光的染料分子的直径为1.8微米的聚合物大颗粒作为分析物示踪物，通过荧光信号探测结合的分析物。下面为上文的一段节录“为了评价胶乳杂交分析(LHA)方法的优点，我们将我们的技术与文献中叙述的其它两种间接非放射性技术进行了比较。由于杂交信号银增强链霉抗生物素蛋白胶体金方法为竞争性微粒技术，因此该方法是进行比较的最适当的技术。然而，即使采用了银增强，此方法仍不十分灵敏使用该方法探测到8pg的λ噬菌体DNA，而用胶乳杂交分析可探测到尼龙膜上0.6pg或2×104的λDNA分子。”Stimpson等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92卷，6379-6383页(1995年7月)上描述了实时探测杂交DNA的方法。作者叙述了靶DNA微粒标记物的使用，其作用如下“当用波导的损耗波照明时，光散射源且只有结合于表面的标记物产生信号。…损耗波由波导产生，该波被用来从位于波导表面的多DNA捕获区所吸附的微粒标记物散射光波。由于损耗波从波导表面传播仅几百纳米，未结合或解离标记物不散射光且不需清洗步骤。信号强度足够强可进行表面结合测量，并且可以实时研究光散射标记物的解离；即探测是非限速的。在切片上的杂交模式可用肉眼进行评价或者使用带有8位视频帧获取器的标准CCD相机在1/30秒内得到杂交模式以进行定量分析”。实验采用70纳米直径的金颗粒和200纳米直径的硒颗粒。使用硒颗粒时得到较强的信号。作者指出“在4和40nm DNA之间可产生能鉴别单碱基的足够强的波导信号。因此该波导信号可与荧光信号系统比较。”此方法使用波导和损耗波类型的照明。此外，该方法与目前基于荧光的探测系统的灵敏度一样高。直径70nm及70nm以上的颗粒为优选颗粒。
Schutt等在美国专利(5,017,009)中叙述了探测配体或配体结合体(binding partner)的免疫分析系统，该系统的探测方式比较复杂。这种系统基于以下探测“通过免疫反应使胶体金标记物存在于界面，损耗波因胶体金的存在受到扰动产生背向散射光。…将探测器置于高于临界角的某一背向角位置上，这可以保证系统具有高的信噪比”。作者解释了该免疫分析系统利用散射的全内反射，即损耗波的传播。他们指出胶体金的存在干扰了损耗波传播，导致散射光产生。通过光电倍增管或其它光感元件探测散射光可提供一反应信号。他们指出他们发明的一个重要方面是探测器的物理位置。
“探测器的理想位置为高于临界角的一角度。位于该角度时，探测器仅探测背向光源散射的光波。因此，该位置理想地避免了探测大量液体介质内的占优势的散射光”。入射光束的全内反射被用来产生照明的损耗波模式，并且探测在光学透明的表面上进行。优选特殊装置的应用。
Leuvering等在美国专利4,313,734中叙述了探测特异性结合蛋白的方法。该方法将“金属，金属化合物，或包被金属或金属化合物的多聚核酸水分散相中直径至少为5nm”的颗粒偶联起来以获得标记的成分，利用这种标记成分进行探测。该方法据说特别适合于预测诸如半抗原、抗原和抗体等免疫化学物质。金属颗粒据说已经作为相差增强标记物在电子显微术中使用，但是金属颗粒在免疫分析中的应用则明显地。
“未曾报道过，而在目前则令人惊奇地被证明是可行的是* * *根据业已发展的本发明，金属溶胶颗粒，免疫化学技术不仅比已知的放射或酶免疫技术更为灵敏，而且通过使用不同化学组分的溶胶颗粒作为标记物进一步使用时显示和测量相同测试介质中两种以上的免疫物质成为可能”。金属的实例包括铂、金、银和铜或者它们的盐。
“对于在反应混合物一特定相中的金属和/或所形成的包含金属的聚集物的物理性质和/或浓度，可以通过很多技术进行测量，这些技术本身是已知的。举例说明这些技术在色度测量中，可以利用一些色散的浓色随生理化学条件变化而改变颜色的性质；根据金属溶胶具有颜色这一前述事实，光学方法已经常在定量测量中应用；火焰发射分光光度术或等离子体发射分光光度方法的应用使用时探测成为可能，以及无火焰原子吸收分光光度术，其方法具有高灵敏度”。一样品中两个或两个以上分析物的探测可优先选用火焰发射分光光度术或等离子体发射分光光度方法。对于要求最高灵敏度的探测，可以选用无火焰原子吸收分光光度术方法。
Swope等在美国专利5,350,697中叙述了测量散射光装置。在该装置中，光源的位置使光波以小于临界角的方向入射样品。探测器位于探测临界角包络以外的散射光的位置。
Craig等在美国专利4,480,042中叙述了光散射免疫分析中高折射率颗粒试剂的应用。优选的颗粒由聚合物材料组成。通过测量由于颗粒凝集或凝集抑制所引起的混浊度变化，确定生物学感兴趣的化合物浓度。优选的颗粒直径近似小于0.1μm且大于0.03μm。“较短的波长，如340nm，比较长的波长，如400nm，给出较大的信号区别”。
Cohen等在美国专利4,851,329中及Hansen在美国专利5,286,452中叙述了利用光脉冲颗粒尺寸分析或光流颗粒分析仪探测凝集颗粒的方法。这些系统据说可用于测量抗原或抗体浓度。这些方法使用复杂的装置和特殊的信号处理方式。在Cohen方法中，优选颗粒直径约0.1至1微米；而在Hansen方法中，优选颗粒直径约为0.5至0.7微米。
Okano等在1992年出版的《分析生物化学》(202,120)中叙述了一复杂的三明治式免疫分析方法。该方法使用微颗粒，其数目可在倒置光镜上计数。微颗粒直径约为0.76微米，且羰化微颗粒由丙烯酸酯制成。
Block在美国专利3,975,084中，Kuroda在美国专利5,274,431中，Ford,Jr.在美国专利5,305,073中，Furuya在美国专利5,257,087中及Taniguchi等在美国专利5,311,275中叙述了其它颗粒探测方法。
Geoghegen等在《免疫通讯》(7,1-12,1978)叙述了利用胶体金标记兔抗羊IgG对其它抗体进行非直接探测。使用光镜和电镜探测标记颗粒。金颗粒平均尺寸为18-20纳米且应用明场光学显微术。在电子显微术中，使用了环氧树脂银-金薄切片。“免疫荧光方法和胶体金明场方法观察到相似百分比的表面标记细胞”。电子显微术可以探测到每个细胞标记上1-5个颗粒，但是作者指出“荧光或明场显微术未探测到如此小的标记数量。这样小的标记数量可能表示非特异性Fc受体结合GAD和GAM；在此情形下，GAD和GAM处理的细胞表面上存在低水平的表面免疫球蛋白(S.Ig)”。
Hari等，美国专利5,079,172描述了金颗粒在抗体反应中以及用电镀检测这些颗粒。用15nm的金颗粒举例。在优选的方法中，使用了电镜。
DeMey等在美国专利4,420,558中叙述了利用明场光学显微术方法计数金标记抗体标记的细胞。该方法利用明场配置的光学显微镜，且计数金标记的过氧化物酶阴性细胞时，放大倍数为500倍或更高并使用油浸透镜。对标记表面的观察基于金颗粒的聚集性质。在指出的条件下，金颗粒经历广泛的斑点化；这些位于细胞表面的斑点可用上述方法分辨。40nm的金可给出最佳结果。
De Mey等在美国专利4,446,238中叙述了一类似的明场光学显微免疫细胞化学方法。该方法对组织切片中作为红色标记物的胶体金标记免疫球蛋白进行定位。作者叙述了免疫金染色(IGS)方法“在两种方法中，终产物均是大量的金颗粒在包含抗原的区域内聚集，因此产生胶体金溶胶典型的红色”。
DeBrabander等在美国专利4,752,567叙述了利用明场或表面偏振显微术探测直径小于200nm的单个金属颗粒的方法，并且叙述了用视频象机进行相差增强。发明人指出“在上述步骤中，所使用的典型金属颗粒直径约为10至100nm。一般认为明场显微术的分辨率大约为200nm，显然上述金属颗粒的直径小于明场显微术的分辨极限。因此，所有已知的视觉光学显微方法在探测金属颗粒固定的聚集物时，其应用性均受到限制，这是明显符合逻辑的。只有使用超微显微技术，特别是电子显微术，才可能观察到单个颗粒。
目前十分令人惊奇地发现，如果用电子相差增强处理所产生的象，则在可见光范围内可利用明场光学显微术或表面偏振显微术可以清楚地看到直径小于200nm的单个金属颗粒”。在以下的部分，作者指出“与基于溶胶颗粒免疫分析的现有诊断方法比较，本方法具有高得多的灵敏度。一般而言，现有方法的确基于大量吸附或悬浮金属颗粒的光吸收或散射。对颜色的观察，如在印迹介质上，明显地需要大量颗粒的存在。与此形成对比，本方法使观察和计数单个颗粒成为可能。因此，本方法将大大促进诊断印迹方法应用的发展，现有技术，如视觉或色度技术，灵敏度太低，例如在检测肝炎时”。
Schafer等在1991年出版的《自然》(352卷，第444-448页)叙述了纳米尺寸金颗粒的应用，利用视频增强差分干涉相差显微术可以观察到该类颗粒。一个40nm直径的金颗粒被使用。
DeBrabander等在《细胞迁移与细胞骨架》(第6卷，第105-113页，1986年)(及美国专利4,752,567)中叙述了亚显微金颗粒和明场视频相差增强技术的应用。当使用5-40纳米直径的金颗粒，明场视频相差增强显微术明确地观察到细胞。他们亦指出“单个金属颗粒尺寸小于正负100纳米，吸附在玻片或细胞上，或者经显微注射入细胞时，利用光学显微镜无法看到它们。然而，当利用视频象机在电子学上对相差进行增强时，可以容易地观察到这金属样颗粒”。作者叙述了偏振光表面照明和反射光收集的应用，或者使用单色光和简易像机、透射明场照明的一种“比较方便且明显更为灵敏的方式”。作者指出利用相差显微术可以容易地探测到金颗粒“当使用较大金颗粒(通常20-40nm)时，观察是可能的。与之不同的是，即使5nm金颗粒的致密积累，如在微管等结构上，也无法在光学显微镜上观察到。5nm金颗粒不能产生可探测的红色。最近，通过一物理方法的发展使这一缺点得到改进。在该方法中，使用银盐增大金颗粒的尺寸，这样可产生易观察到的黑色染色。
* * *我们叙述了几乎可在分子水平定位配体的方法。在该方法中，由于分散的，单个的标记物可以明确地与背景结构分开，所以该方法使得人们第一次利用光学显微镜在接近分子水平上定位配体。因此该方法是全新的。由于此方法甚至可用于活细胞，人们因此可以追踪各个蛋白的动态行为。因为该方法将两种很成熟的技术-金标记和视频显微术-结合起来，所以该方法是。使用价格不贵的视频设备，可以完成大多数有关该方法的应用。上述视频设备的价格低于最佳的100×油浸式物镜。进一步而言，将该方法与现代数字图象处理相结合可提供更为广泛的许多应用可能性。一些附加优点值得注意。标记由单个、分散的标记物组成，所以手动和自动(计算机辅助)计数简便且可靠。标记物的较小尺寸使穿入和扩散问题降之最小程度。在该方法中，可以几乎随意地改变标记物电荷。这种可能性有助于在任何特殊应用中消除非特异性结合。”作者将该方法称之为“纳米颗粒视频超微显微术或短纳米视频超微显微术”。Geerts等在《自然》(第351卷，第765-766页，1991年)上叙述了与之相似的技术。
通过对光散射方法目前发展水平、光散射颗粒应用及在诊断学领域光散射方法应用的讨论，可以清楚地看到目前分析物检测方法的局限以及本发明的新颖性和极大的应用性。本发明的目的不仅在于克服目前基于光散射的诊断分析方法的局限性和缺点，而且还可以克服其它诸如信号和分析物分子放大等的非光散射方法的局限性和缺点。此处叙述的本发明容易使用，探测灵敏度高，分析物浓度测量范围比此前可能分析的范围要宽。本发明作为分析物探测的信号发生和探测系统广泛适用于大多数样品类型和分析方式。发明概述本发明涉及探测和测量样品中一个或多个分析物的一种新方法。该方法基于应用一定颗粒的特定组成，尺寸和形状以及探测和/或测量该颗粒一种或多种光散射性质。对于颗粒光散射性质的探测和/或测量与样品中一种或多种分析物存在，和/或量，与否相关。本发明是多用途的，并且可以应用于不同方式以探测和测量样品中一种或多种分析物。
本发明涉及将分析物与至少一种可探测的光散射颗粒结合，颗粒尺寸小于照明光波波长，对样品中一种或多种分析物进行探测的方法。该颗粒的照明条件为放大倍数低于500倍，人眼可探测到由颗粒引起入射光波的散射光。在上述条件下，由颗粒引起的散射光作为一种或多种分析物存在的量度而被探测。仅仅通过确保适当的照明及特异散射光的最有效探测，申请人令人惊奇地确定可以产生一种极为灵敏的探测方法。光波照明和探测的方法被申请人称为“DLASLPD”(将入射光波角度定向以探测仅由颗粒引起的散射光)。
本方法和相关装置的设计使之能够最有效地探测仅由颗粒产生的散射光，因此其灵敏度比使用荧光团或者这类颗粒在上述诸方法中的应用高出许多倍。使用一低放大倍数显微镜(放大倍数2至500倍，如10至100倍)且信号无需任何电子放大，就可以探测这类颗粒。此外，还提供了无需显微镜或成像系统的测量方法。在该方法中，光波通过液相或固相样品时受到散射；液相或固相样品的一种或多种的光散射特性被探测，可以利用这些光散射特性来确定任何特殊样品中分析物存在与否或其含量。
一般而言，光源不需要以任何特殊方式加以处理(如，偏振，或激光或高强度)而仅需要使之定向以保证探测由颗粒所引起的散射光。可以使用空间滤波来确保减少非特异光散射。其它仪器装置和减少杂散光的样品室可以作为空间滤波的辅助设备。
入射光波可以是多色或单色的，稳态或脉冲的，相干或非相干的。它不必是偏振的，并且可由诸如发光二极管(LEO)这样的低功率光源，或12瓦灯泡等产生。正如Stimpson在前文中所描述的那样，光波为非损耗波。光波以一定角度入射可能含有颗粒的样品。当以该角度入射时，除非入射光被颗粒散射，否则其本身不会被探测器检测到。该方法和装置与Swope文中的不同之处在于在临界角范围内，优先选择在照明角范围内，这样的散射可用肉眼观察到。然而，在高于临界角的位置上以及在散射光前进方向的强度包络之外亦可探测到散射光。当使用一成像装置时，如显微镜，本方法优选使用垂直于样品平面的探测器。与在“发明背景”中所叙述的诊断技术不同，申请人发现对特定类型颗粒的探测和测量可以达到很低的浓度和高度的特异性，并且可以利用易于使用且价格较低的方法和装置在宽浓度范围进行探测和测量。本发明在分析物探测上与已知方法相比，使用极为方便、灵敏度、特异性高得多，并且价格便宜。
通过理论模型和物理实验的方法，申请人证实与未包被的金属样颗粒相比，包被的金属样颗粒具有相似的光散射性质；与非金属样颗粒相比，两者均具有优越的光散射性质。“金属样”颗粒意指任何颗粒或颗粒样物质，它们由金属、金属化合物、金属氧化物、半导体(SC)、超导体组成；或指一个颗粒，它由混合组分组成，包含至少0.1％重量的金属、金属化合物、金属氧化物、半导体、或超导材料。“包被”颗粒系指在颗粒表面具有一层附加的金属。该层金属的作用为在不同样品环境中从化学上稳定颗粒和/或通过分子识别机制结合特定分析物。这样的包被举例有无机和/或有机化合物、高聚物、蛋白、肽、激素、抗体、核酸、受体等，“非金属样”颗粒指其不由金属、金属化合物、超导体、金属氧化物、半导体组成，或其混合组分中不含至少0.1％重量的金属、金属化合物、金属氧化物、超导体、或半导体材料。
申请人亦已证实(1)通过探测和/或测量金属样颗粒的一种或多种特异光散射性质即可探测和测量某一样品中的一种或多种分析物。这些光散射性质包括散射光的强度、波长、颜色、偏振、角度依赖性、以及RIFSLIW(散射光强度和/或波长的独立旋转波动)。颗粒散射光的一种或多种上述这些性质可以用来提供有关样品中分析物的信息；(2)通过以不同的组合方式改变金属样颗粒的尺寸，和/或形状和/或组分，可以使一种或多种光散射性质产生极容易探测和测量的光散射信号；(3)利用DLASLPD照明和探测一定尺寸、形状和组分的金属样颗粒可以提供通过光散射性质探测和测量金属样颗粒的高灵敏且易于使用的方法。该方法提供了用于单颗粒探测的易于使用和价格便宜的装置；(4)DLASLPD方法可与颗粒计数和/或积分光强度测量结合使用，以在宽浓度范围探测和测量颗粒；(5)使用折射率增强方法可以增强一颗粒的光散射性质，和/或降低非特异性光背景；(6)使用DLASLPD视频相差增强方法可以提高许多不同类型样品及诊断分析方式探测的灵敏度；(7)对于以微阵列和阵列芯片方式存在于小固相区域中分析物的灵敏探测，一定类型的金属样颗粒比其它颗粒优先使用。以微阵列和阵列芯片方式排列的金属样颗粒通过DLASLPD方法可以进行最容易且价格不贵的探测。通过激光扫描共焦显微术，明场或表面偏振显微术，及反射相差和差分干涉相差显微术，亦可探测以上述形式排列的这类颗粒。然而，这些方法和装置不如DLASLPD方法易于使用，且价格较贵；(8)可以建立适用于特定试剂盒的装置和颗粒类型。这些不同的试剂盒和有关装置可适用于用户使用，便携野外使用，各类医疗卫生地点，如医生诊所，临床门诊，急救室等，研究实验室，和集中的，大批量的测试。本发明的上述方面可以提供对许多不同样品类型及诊断分析方式中一种或多种分析物进行探测。
正如将在以下进行更详细讨论那样，存在许多不同类型的颗粒、光源和光探测机制。此外，所用颗粒的类型可进行许多改变。
在优选实施方案中，颗粒的尺寸，组分和形状适合于产生特定波长的特定光散射信号、颜色、偏振、角度依赖，以及由眼睛或光探测器方法可探测的散射光的RIFSLIW；探测包括颗粒计数的方法，和/或作为颗粒浓度的量度测量散射光的强度；颗粒由金属样材料形成或由包括非金属样材料的混合组分形成，颗粒为球形、椭球形、或非对称的(非对称指形状偏离球形)；颗粒包被为结合剂、聚合物、化学反应基团、基本材料分子、无机和有机化合物；当在分析方式中两个或多个颗粒相互接近时，散射光性质将发生变化，这一现象被利用；包含金属样材料及用基本材料包被以适合于与结合物结合的颗粒被使用；两个或两个以上颗粒足够接近以使这两个或两个以上颗粒的光散射性质可与单个颗粒的区别开，这一分析方式被使用；将相互很接近的两个或两个以上颗粒分开以使任何一个颗粒的光散射性质发生改变，此分析方法被使用；两个或两个以上颗粒由一种或两种以上分子相互作用连结起来，当将颗粒连结在一起的分子相互作用受到破坏时，一个或多个颗粒被释放，这分析方式被使用；通过使用化学或生物交联剂将两个或两个以上颗粒交联起来以使分析物探测得到放大，此分析方式被使用；颗粒由附加材料组成以使颗粒在电场、磁场或相关的电磁场(EMF)中定向排列起来；颗粒与具有磁或铁电性质的其它颗粒结合在一起；选择某一波长的照明光束，与其它波长光束相比选择该波长的光束可降低背景。
在其它实施方案中，照明光为稳态或脉冲的；照明光是相干的或非相干的，照明光是偏振的或非偏振的；从同一光源或从两个或两个以上不同光源产生的两个或多个不同波长被用来照明样品，而散射光信号则被探测。
在其它实施方案中，所用方法使用许多不同颗粒，每一颗粒具有一种或多种散射光性质，利用眼睛或光探测器可以探测到这些物质；和/或在照明或探测步骤中使用多种不同波长的光；为了降低非特异性光背景，采用了折射率增强方法；探测器置于一定角度位置，这些位置位于样品和光束散射光前进方向包络之外。使用空间滤波方法，在探测步骤中为了降低非特异性背景光，使用了光学滤波片，如截止和/或窄带通滤片。
在又一个实施方案中，在探测前利用自动金相显微术方法增加颗粒的尺寸；照明光束不含红外辐射；分析物存在于血清中；在探测前颗粒被释放至溶液中；在探测前颗粒被浓缩成一小体积或固相区；通过时间依赖结合至一表面或使颗粒流动通过一探测器或一套探测器对颗粒进行探测；多分析物以固相微阵列形式被探测；微阵列浸没在液体中或是干燥的；在细胞表面、细胞溶解物、或染色体制备上的单个或多个分析物被探测；照明光束为复色白光或单色光；分析物存在于溶液或固相中，或在显微镜载玻片上，或微滴定板或另一种塑料容器；颗粒为金颗粒或银颗粒，尺寸为1至500nm，优选为10～200nm；探测步骤不包括使用电子学方法对散射光进行放大；照明光束由棱镜或其它光导系统导向颗粒。
此外，探测可包含至少一10倍物镜以观察颗粒；使用DLASLPD视频相差增强方法，光纤光学照明和探测被使用；使用明场，激光共焦扫描，反射相差或差分干涉相差显微术探测方法；对组合合成分子进行探测和纯化；使用颗粒和/或特殊包被作为组合或其它合成分子的固相合成支持物；使用特殊设计的样品室；对光学元件和样品室镀制减反膜；仪器装置可供野外、医生诊所、门诊和医疗机构使用；适当的试剂盒中提供特殊颗粒类型。
本发明信号产生和探测系统的灵敏度高，且使用方便，这意味着本领域的技术人员可以使用费用不高的方式探测和测量一样品中极低浓度的一种或多种分析物，而不需使用信号(标记)或靶分析物分子放大方法。
本发明中来自不同颗粒类型的特异光散射信号范围很宽，这意味着本领域中的技术人员可以对一样品中的一种或多种分析物进行高度特异性的探测和测量。
本发明对两种或两种以上不同颗粒类型的高光学分辨能力意味着实现对一样品中多分析物十分简易的探测(如两个或两个以上不同分析物)是可能的，且无需复杂装置。
本领域的技术人员将认识到申请人发明了应用性十分广泛的新方法和装置。本发明可以各种方式适用于大多数情形，在这些情形中需要使用一信号产生和探测系统作为检测系统的一部分以数量表示和/或探测一分析物的存在与否。除了所有种类的生物细胞和组织，如此分析物还包括所有类型的工业和药物化合物、蛋白质、肽、激素、核酸、脂、和碳水化合物。本发明的各种应用模式可以适合于大多数检验方式，这些检验方式在所有种类的诊断检验中是通用的。例如，它们包括复杂和简单的检验方式，具有三明治类型、聚集类型、间接或直接类型等。样品类型可以是液相、固相、或混合相。
从下面对优选实施方案的描述及权利要求中，可以明显看到本发明的其它特点和优点。优选实施方案描述首先简要叙述附图。附1表示从样品下方对样品照明。L为一透镜；D为透镜的直径；O表示表面S上被探测的区域；C为透镜L收集光的孔径角；LB表示照明光束。
图2表示一透镜的收集孔径角。D为透镜的直径；f为焦长；O为探测区；θH为收集孔径角的平面半角。
图3定义在一表面上描述反射和折射所用的角度。S为表面，ni和nt分别为入射介质和表面介质的折射率；RFRB和RFLB分别为折射和反射光束；IB为入射光束；θi、θr、和θt分别为光束的入射角，反射角和折射角。
图4A、4B、和4C为ni＜nt时用不同方式表示的光反射图。
图5A、和5B为ni＞nt时用不同方式表示的光反射图。
图6表示对空气中干燥表面上的颗粒照明时所产生的折射和反射。
图7为n2=1.5,n3=1时，将θi2对θi1作图所得到的曲线(见图6)。
图8表示由表面人造物和颗粒所引起的散射光角度分度；虚线表示颗粒引起的散射光；带有箭头的实线为入射白光束，和一束由表面人造物所引起的散射光。圆圈为散射光在前进方向上的强度包络。
图9表示显微镜载玻片上一样品薄膜水层，该样品层由盖玻片包被。照明光束与4个介质界面相遇；S1(空气到玻璃)；S2(玻璃到水)；S3(水到玻璃)；S4(玻璃到空气)。颗粒位于表面S2上的0片或在表面S2上方游离运动。入射光从表面S1入射。


图10表示从上方照明样品。L为透镜；C为收集光锥。
图11表示使用棱镜配置进行照明(从下方照明)。S1为棱镜表面，入射光从该表面入射；S2和S3分别为一塑料片衬底的下表面和上表面。
图12A、12B、12C、12D和12E分别表示一pore棱镜(12A)、一等边棱镜(12B)、一自制棱镜(12C)、以及一平凸透镜(12D)。
图13表示用诺丹明塑料块观察照明光束。
图14表示一表面和有关平面，该表面及平面用于描述图15；S1为光学透明或不透明的固体衬底；SP1为表面S1平面上方的3维空间；SP2为表面S1平面下方的3维空间。光散射颗粒或材料位于表面S1上或接近该表面的SP1平面内。
图15对DLASLPD照明和探测的不同方法作了总结。
图16表示对于包被和非包被100nm直径金颗粒而言，实验测量的散射光强度与入射光波长之间关系的曲线。
图17、18和19表示不同样品室的设计，其目的在于减少非特异光背景水平。这些样品室可用来测试液体样品和固定样品。在图17中，光束从S1表面入射样品室；S2表面包含光散射材料(对于固定样品)。S3为另一倾斜的表面；取决于照明角，S1和S3表面的倾角从约20度至70度调整，S1表面倾角应使入射光在S1表面入射时与法线的夹角为零；S4为光学透明表面，该表面具有或不具有一开口；S5是与S2表面相对的面。如果样品室是封闭的(即S4表面不带开口)，为了样品的放入和清洗的需要，在某一表面上将有一小开口。
图18表示的样品室与图17的设计相似，所不同的是倾斜平面被曲面代替。而其它部分则与图17的设计完全一样。
在图19中，S1为光学透明的倾斜平面，入射从该面入射样品室。S1表面的倾角应使入射光在S1表面入射时入射角为零；S2表面包含固定的光散射材料；S3为另一曲面或倾斜平面。对于一封闭样品室来说，S4为光学透明表面；S4亦可带有一不同大小和形状的开口，用于样品清洗和探测；S5为与S2面相对的面。如果样品室是封闭的，为了样品的引入和/或清洗，在某一面上需有一小开口。
图20表示用来描述颗粒与偏振光相互作用的坐标系，光沿y方向传播且在z方向上偏振。D为散射光强度探测器。γ为观察方向。θ和φ分别为锥角和极角。
图21为用于分析液体样品的仪器简图。通过一透镜系统会聚来自灯丝或放电光源的光。使之照明单色仪的入射狭缝，该透镜系统用透镜L1表示；从单色仪出射的单色光由透镜L2收集并透镜L3会聚至透明的样品室(ST)中心；样品室含有荧光分子溶液或光散射颗粒悬浮液；样品室可调至某一角度或倾斜以使从其表面反射的光向下偏转且避开光探测器；由样品散射或发射的光由透镜L4收集，在M平面上形成样品室和液体内容物的放大像。在M平面上放置一小光栏，该光栏有选择性地使样品室中心处液体所发射或散射的光进入光探测器，并且挡住从样品室池壁反射或散射的光进入光探测器；由于样品室倾斜后池壁折射率效应的影响，位于M平面上样品室液体内容物中心处的放大像偏离了透镜L4的光轴；光探测器和光栏位于透镜L4光轴的一侧以使液体中心偏离后的像落入光栏和光探测器；为了在照明及散射光路中放入滤光片和/或偏振片，提供了光具座(H1和H2)；在光探测器前面，放置了光快门。由于光探测器的光敏区域较小，则用透镜L5将通过M平面上光栏的光会聚至光敏区域。如果不需要单色光，则单色仪可以方便地移开；从灯丝或放电光源产生的光可直接经透镜L1、L2和L3进入样品室的中心。
图22、23和24概述了使用光散射颗粒和特异DLASLPD的方法，该方法导致了特异性试剂盒和装置的应用。
图25概述了一装置和检测方法的建立过程。
图26A、B、C、D、E和F表示散射光强度计算值与入射波长的关系。散射颗粒分别为10nm直径球形金、银、铝、铜、硒和聚苯乙烯颗粒。LK为波长；Csca为光散射截面。
图27A、B、C、D、E和F表示对应于不同尺寸金颗粒散射光强度计算值与入射光波长的关系。A、B、C、D、E和F分别对应于直径为10、20、40、60、80和100nm的球形金颗粒。REL CSCA为相对光散射截面；WAVE NM为波长。
图28为一球形包被颗粒的简图。(1)为聚合物、结合剂、或其它物质在颗粒表面的包被；(2)为核心颗粒。
图29A、B和C表示MLSP(可处理光散射颗粒)混合组分颗粒。A(1)为由(2)理想光散射材料包被的核心磁或铁电材料；B表示由(3)磁或铁电材料包被的光散射材料；C表示(5)光散射材料和(6)磁或铁电材料形成的混合物。
图30A、B和C分别表示对于可定向MLSP颗粒的二聚体、四聚体和高级颗粒结构。(1)为光散射可探测颗粒，(2)为磁或铁电颗粒。线(3)为化学、离子、或其它连接，在多颗粒结构中，通过这些直接使颗粒结合起来。
下列缩写在此使用E-EMR-发射电磁辐射I-EMR-入射电磁辐射EMF-电磁场SC-半导体Sec-秒Qf-荧光量子产额Iabs-入射光吸收(每秒吸收的光子数)。
Io-入射光强度(光子/秒)M-摩尔浓度(摩尔数/升)ml-毫升mM-毫摩尔浓度g-克mg-毫克mm-毫米μl-微升pI-等电点E或e-十进制(decadic)摩尔消光系数C-摩尔浓度(M)X-光程长度(cm)
If-荧光强度(光子/秒)Seff-颗粒的散射效率Cabs-吸收截面(cm2)ACSR-颗粒吸收截面与颗粒物理截面比Csca-散射截面(cm2)SCSR-颗粒散射截面与颗粒物理截面比Cext-颗粒散射消光截面(cm2)I-穿透厚度为X的溶液后出射的每秒光子数N-颗粒浓度(颗粒/立方厘米)t-悬浮液的混浊度IS-散射强度(光子/秒)n2-材料的折射率n2Rel-n2的实数部分n2Im-n2的虚数部分n1-介质的折射率m-颗粒材料折射率与介质折射率比lo-入射光波长(nm)RI-折射率因子Refmed-介质的折射率(n1)em-介质的介电常数nm-介质的折射率a-测量包被颗粒的极化强度nm-纳米cm-厘米μ-微米发明叙述本发明的特点在于提供了探测和测量样品中一种或多种分析物的方法。该方法基于具有确定组分、尺寸和形状的特定类型颗粒的应用以及一种或多种颗粒光散射性质的探测和/或测量。
与以前可行的方法比较，本发明容易使用，灵敏度和特异性更高，并且能在更宽的分析物浓度范围进行探测和测量。与信号和靶分析物放大方法(如化学发光和PCR)，荧光标记和荧光方法以及以前的基于颗粒检测和光散射方法相比，本发明具有许多优点。本方法是通用的并且在诊断学领域以及其它领域具有广泛的应用性。对于以液相、混合相、固相以及固相微阵列检测方式存在的样品，本方法可以应用于大多数(如果不是全部)标准结合对类型的检测中，如免疫检测和核酸检测等。
申请人将叙述主要因素和考虑以使在本领域中具有中等水平的技术人员可以应用本发明来满足大多数(如果不是全部)分析物探测需要，而不是通过详细说明本发明的某一特殊形式的每一种具体应用来阐明其广泛应用性。本发明的应用将导致产生特定的仪器装置和试剂盒。
此处的叙述可使本领域中具有中等水平的技术人员以许多不同方式应用本发明来取得适合于大多数(如果不是全部)样品类型、分析物类型、诊断检测方式类型及仪器装置类型的理想的分析物或颗粒探测可能性。本发明的通用性极强，可应用于以下场所探测一种或多种分析物野外(远离实验室)、或一个较小的医学或分析实验室，床边、急救室、特殊的医院治疗室(如心脏治疗室、重症治疗室、创伤治疗室等)，研究实验室、且具有每日处理许多样品的能力。以各种方式应用本发明可以制作出不同类型的价格较便宜的仪器装置和试剂盒。
本发明的一些方面可以不同方式彼此结合起来而应用，这确定了本发明在特定应用中检测分析物的能力。这些方面中的两个为(1)在一确定分析方式和样品类型中，具有高度可测量和可探测性光散射性质的各种特定颗粒类型的应用，(2)在DLASLPD照明和探测优选方法中，各种特定颗粒类型的应用。在特定的应用中，折射率增强方法和DLASLPD视频相差增强方法亦得到使用。有效的金属样颗粒光散射特性的确定下面提供的信息有助于完全理解权利要求所要求保护的发明。这些公式在实际中和发明的最优化中都是有用的，但是不承认其权利要求的现有技术。
在开发用来探测当前发明的分析物的新型激发产生和探测系统的过程中，我们发现开发新公式很有用，这些公式允许我们按照光荧光参数来估计不同类型颗粒的光散射特性。这允许我们研究ε、Qf、荧光和激发光谱，发光强度与观察角度的依赖关系，还有发光的偏振态(这些在以后定义)。这些新公式允许此领域中的技术人员来选择特别的颗粒参数，如组分、大小和形状以体现能被探测和测量的预期的光散射特性。这些公式用于诊断性的分析和其他方面的应用。方程1到7表达背景信息，使得读者能理解新公式，方程8到15，这并不会承认已叙述的任何公式和光散射参数是优先于所述的权利要求的。
申请人提出一种分析方法，它基于对已知Rayleigh和Mie光散射理论的某些改进，估计不同类型颗粒的不同参数、大小、形状、组分和均匀性，以判定颗粒参数的什么特征构形导致在分析性和诊断性的检验中易于检测和测量的光散射信号。荧光参数的定义对于荧光材料，荧光强度决定于每秒吸收的光子数和吸收光子重新发光的比例，如方程1所示。
Iabs(λ)=2.303Io(λ)e(λ)Cx(1)式中Io(λ)是入射光强度(光子数/秒)，波长λ，I(λ)是波长入时单位摩尔单位长度的摩尔消光系数，C是荧光团的摩尔浓度(单位M)，x是光路长度，单位cm。
总荧光强度I(λf)(辐射光子每秒在各个方向的总和)在发光波长λf和激发光波长λe时给出下式(针对低荧光团浓度)I(λf)=2.303Io(λe)Qf(λf)e(λf)Cx(2)按照上述参数，在检验应用中荧光化合物的有用性的估计是众所周知的方法。荧光分子和荧光技术的使用受限于荧光分子发光可靠性，以及在具有强的非特定荧光，磷光和散射光的样品中检测特定荧光信号的能力。为了灵敏的探测荧光分子和其他荧光物质，诸如由荧光染料分子组成的颗粒，更高级的仪器是需要的。光散射参数的定义颗粒的吸收截面(Cabs)考虑颗粒被一束波长为λ的单色光照射。颗粒的吸收截面定义为包围颗粒的面积(单位通常表示为cm2或μ2)，这样，落在这个面积上的任何光子都被颗粒无反射地吸收。吸收截面因子Cabs的数值依赖于颗粒的大小、组分、形状和均匀性，它还依赖于光波波长和描述颗粒纯吸收分布曲线的Cabs-λ图。具有均匀组分的任何球形颗粒的Cabs对波长的分布曲线都能由Rayleigh和Mie理论计算出。在我们专门术语中，Cabs与无反射吸收有关。Cabs的本质能通过下面我们定义的消光截面Cext更好地理解。相对吸收截面Acsr相对吸收截面Acsr定义为颗粒的吸收截面因子CAbs与颗粒的实际截面积πa2的比值，其中a为颗粒的半径，也就是说，Acsr=CAbs/πa2。Acsr提供了一种方法测量颗粒无反射吸收落在包围颗粒面积的光子的能力。Acsr依靠颗粒的组分、大小和形状以及光波波长，在0到6之间取值。比1大的数值意味颗粒能达到颗粒的实际尺寸以外吸收光子并吸收它们。在实际文献中，Acsr被称为吸收效率因子。这个术语产生了误解，是因为Acsr存在比1大的值，而失去了效率的特点。颗粒的光散射截面(Csca)由散射的颗粒吸收(这里包括可逆的和不可逆的吸收)重又以吸收光子相同的波长发射存在一定的几率(量子力学观点)。再发射的光子能以不同于入射光方向发射。这就是说，入射光子被吸收和再发射所散射。颗粒的散射截面(Csca)在入射光的波长上被定义为包围颗粒的面积，每个落在此面积上的光子将被散射掉(这就是量子力学观点的吸收和再发射)Csca通常以单位cm2和μ2来表示，并且依赖颗粒的组分、形状、大小和均匀性，还有光波波长。Csca对波长的光散射分布曲线能通过Rayleigh或Mie理论计算任何均匀组分的球形颗粒。Csca与颗粒的实际或几何截面的比值颗粒的Csca与实际或几何截面积πa2的比值(其中a是颗粒球的半径)提供一种方法测量颗粒从其包围面积吸收，吸收和再发射光子的能力。这就是Scsr=Csea/πa2。在实际的文献中，Scsr称为散射效率因子。
实验和理论的结果表明Scsr的取值范围在1到5或者更大，这依赖于颗粒的组分、形状、均匀性和大小，还有光波波长。一个比1大的Scsr值意味着，颗粒能超过实际尺寸吸引光子，并吸收再发射它们。这是可能的，因为颗粒与电磁波的电场相互作用能够超出颗粒半径的范围内发生。一般说来，Scsr随着颗粒大小增加。对于较小颗粒(小于40纳米)，Scsr小于1，而对于较大颗粒Scsr比1大，并可能达到5。颗粒的消光截面颗粒的光散射消光截面Cext定义为散射截面Csca和吸收截面Cabs之和Cext=Csca+Cabs(3)Cext的单位通常表示为cm2或μ2。
任何颗粒在给出波长时的消光截面用常规吸收光谱仪可以容易测得。设Io(光子数/秒)为落在悬浮颗粒上的光束强度，颗粒浓度为N颗粒数每立方厘米。X(cm)为溶液的深度，I(光子数每秒)是通过距离x后从溶液出射的光强。此强度通过下面表达式与Cext有联系I(λ)=Io(λ)e-NCext(λ)x(4)这个表达式清楚地表明诸参数依赖于λ。这假定此光探测器被确定不探测散射光。
当颗粒为纯散射体时，这就是说，单向不吸收光，那么Cext=Csca，并且上述方程可写为I=Ioe-NCscaX=Ioe-tx(5)(6)其中t=NCsca为悬浮物的混浊度。十进制(decadic)摩尔消光系数在化学领域中，溶液中物质吸收给定波长光的能力表示为十进制摩尔消光系数e，单位是M-1cm-1(M代表摩尔每升)。这个系数与实验确定的吸收相联系，表示为A(λ)=e(λ)Cx(7)申请人发展了研究光散射参数的公式申请人现在简单地表述他自己使用的理论方法。此领域的技术人员能够应用下面的方法，对特定颗粒的参数、组成、大小、形状和均匀性进行估计，修正和调整，以得到一个或更多需要的光散射特性，它们很容易检测和测量。根据样品类型、诊断格式和仪器方法的限制还要作些考虑。例如，在一项申请中，多分析物探测可能在大批量测试装置中处理固相样品，样品包含强非特定背景光，而在另一项申请中，简单的溶液中分析物探测可在医生工作室里进行。
申请人的主要兴趣在于分析性和诊断性检验中的颗粒类型优化。在大多数申请中，颗粒必须用大分子物质如聚合物、蛋白质或者类似物质包起来，以得到在不同介质中合适的化学稳定性。这在能力域中是众所周知。申请人也把结合剂如抗体、受体、肽和类似物包被在颗粒表面以使已包被的颗粒能用于分析或诊断的形式要求。在某些申请中，结合剂具有两重功能，稳定溶液中颗粒和提供粘结分析物的组分的专门识别能力。对颗粒进行蛋白质如抗体的包被在此领域众所周知。但是，申请人的兴趣在于测量各种颗粒的光散射信号中的一个或更多特定参数，这些颗粒在某些情况下具有相同的大小和/或形状和/或组成，并且还不清楚能否光学分辨它们包被后一个或更多的特定光散射性质。
申请人通过实际实验和理论模型认定，对颗粒表面包被薄层结合剂，无光吸收聚合物(在可见光区)或其他材料，不会明显地改变那种颗粒的光散射特性。这是与颗粒不包被时相比较而言。包被薄层意指上述材料不同数量和成分的单层膜。
申请人认定，对包被或没包被的颗粒悬浮体，其十进制摩尔消光系数可通过测量某一波长时的吸收来确定。十进制摩尔消光系数可用公式(7)计算，下面的表达式把颗粒浓度从N(颗粒数每立方厘米)改为C(M)。M是摩尔每升。
C(M)=1000N(颗粒/cm3)/6.03×1023(8)十进制摩尔消光系数与消过光截面Cext(或附注)联系，此联系通过下式e(M-1cm-1)=[Cext(cm2/颗粒)(6.03×1023)]/2.303×1000(9)=2.63×1020Cext(cm2/颗粒)(10)或者Cext(cm2/颗粒)=2.303(M-1cm-1)×1000×6.03×1023(11)=3.82×10-21e(M-1cm-1) (12)利用方程(9)和(10)我们能从Cext中计算出ε。
如前所述，此领域中众所周知，对于颗粒，消光截面(Cext)等于截面(Csca)与吸收截面(Cabs)之和。消光系数e反映了入射光的损耗，这是因为单向光吸收和光散射(吸收和再发射)。申请人认为颗粒的十进制摩尔消光系数可以通过实验和计算消光截面估算出来，能够比较颗粒和后面要出现的荧光团的吸收能力。光散射效率(Seff)申请人认为光散射效率Seff可以定义为类似于荧光效率，有包被层或无包被层的颗粒在以散射光形式的再发射光与吸收光的比值(单向和双向吸收)。数学上，申请人定义散射效率为式子Seff=Csca/Cext-Csca/(Csca+Cabs)(13)对于纯散射体的颗粒，也就是说，颗粒由单向不吸收光而是吸收光又发射出去的材料组成，Cabs等于零，Seff等于1。微小聚苯乙烯颗粒在可见光区表现为纯散射体，因此Seff等于1。对于由单向和双向吸收光的材料组成的颗粒，Seff小于1。金颗粒在可见光区就表现出后一种行为。颗粒散射光强度申请人认为有包被层和无包被层颗粒散射光强度能决定于每秒钟吸收光子数(单向和双向)和吸收光子与重新发射光子的比值(量子力学观点)。散射光强度的测量通常在稀溶液中进行，光吸收数量Iabs(每秒吸收的光子)表示为Iabs=Io2.303eCx(14)Io是入射光强度(光子数/秒)，e是十进制摩尔消光系数其单位M-1cm-1，C是摩尔溶度，x是光程长度，单位cm。
申请人又认识到，总的散射光强度Is，为各个散射角光强总和，给出下面关系式Is(λ)=2.303Io(λ)Seff(λ)e(λ)(C)(x)(15)其中Io(λ)为入射光强度，这个方程与描述荧光团的方程(2)相仿。
注意到，从Csca和Cext中得到的ε和Seff的表达式代入上面的方程中，结果表明散射光强度直接与并完全决定于散射截面Csca的大小。这意味着不同颗粒的相对散射强度可从它们的散射截面推测出。颗粒的特定光散射性质申请人现在简要地总结一些非常重要光散射性质，它们能用于以不同的检验方式检测不同样品中的分析物。被测量的光散射性质为如下性质的一种或多种强度、波长、颜色、偏振度、角度依赖性和RIFSLIW(散射光强度和/或者波长的周期性单独波动)。
有包被层和无包被层金属样颗粒有相似的光散射性质，并且与非金属样颗粒相比二者都有较多的光散射性质。另外，申请人还认为，通过改变形式如大小、形状、组成和均匀性来调整金属样颗粒的光散射性质是相当容易的，特定的光散射属性能够通过各种样品的金属样颗粒测量。
金属样颗粒的检测有极高灵敏度，使用DLASLPD照明和检测方法，利用便宜的又易于操作的仪器便可容易地检测各种颗粒达到单种颗粒的极限。
样品中的一种或多种金属样颗粒，使用DLASLPD照明和检测方法，在白光照明或类似宽带光照明下，测量颗粒颜色而得以检测。例如，样品中近似球形，直径为40、60、80nm的金颗粒(如包被结合剂，粘附在分析物上，稀释于溶液中或者依附于固体中)与大约30nm直径的银颗粒能够很容易检测和定量，这是通过鉴定每秒颗粒独特的散射光颜色和/或者测量其强度得到的。这种方法适用于固相如微滴定池或者微量分析切片或者溶液中。溶液的测量方法更多，因为颗粒在固相方式不是空间散布的。例如，让溶液流过一系列探测器，每个用来测量不同的波长或者光谱区以及不同波长时的强度，这样可以探测液体中不同种类的颗粒。另一方面，有没有流动系统，一系列不同波长的光照明和/或检测可用于测量不同颗粒类型。
对于固相分析的应用，金属样颗粒的广泛的浓度范围，通过从颗粒记数改变为依赖于颗粒浓度的累计光强的测量方法可以探测到，颗粒单位面积的密度无论高低都能检测。
在其他的检验应用中，颗粒结合在固体基片上，如玻璃球，凹坑的底面等，那么可以调整pH值，电离力或其他液体性质使颗粒释放入液体中。更高的折射率液体能够增加，溶液中颗粒的光散射性质可以测量。同样，溶液中的颗粒在测量光散射性质之前可以通过不同的方法集中在更小的体积或面积。再者，更高折射率的液体可先于测量而得于增加。
理论估计和实际的实验都表明，对于任何组分直径达到约120nm或更大的球形颗粒，颗粒散射的大部分光辐射出向前的包络线(看图8)。申请人认为检测和测量偏出前向散射光包络线任何角度的散射光，确定了从光束和其他光散射成分和物质散射的非特定光有明显的减少。这对许多样品来说，明显增加特定散射光信号与非特定散射光信号的比值。
颗粒的散射光强度在不同的方向和偏振态依赖于入射光的波长和偏振态以及颗粒的大小，形状和均匀性。下面我们总结了与某种颗粒在不同方向发射光的强度和偏振态有关的一些非常重要的事实。
较小的球形颗粒(与光波长相比是波长的1/20或更小)的形为如各向同性偶极子散射体或发射体，这就是说，光是高度偏振的。这极其不同于荧光分子，它们通常具有线性偶极子发射体的形为。例如，受非偏振光照明的颗粒，散射光在φ=0,θ=90°(看图20)是完全线偏振光(P=1)。这个性质允许通过测量与很多不同样品中的荧光分子相比拟的光散射性质来对分析物进行特定的或更灵敏的探测。
对于更大的颗粒(＞1/20光波长)，在某一大小范围内，光偏振度P减小，并且随着颗粒大小增加而依赖于波长。当颗粒足够大时，在方向θ=0,φ=90°，其偏振度变为0。明显存在某一范围，偏振度变化最剧烈，也就是说，偏振度对颗粒大小的斜率达到最大值。在斜率变化的这些区域就被使用于分析成分的应用中，例如，凝聚或集聚类型的分析以探测和测量一种样品中一种或多种分析物。
对于在某一大小范围内，如从约200nm到1.2微米直径的更大颗粒，在θ=0,φ在90°到-90°之间变化时，光强(单色入射光)在相对值1到0之间波动。角度如图20。这就是说，如果在水平面上(θ=0)观察散射光，那么人眼从φ=90°移动φ=-90°，光强从亮到暗波动。用白光照明，随着人眼从φ=90°移动到φ=-90°，光改变颜色。这就是说，颗粒具有衍射光栅的行为。这样光散射特性对于极特定地和极高灵敏地检测很多不同样品中一种或多种分析物是极其有用的。
微小的非球形颗粒沿着颗粒长轴吸收和发射时，其形为有点象线性偶极子散射体。申请人在DLASLPD照明和探测条件下，通过普通的光学显微镜已经观察下面的情况。当照明光是线偏振的，非球形颗粒随其转动发出闪光。颗粒在它们的取向为其长轴与偏振方向一致时具有最大密度，长轴与偏振方向垂直时具有最小密度。相反，微小球形颗粒在偏振光照明下并不发生闪光。对于某组成物的非球形颗粒，散射光的颜色(在白光照明下)随着对称度变化而变化。当对称度增加时，颜色向长波偏移。例如，使用普通光学显微镜在DLASLPD光条件下，申请人观察到，对称性的银颗粒当其在溶液中转动时颜色发生变化。这个特性被申请人定义为“RIFSLIW”(旋转性散射光强度和或者波长的各自波动)，它使用于这个发明的很多不同方面，以更专门地和灵敏地探测和测量样品中的一种或多种分析物或颗粒。
首先按照均匀的球形颗粒具有不同大小和组合物时的光散射特性来描述这个发明是有用的。然而，该发明的基本方面很多应用于非球形颗粒，这与此领域中一个发明一样。另外，按照入射光波长300nm～700nm描述此发明也是有用的。然而，该发明基本方面同样应用于基本上各种波长的电磁辐射。光是指紫外的，可见区的，近红外的，红外的和微波频段的电磁辐射。使用聚苯乙烯颗粒代表各种非金属颗粒来描述此发明将是非常有用的。其他的非金属颗粒类型包括玻璃组合物和很多其他聚合化合物。这些颗粒与聚苯乙烯颗粒相比有极相似的光散射特性。
在相同强度和波长的入射光照射下，不同颗粒的散射光的相对强度可以比较它们的Csca直接得到。Csca越高，颗粒的散射能力越强(光散射强度)。在下面的部分我们使用“散射能力”表示Csca或散射光强度。
在入射光波长在范围300-700nm之间时，我们计算过水中大小相同，组成不同微小球形颗粒的光散射能力。在这些计算中，我们使用真空中不同体材料的波长对应的折射率，这在标准手册已制列表。
对于一些颗粒组合物，从300nm到700nm光散射能力连续下降，而其他组合物的散射能力对波长的关系曲线却出现峰值和谱带。入射光为白光时，这些峰和带在可见光区，颗粒的散射光是有颜色的。
为了更加明晰，我们在下面的某些图表中对直径10nm各种颗粒的光散射性进行不同的比较。考虑到散射光的相对大小和波长，总的趋势是直径10nm颗粒与更大的直径达100nm的颗粒的情况基本相同。例如，表1计算的是直径10nm的颗粒。然而，对于更小的颗粒(小于光波长的1/20)，当颗粒大小逐渐增加，只要限制于小颗粒的条件内，那么光散射强度对波长的关系曲线形状不发生改变。颗粒大小增加的明显结果是增加曲线图的幅度。这在理论物理领域众所周知，并且微小颗粒的散射能力随着半径的6次方增加。本领域的技术人员能从10nm颗粒的光散射能力乘以(d/10)6得到任何直径为d的微小颗粒的光散射能力，这里d的单位为nm，这种方法也被能力域的技术人员用于决定在各种诊断性检验申请中某一颗粒大小的用途，申请中颗粒的散射光强度用于探测分析物的出现。
从我们理论和实验中，我们惊奇地发现这个普遍关系也适用于超出Rayleigh限制条件的大颗粒，这就是说，颗粒直径大于30nm。
表1表明了计算出的Csca值(光散射能力)和它们相对应可见光区的近似波长。这区域颗粒散射光最强烈。表1的数据表明金属样颗粒比如聚苯乙烯颗粒是更强的光散射体。
图26表示选择算出光散射强度与波长对某种10nm的球形颗粒的关系曲线。由金或银组成的微小颗粒在可见光区表现出明显的散射和吸收峰，而铜颗粒在此光区表现出一微小的散射和吸收峰。金和银散射最大值分别在530nm和380nm。甚至当入射光波长远离散射光最大值的波长时，金、银和其他金属样颗粒的光散射能力比其他非金属样的微小聚苯乙烯颗粒大很多。
表2给出了10nm的金属样颗粒和聚苯乙烯颗粒(非金属样)的光散射能力的计算值，此时入射光(照明)波长向长波偏移。在很多分析性和诊断性检验中，是需要工作在长波区。表2表明本领域的技术人员可以使用较长波长的照明，并且金属样颗粒远优于非金属样颗粒，如聚苯乙烯，这用在分析性和诊断性方法的申请中。例如，波长为700nm的入射波，此波长远离光散射最大值波长530nm，对于金属粒，数据表明其散射光强度比同样大小和形状的聚苯乙烯颗粒大约220倍。我们已经在实验中观察到，在全部可见光区，金属样颗粒的光散射能力(强度)远大于非金属样颗粒。
这些结果表明，金属样颗粒比非金属样颗粒在相比大小和形状差不多的情况下具有更大的光散射能力，并且更广泛应用于分析性和诊断性示踪装置，此装置用于很多需要使用信号产生和探测系统的领域内非常理想。例如，在许多设计用于检测分析物物质存在与否的检验中，便是通过探测颗粒的散射光。
表1水中不同组成10nm球形颗粒Csca的计算值
a)使用入射光，最大值出现在可见光区(300～700nm)(b)有些颗粒在某一区域出现峰值，看图27。
表2水中不同组成的10nm球形颗粒在700nm光照明下的Csca计算值
表3比较了不同直径球形颗粒的十进制摩尔消光系数ε的计算值和实验测量值。
我们利用前面描述的表达式计算了在最大值波长时的ε值，ε的测量值是通过测量在计算的最大值吸收波长时，在标准光谱仪中的光吸收而得到的。计算和实验中测量的ε值虽不完全符合，但是相当的。从观测和计算的结果看出约两倍的差别可能反映出金颗粒标定的半径的不准确。实验方法的细节将在实施例部分给出。
表3水中不同大小的金颗粒的十进制摩尔消光系数白炽光源，以及最大吸收波长的计算值和测量值
(a)指示计算值的精确颗粒直径(b)指示用于测量时金颗粒的大约直径。实际的直径比指示的直径稍微偏高或偏低。
对于可见光区的入射光，金属样的光散射能力(例如Csca)远大于相比的非金属样颗粒，如聚苯乙烯。金属样和非金属样颗粒的光散射特性的另一重要区别为，相同组成大小改变的金属样颗粒，其散射光强度对入射光波长的关系曲线是很不相同的。这与非金属样颗粒相反，大小在10nm到几百nm的范围内颗粒的关系曲线基本上是相同的。这些差异对于更专门地和更灵敏地探测不同样品中金属颗粒是极其有用的。发生最大光散射(Csca)时的入射光波长，对于不同直径的银、金、铜和铝颗粒，给出在表4中。
图16表示了，近似球形直径100nm金颗粒在包被和未包被聚乙烯化合物(MW=20,000)时实验测量的散射光强度与入射光波长的关系曲线。数据表明，100nm直径的金颗粒在包被和未包被时其依赖于光散射强度特性的波长值是非常相同的。
图27表示了改变直径的球形颗粒计算的散射光强度对入射光波长的变化曲线。当金颗粒大小变大时，散射光的峰值波长向长波偏移。在液体中用白光照明或在光学显微镜用DLASLPD照明，我们已经直接观察到包被或未包被的金颗粒在直径为40、60、80、100nm时光散射特性，它们显现出绿色、黄绿色、橙色和橙红色。微小球形银颗粒显现蓝色。这样，包被各种结合剂的金属样颗粒以多种方式用于分析性检验中。不同种类的金属样颗粒的散射光的颜色性质允许对多种分析物进行可见光探测。例如，球形的半径为40、60、80、100nm的金颗粒和半径为20nm的银颗粒，它们分别包被不同种类的结合剂，可用于在同种样品探测五种不同的分析物。在一种格式中，五种不同的细胞表面接收器或者其他出现在细胞表面的表面组合物能够被探测和观察到。在光学显微镜中用白光照明，在DLASLPD条件下，对依附在细胞表面不同包被的颗粒，其散射光颜色的探测使这成为可能。分析物的数目和类型可通过探测到绿色、黄色、橙色和红色颗粒的数目来区别。同样，染色体和基因分析如原位杂交等就可利用上面描述的方法。这时利用不同类型的金属样颗粒的散射光颜色，各种金属样颗粒用作“染色体画”以鉴定样品中的各种核酸序列，核酸结合蛋白质和其他类似分析物。这些实施例作为说明性实施例提供，在此领域的技术人员将认识到不同种类金属样颗粒的散射光颜色能用于很多不同检验格式中以探测单一或多种分析物。
这样，调整某种球形金属样颗粒的大小是一种有用的方法，通过使用其散射光的颜色和/或者其他持性增加不同样品中的可探测性。使用白色光源，两种或更多种不同种类的颗粒可以轻易探测到非常低的浓度。
表5表明，金颗粒大小适当的增加能引起颗粒的光散射能力(Csca)的大幅度增加。最大Csca值对应的入射光波长随着颗粒大小明显增加，并且散射光强度的大小也显著增加。例如，最大Csca值的入射光波长大约为535nm,575nm和635nm，这分别对应金颗粒直径为40nm、100nm和140nm。在白光照明下，40nm的金颗粒强烈地和有选择的散射波长约为535nm的光颗粒呈现绿色，而100nm颗粒呈现橙红色，140nm颗粒呈现红色。这更加表明，在白光照明下，同一样品中相同组成大小不同的金属样颗粒可以通过散射光颜色相互区别。散射光强度的相对大小可以测量，并且与散射光的颜色和波长一起用于更专门地和灵敏地探测相同样品中，甚至具有高度的普遍的光背景的样品中的不同颗粒。
相反地，非金属性颗粒不具有这些独特的光散射特性，因此，与金属样颗粒相比，在大多数样品介质中探测非金属样颗粒要更加困难。
表4水中观察的最大Csca值时入射光波长的计算值<
p><p>表5不同大小的球形颗粒光散射特性的计算值
相同形状和大小，组成不同的颗粒的相对光散射能力能够通过比较垂直入射光各个角度的光散射强度而直接在实验中得到。我们在实验中比较了相同大小和形状的金颗粒和聚苯乙烯颗粒的相对光散射能力，这里使用了我们自己制造的光散射仪器，它用于测量垂直于入射光各个角度的散射光，我们在其他地方对其加以描述。表6表明，实验测量的由金组成的颗粒的散射能力比由聚苯乙烯组成的颗粒大得多。两种颗粒是在相同的可见光入射进行比较的。表6中的实验测量值比计算值低2～3倍。这个差值主要归因于与计算值有关的(看表3)金颗粒的摩尔消光系数实验测量值大约低2倍。另外，这也存在颗粒大小的某种程度的不确定性(例如对于制备21nm±1.5nm的聚苯乙烯颗粒，实际的大小为1.5nm的差别)。这种不确定性对聚苯乙烯和金颗粒都引起数值的较小的不确定，但并不改变相散射能力的基本结论。至于对于更大程度的不确定性，表6也表明，在最小值，金颗粒的光散射能力比类似大小和形状的聚苯乙烯颗粒大100～200倍。
表7比较了，对于不同波长的可见光，相同大小和形状的金颗粒和聚苯乙烯颗粒的相对光散射能力。表7表明，甚至在照明光波长远离最大光散射强度波长时，金颗粒的光散射能力比类似大小和形状的聚苯乙烯颗粒大得多。这些实验结果与计算结果相符(看表2)。
表8表明，在白炽灯光照明的条件下，球形金颗粒的光散射能力实验测量值比类似的聚苯乙烯大很多。
总的说来，我们这里给出的计算值和实验值符合得相当好。这对于用来鉴定可能有用颗粒材料和组合物，以及估评这样的颗粒的光散射特性的计算结果和计算过程的利用提供了充分的根据。多种光源，无论是产生多色和/或者单色光，稳态光和/或者脉冲光，连续光或者不连续光都能用于照明。我们的结果表明，更特别的和更强的光散射信号都能从金属样颗粒得到，这是与类似大小和形状的非金属颗粒相比较而言。我们的结果表明，目前这个发明提供了一种探测含量更低的颗粒的方法，并且适于更专门地探测含量更低或更高的颗粒，这在以前是不可能的。
表6入射光波长为金颗粒最大散射时波长，在水中类似大小和形状的聚苯乙烯和金颗粒的相对散射能力的计算值和测量值
a)计算针对绝对球形颗粒(b)制造商测量的颗粒大小，制造的颗粒是球形的但不是绝对的球形。这将稍微影响数值方面的比较(c)PST～聚苯乙烯表7入射光波长远离金颗粒吸收带时相似大小和形状的聚苯乙烯和金颗粒在水中相对散射能力的测量值<
a)制造商测量的颗粒大小(b)PST-聚苯乙烯(c)由于PST和金颗粒大小的不同调整金颗粒的相对光散射值，这利用了散射光强度随半径6次方增加的关系。尽管在这些大小范围内，这也是不很准确的，校正数字是很好的近似。
表8相同大小和组成的聚苯乙烯(PST)和金颗粒在水中白光照明下相对散射能力的测量值
(a)聚苯乙烯来自于Interfacial Dynamics.Inc.,Porland.Oregonor Duke Scientific,Inc.,Palo Alto,CA.而金颗粒来自于Goldmark Biologicals,Phillipsburg,N.J.一个捐献者对British Biocell LTD.,Cardiff.UK.(b)制造商给出颗粒直径(c)利用散射能力随颗粒直径的约6次方增加的关系得来。与荧光相比，颗粒的发光能力荧光常常用于很多检验中，以探测某种分析物是否存在。
荧光素是一种了解最多和使用最广泛的发生荧光的化合物。很多研究为探测尽可能低的荧光素分子的目的所推动。荧光素具有高十进制摩尔消光系数(大约6×104M-1cm-1)和非常高的荧光量子产率，大约为0.8。
表9比较了某种颗粒与荧光素的计算出来的信号发生能力。很明显，单一金或银颗粒是比单一荧光分子更强的光源。在理想条件和利用合适的光学滤波片，一优质的荧光计可探测荧光素达到较低的约为10-10M～10-11M的浓度。表9给出的比较表明，这样荧光计能够探测60nm的金颗粒更低的浓度达到10-15M～10-16M。在实验中我们已验证了这些观察结果。
表9表明，单一60nm金颗粒总散射光输出相当于约350,000个荧光素分子的输出。一个荧光素分子不能直接在光学显微镜中看到，但我们能直接看到在多种不同样品和检验格式中的单一金属样颗粒。在样品上光直接以这样的角度射出，使得从颗粒散射的光能够最强被眼睛或光探测量看到和探测。我们发明的这种可广泛应用的照明和探测方法称作DLASLPD(以只有颗粒散射光被探测的角度的直接光照)，它以某种形式或其他形式用于分析性和诊断性的应用中。这些方法在其他地方详加描述。这允许单独颗粒的探测和这些颗粒的数量测量，使用颗粒计数方法包括图象分析，光子相关光谱，光学显微镜和其他方法。相比较，只有非常大的聚苯乙烯颗粒使用DLASLPD技术在光学显微镜中能看见。
表10给出了用白光照明实验测量的荧光素和不同大小金颗粒的相对信号发生能力的结果比较。这些结果与表8给出的相似，并且表明金颗粒的光发生能力比荧光素分子大得多。例如，在白光照明时，直径为39.9nm和59.6nm的金颗粒发出的光强度对应等于约2×104和2.3×105个荧光素分子发出的光强度。
在白光照明下，金颗粒发出的散射光由入射光出现的所有波长组成，但是在任何特殊波长的光散射效率并不相同，以致于一个或多个散射光波长带散射更强烈。实际的波长组成和散射光波长对散射光强度的关系曲线，在白光为入射光时，依赖于很多变量，它们包括光源类型和光探测方法。表10的结果是通过白炽灯光源或色温为2800开尔文的光源得到的，并且光通过一简单的滤波片使光通过样品之前减弱红外成分。散射光强度用标准的光电倍增管测量。表10中的结果没有因为光电管和光源特性进行校正。任何同样的校正将不会影响这里讨论的结论。
表9各种组成和大小球形颗粒与荧光素的理论相对信号发生能力
(a)荧光素和颗粒用相同的光强照明各自波长分别为最大荧光和光散射信号时的波长。对于聚苯乙烯，入射光波长为300nm，而对于金或银颗粒使用的入射光波长为各种大小时最大Csca值的波长。
在表11中给出了，单色入射光照明下荧光素和粗略为球形金颗粒的相对信号发生能力的测量结果。荧光素样品用单色入射光(波长490nm)照明，发出的光并不是单色或者偏振的，而是由体现荧光辐射特征的各种波长组成。大小不同的球形金颗粒用单色的入射光照明，其波长为最大散射时的入射光波长，散射光结果要么是完全偏振光要么是部分偏振光，这依赖于颗粒的大小。
表10白光照明下荧光素对金颗粒的相对信号产生能力的测量值(a)
(a)入射光为Leica显微镜的白炽光源，其色温为2800°K辐射光通过一玻璃透镜来减弱红外光成分。(b)PST-聚苯乙烯(c)结果没有校正。
表11单色光照明下荧光素对金颗粒的相对信号产生能力的测量值
(a)实际测量给出大小(b)单色入射光为从单色仪出来的水偏振光主要部分所组成。垂直偏振入射光也将产生明显更大的颗粒信号强度，但不影响荧光素的信号强度(c)结果没有校正。
表11表明，单色入射光照明下，从不同大小的一种金颗粒产生散射光信号强度比从单一荧光素分子产生的光信号要强得多。这些结果更表明了，单独金属样颗粒，例如金颗粒在单色入射光照明下能探测到相的浓度，以合适的探测方法，使用这样的颗粒作为在诊断性检验分析性申请，这种可探测性是极其有用的。
非金属颗粒，如聚苯乙烯，在颗粒中结合100～1000个具有高荧光的分子在此领域中众所周知。例如，这样的颗粒，直径110nm，其中结合一荧光化合物，它具有的最大激发和发射波长分别为490nm和515nm，这与荧光素相类似。每个颗粒包含平均约为4400个具有高荧光的分子，每个颗粒的体积约为7×10-16cm3，颗粒的荧光分子浓度约为10-5M。表12给出直径为110nm的聚苯乙烯颗粒和直径100nm金颗粒的光产生能力的实验测量结果，其中聚苯乙烯颗粒嵌置很多具有高荧光的化合物分子。这些样品光产生能力与给出同样光产生能力的荧光素溶液直接比较。注意到从单独的110nm聚苯乙烯颗粒产生的总散射光信号与大约12,000个荧光素分子产生的光信号差不多相等。在聚苯乙烯颗粒中出现荧光分子仅仅增加总的光信号约1.5倍。这种颗粒的荧光信号可通过在样品和探测器之间使用一合适滤波片与光散射信号分开，该探测器排除入射光波长，通过以荧光辐射为特征的波长。这样的一种滤波片导致这种颗粒产生的荧光信号强度等于大约3,000个荧光素分子的信号强度。与这些颗粒相比，直径100nm的金颗粒明显具有更优良的光产生能力。
表12荧光素、聚苯乙烯颗粒，含有荧光物分子的聚苯乙烯颗粒和金颗粒的相对信号产生能力的测量值
a)测量表示大小(b)看表11(b)(c)结果没有校正(d)聚苯乙烯(e)这里使用的100nm颗粒与表11使用的不是同一批。混合组成颗粒混合组合物的球形颗粒通过理论的和实际的实验得以估计，以确定他们用于各种诊断性和分析性的检验中的可能性。对于理论估计，包被着不同厚度银的金“核”颗粒和包被着不同厚度金或聚苯乙烯的银核颗粒已被研究。“核”意指球形颗粒，外面包被一附加层或厚度的不同光散射材料，导致某种比例的混合组合物。对由混合组合物组成颗粒进行了直接的实际实验，这颗粒是直径为16nm金颗粒核外面加一厚层的银。在这里说明性的实施例中，金和银材料是金属样颗粒的代表，聚苯乙烯是非金属样颗粒的代表。这些实施例只是大量不同可能组成的几种而已。不同可能组成包括由一种或多种金属样和/或非金属样材料的混合物。
关于上面说明性实施例的光散射特性的计算结果在表13和14中给出。表13A部分表明，对于系列的直径为10nm的球形颗粒，由在金核外比例逐渐增加银包被层所组成，其光散射性变化非常象纯金颗粒。更重要的，我们在这些计算和实际的实验中，某一比例的银包被金的颗粒可出现两个强的光散射最大值，这时入射光波接近大小相近的纯金和纯银颗粒的特征光散射波长。
使用简单的光子显微镜，在DLASLPD的条件下，利用的光照明对16nm直径金颗粒，其外包被银层，进行直接实验观察表明，从这些出现新颜色的散射光，这在以前在纯金或纯银颗粒样品中没有看到。很多颗粒具有极亮的紫色到深红色的散射光。
表13的B部分给出针对由10nm直径的金核外面包被不同厚度银组成的混合组合物颗粒计算结果的比较。结果表明与在表13A部分看到的同样趋势，这些混合组合物的光散射性质随着银和金的比例发生变化。在另外的计算中(表14)，银核外包被不同厚度金形成颗粒，如表13中所看到金和银的比例发生改变，其光散射性表现同样的变化趋势。
表13由混合组合物--包被银的金核组成的球形颗粒的散射特征计算值
结合理论和实际的实验，我们认定下面的(结论)。对于由金属样材料的混合组合物组成的颗粒，如金和银的混合组合物，出现新的光散射特性，它们在很多不同样品类型和专门的诊断性和分析性的申请是很有用途的。具有两种或更多光子上不同并可分辨波长的高光散射强度的颗粒可通过改变金属样材料的组成制得。
相反，由非金属样材料和金属样材料的混合组合物组成的颗粒，总的表现出类似于非金属样材料和金属样材料比例相当或略少的金属样颗粒的光散射性质。只在非金属样材料比例高于金属样材料时，混合组成物颗粒的光散射特性类似于如表14B部分中结果所表明的非金属样颗粒的光散射性质。
混合的银-金组合物和银-聚苯乙烯组合物都表现出以纯金属样材料组成的颗粒为特征的很高的光散射能力和可见的散射带波长。通过专门探测一个或两个散射强度峰时的散射光，或者探测一种颜色或多种颜色，某种混合组合物的颗粒是可以探测的。这样的混合组合物颗粒提高了探测微量颗粒的能力，更加特别地，提高了探测比以前可能的更少和更多数量的颗粒的能力。非对称形颗粒按照光束进行实际双向的非对称形颗粒具有另外的散射光特性，这将用于这些颗粒的探测。RIFSLIW的特性可用在本发明的很多不同方向，以更专门和更灵敏地探测和/或测量样品中一种或多种分析物或颗粒。例如，散射光强度的闪烁不定和/或颜色的改变提供了另外的探测方法，以决定哪一种颗粒结合了某一表面，哪一种颗粒没有。这允许非间隔性类型的检验(均匀的)得以发展。所有需要的就是依靠颗粒计数，强度测量等来探测颗粒，这颗粒不闪光和/或不改变颜色。未结合的颗粒在溶液中会闪光和/或改变颜色，而结合于表面的颗粒不会。另外图象处理方法如图像记录仪等提供另外的探测方法，其用于非对称的和球形(对称的)的颗粒。例如，在间隔性或非间隔性格式中，通过聚焦合聚透镜于表面，并且只记录某段时间内连续的单位面积散射光信号，结合颗粒便被探测。在溶液中进行布朗运动和其他运动的游离颗粒导致单位时间单位面积不同的散射光强度。结合光散射颗粒是空间固定和不移动的。利用图像处理方法分开“运动的”光散射颗粒和“结合的”光散射颗粒，结合颗粒的数量就得以确定，并且校正到符合样品中分析物的数量。此领域的技术人员会认识到，有很多其他图像处理方法可用于区别结合于表面的颗粒和溶液中未结合的球形或非对称形颗粒。在表面上或颗粒核上另外加入其他材料以提供与光散射特性无关的其它物理属性在某些申请中，使用某些类型的组合物，包被颗粒表面使得颗粒的化学性质更加稳定，或者增加在分析性和诊断性检验的专门申请中很重要的附加表面结合性质，这可能是非常有用的。例如，众所周知银很快会氧化。对于银颗粒的使用或者包含银的混合组合物颗粒的使用，应用包被一薄层金或其他物质于银上，可以增加含银颗粒的化学稳定性，使得银不再易于受到环境对其化学稳定性的影响。
在另一个实施例中，可能需要其他材料包被表面，如含有专门的结合性结合剂的聚合物，或者用于附着的结合剂的其他材料，或者结合自己于颗粒上的介质。在这些实施例的每一个中，这些薄包被层不会明显地改变核材料的光散射特性。“薄”包被层意味着单层或类似情况地包被在颗粒表面。
可处理的光散射颗粒(MLSP’S)是这样的颗粒，除了具有一种或多种理想的光散射特性，它们还能应用EMF处理为一维、二维或三维空间。MLSP颗粒可用不同的方法制备。例如，MLSP颗粒通过给直径很小“核”铁电体，磁体或类似材料包被一层更大比例的具有理想的光散射特性的材料来制备，例如，直径10nm的磁体或铁电体材料的核，用足够的金包被而得到50、70或100nm直径的颗粒。这在图29A中给出。
制备这样颗粒的另一种方法是，把具有理想光散射特性的材料包被上一薄层磁体或铁电体材料，例如，约50nm的金或银颗粒包被上一层1-2nm厚的磁体或铁电体材料。这在图29B中给出。
另一方面，MLSP颗粒通过混合适当比例的理想的光散射材料和铁电体或磁体材料而得到。如此制成颗粒，每个颗粒比例光散射理想材料对磁体或铁电体的适当比例得以得到。这在图29C中给出。
对上面的MLSP颗粒的一个选择是，连结或安装一种或多种具有理想光散射特性的颗粒于一种或多种能够用一EMF移动的颗粒之上。这种复合颗粒结构能够具有与MLSP颗粒相似的特性。例如，磁体或铁电体材料的小颗粒连结到一种或多种其光散射特性被探测的颗粒上。连结利用电离、化学或其他方法，导致一稳定复合颗粒结构。例如，不同的颗粒用合适的聚合物包被，以致于当以合适比例混合时，稳固复合颗粒结构的限定分布便通过交叉连结不同种类单独颗粒而得到。这里有很多不同的方法把颗粒连结在一起，得到理想复合颗粒结构。出于说明的目的，几种可能复合颗粒结构在图30中给出。图30A、B、C表明，二聚物、四聚物和更高级颗粒相对应地形成可取向的MLSP颗粒。在能力域的技术人员将认识到，只存在多种不同的可能的复合颗粒结构的少量几种，并且有很多方法制备这样的结构。
由一种或多种颗粒的混合物组成的这些颗粒样品是可能的不同材料的大量不同组合物的几种而已，并且对于本领域的技术人员是显而易见的。颗粒大小、形状和均匀性依靠于怎么探测颗粒的光散射特性，合适的大小和颗粒大小的分布数量可能是极重要的。例如，很多商品化可用的金颗粒样品引用颗粒大小分布大约从＜10到＜20百分比偏差。偏差的百分比定义为颗粒大小的标准偏差除以颗粒样品的平均值。这样，对于60nm的颗粒样品其偏差的百分比为20％，那么一个标准偏差单位大约为±12nm。这意味约10％的颗粒比48nm小或比72nm大。这样的大小偏差对样品中依赖于适当颗粒平均大小的散射光强度和散射光颜色有很大影响。
我们已经发展一个颗粒生长方法，它似乎给予比那些商品化可用的颗粒更狭窄的大小分布。方法包括，首先，制造“种”金颗粒的样品，然后用“种”颗粒用化学方法生长不同大小的金(看实施例11和15)和银颗粒(看实施例13)。例如，16nm的金颗粒用作“种”颗粒，更大直径金颗粒通过增加适当的反应物制得(看实施例15)。这种方法对于制造混合组合物颗粒也是非常有用的。颗粒均匀性-利用单一颗粒的散射光颜色探测分析物在某些应用中，单一颗粒的颜色用于鉴定和量化特定的分析物。例如，在图象细胞测量应用中，通过探测依附在表面的不同种类的颗粒的数量和颜色来鉴定和计数不同种类的细胞表面抗原等，这可能是有趣的。对这种或其他有关的复合分析物探测，不同颗粒的大小分布需要尽可能保持固定。颗粒样品中的颗粒平均直径应选定以提供白光照明下的理想散射光，其平均或“中间”的颗粒大小选定为在较小和较大颗粒的中间颗粒大小的中心大小，这用于同样应用中以产生不同的散射光颜色。这种方式中，通过散射光颜色决定颗粒的不同类型的可能性达到最大程度。颗粒均匀性-积分光强度测量在其他部分里，我们已经描述了散射光强度怎么随颗粒大小增加或减小而剧烈变化。当积分光强度测量在进行时，这种强度上的变化必须特别地考虑。使用上面描述的具有20％偏差的60nm颗粒制备品，这意味10％的颗粒具有比60nm颗粒高或低3倍的强度。另外，剩余90％的颗粒具有相当不同的强度。在测量很多颗粒的应用中，平均聚集光强度应该接近60nm的颗粒。但是，颗粒浓度较低时，这样的偏差统计量可能影响辨别样品的准确性，并且校正算法可能是需要的。利用尽可能狭窄的颗粒分布，测量的准确性和容易度得到增加。利用光吸收颜色检测分析物的有用的金属样颗粒对于某种分析物检验，分析物达到这样的浓度，利用光吸收特性检测分析物可以实现。例如，在免疫层析检验中的当前问题就是典型大小(4到50nm直径)的颗粒的使用只提供给那些用光吸收颜色法不能光学上解决的颗粒。当在滤纸或类似的固体诊断性检验介质上观察时，这些颗粒呈现出从粉红到红色。改变银和其他金属样颗粒的大小和/或形状，很多不同的光吸收颜色能够得到。通过颗粒的光吸收颜色，这些不同的光吸收颜色能够用来探测不同的分析物。这些能够用眼睛观测的颜色，在很多种固相检验中是非常有用的，如免疫层析流动检验，棋盘(panel)类型，和微阵列或较大的固相的单一或复合分析物检验。球形或非对称的银颗粒和某种混合物的其它金属样颗粒允许宽范围的光吸收颜色。颗粒光散射特性的自动金相显微的增强在本领域众所周知，自动金相显微术和相关技术能够用于或多或少地放大现存的金属样颗粒的大小。由金属和/或半导体材料组成的颗粒的光吸收能力，特别是金颗粒和银颗粒已经常常用于量化和/或探测这些颗粒的出现，通过眼睛或测量光吸收的仪器来得到。这样的一种方法次于目前发明的光散射探测方法，它能够探测金相显微术放大的小数量的颗粒。
例如，已有报道(参看免疫金-银染色，原理，方法和应用，CRC.Press,1995,M.A.Hayat Ed.)称，1nm直径的金颗粒用金相显微方法放大，在20分钟内用银包被1nm直径的金颗粒到约100nm。这种制备品的颗粒大小范围在40nm到200nm直径，形状近似为球形。令人吃惊的是，我们的计算表明，放大lnm直径示踪核颗粒到110nm导致散射能力大约1010倍的增强，而光吸收能力只增加大约105倍。
与同样材料微小核颗粒相比，增加微小颗粒的直径，最大光散射发生时的入射光波长向长波移动。因此，测量放大的颗粒的光散射信号，更容易探测微小1nm颗粒的存在还是不存在。利用放大的颗粒的入射光波长为最大光散射发生的波长时放大的颗粒的探测，给予与形成主要源的非特定光散射背景的更小颗粒相对比的放大颗粒的更专门的探测。
表14球形混合组合物颗粒-包被金或聚苯乙烯(PST)的银颗粒的散射特性计算值
>(a)颗粒只由聚苯乙烯组成。
表15给出是，考虑到由金相显微术或相关的方法增加大小的微小颗粒的光散射特性时附加的数据。我们的计算数据表明放大颗粒的大小导致颗粒的光散射能力与其光吸收能力有更大的增长。例如，颗粒直径增加20％就增强微小颗粒光散射能力(1.2)6或大约3倍。微小颗粒直径增大2和10倍，将导致光散射能力大约64倍和1,000,000倍的对应的增强，而光吸收能力对应地增加仅仅8倍和1,000倍。
因此，当本发明的方法用于量化和/或探测由金相显微术放大的颗粒的出现(这就是把金属样材料包被到由金属样或非金属样材料组成的微小直径颗粒的沉积作用)时，便可能探测更小数目的这种颗粒，和更特定地探测更小数目的颗粒，这比以前更加可能。
上面所述是对金属样包被的沉积作用与金属样颗粒核金相显微术放大的相结合的说明，接着的是利用本发明方法对放大的颗粒的探测。这种方法也能够用于在溶液中游离的和/或依附在某一表面上的放大的颗粒。上面的实施例只是这种结合方法的很多不同排列中的一种，这种结合方法包括这里讨论过的用光散射探测颗粒的很多不同的技巧和方法，还包括核和包被组合物与不同程度放大作用的不同结合。这些有选择的结合对于能力域的技术人员是非常明显的。这样的结合途径能够适应于大多数情况，这对于利用一信号产生和探测系统来探测分析物是理想的。
表15 2nm直径的金示踪核颗粒-不同厚度的银包被层，每层厚度统一-计算的光散射特性<
a)摩尔Decadic消光系数，Csca和最大光散射发生时的入射光波长基本上与10nm直径的纯银颗粒相同。折射率增加的方法利用在光学显微镜，电信和其它相关领域中的折射率匹配技术，在能力域众所周知。这种技术一般用于减少非特定的光散射和反射，这发生在光束从一种介质或装置到另一种介质或装置时，如从一种材料的表面到另外一种不同材料的表面。
我们已经认定，特定颗粒的光散射能力(Csca)受到颗粒位于其中的介质影响。改变介质的折射率导致颗粒光散射特性的变化。
表16提供了一说明性的实施例，介质折射率影响选定的颗粒。折射率介质对10nm直径的金、银和聚苯乙烯球形颗粒理论上的影响给出了。
如表16表明，介质的折射率对金属样颗粒的影响相比与非金属样颗粒是相当不同的。介质折射率的增加，对于金属样颗粒如金颗粒，导致光散射的最大值波长和强度都增加，而对于非金属样颗粒如聚苯乙烯，光散射能力减弱了。
受样品介质折射率影响，金属样颗粒与非金属样颗粒相比所具有的独特的光散射特性能够用于更专门地和更灵敏地探测样品中金属样颗粒，这包括那些具有高的非特定的光散射背景的样品。对于很多不同类型的诊断性和分析性的检验，这是重要的。
表16折射率对10nm直径不同组成的颗粒的理论上的影响，波长和强度影响
(A)=不同介质折射率时的相对散射能力(B)=最大散射发生时的波长N1=介质的折射率在很多种样品和诊断性检验格式中，非特定的散射光，反射光和从样品容器和非分析物样品成分发出其他背景光的问题众所周知。这些非特定的背景光使得通过探测和/或测量颗粒的散射光特性来对分析物进行灵敏性到超灵敏性探测是困难的，要不就是不可能的。
我们已经认定，利用折射率增强的方法，金属样颗粒与非金属样颗粒相比能够探测到更大的特异性和灵敏度。此方法现在加以描述。颗粒和介质的折射率对散射光强度的影响能够通过下面的表达式进行估计(RI是折射率因子)。RI=refmed4|m1+1m2+2|2---(16)]]>其中Refmed是介质的折射率，并且m是等于颗粒的折射率/refmed,m隐含地依赖于波长，但准确的依赖性随颗粒的组成和介质变化。大多数无色的溶剂的折射率通常与波长无关，至少在可见光区如此。
利用在灵敏的检验中颗粒的光散射来决定那个折射率值导致更高的光散射强度，这是有趣的。这从方程(16)中折射率因子(RI)得以确定。这个因子在方程(16)中分母是0时具有最大值。对于这个条件，折射率因子有无穷大值。这样，很高的光散射的条件是m2+2=0(17)解上面的方程中的m，我们得到m=-2----(18)]]>=1.41i(19)其中，i=-1]]>。上面的方程表明，当折射率是纯虚数其值为1.41时，折射率因子有其最大值，颗粒的光散射也最大。表16中给出的理论数据符合预想趋势。另外，当入射光波长远离金属样颗粒最大光散射时的波长，折射率增加的方法也是效果非常好。
现在提供一个利用折射率增强方法的说明性实施例。在高散射样品中，如具有很高的非特定光散射背景的样品，金属样颗粒和折射率增加方法都如下所利用。
能力域中的技术人员增加样品介质的折射率方法有，放置一层水或其他液体在干或湿样品的顶部，这增加介质的折射率。另一实施例是，把血清或其他种高散射样品稀释于高折射率液体中，这样根本性地增加介质的折射率。
对于上面提高的实施例，下面的过程出现了。当样品的折射率增加时，金属样颗粒特定的光散射信号增强，而非特定的光散射背景减弱。如表16中所示，当样品介质的折射率达到金属样颗粒的折射率时，颗粒中光散射与非特定散射背景的比值的最大增加量得以实现。这意味着，在合适的介质折射率值，从血清蛋白或类似的组成物散射的非特定光能够明显的降低或减弱，而颗粒的特定的光散射强度却增强，在金属样颗粒的光散射特性用作分析示踪物时，这导致分析物探测极优的信噪比。这些方法能够用如干燥表面，溶液包被的表面和溶液等样品。
这些(折射)率匹配方法也能够用于长波，对金属样颗粒更大地增加其特定光散射信号与非特定散射背景的比率。尽管表16只给出了对金和银颗粒的影响，但由其他金属样材料组成的颗粒也能用我们描述过的方法来探测较小数量的颗粒。这里折射率增加方法的描述给出的是本发明的很多可能应用的其中几种。本方法的很多其它变化是可能的，对于能力域的技术人员是明显的。一种或另一种的这些变化能够有效地应用于大多数诊断性格式中以决定分析物的是否出现。本发明的这个方向提供一种方法，它针对较小数量的颗粒的探测，和较小数量颗粒更特定的探测，和更特定地探测比以前可能的更少和更多数量的颗粒。
本发明的一种方法，结合了折射率增加和早以描述的窄带通过滤波片法，对探测比以前可能的更少或更多数量的颗粒提供很大用途。这些方法是并协的。折射率增加方法用来减弱非特定光散射背景，而窄带滤波片用来降低或减小其它来源的非特定背景光如荧光等。这些方法的结合导致更优化的颗粒特定散射信号与非特定光背景的比值，并且允许更专门更灵敏的颗粒探测。
上面的实施例只是这种结合方法的很多可能变化中的一种。其他的变化对于本领域的技术人员是显而易见的。在高散射和荧光样品-血清中光散射特性的探测哺乳动物的血清包含很多生理上重要的物质，其数量和/或存在在分析实验室和其他地方里得到确定。很多不同的信号产生和探测方法用来确定血清这些分析物的出现，并且这些方法包括光信号产生方法如荧光、光散射、化学发光，还有色谱测量方法，用于包括直接标记和信号放大方法的格式中。天然血清包含一种物质，其能够通过荧光或者化学发光或者光散射机制产生一种非特定的光信号。另外，血清还包含干扰来自于示踪体的特定光信号的产生和/或探测的物质。这些困难使得在纯的或近乎于纯的血清样品中进行分析物探测变得很困难，要不就是不可能。
为了能够有利地利用大多数，即使不是所有现存的测试系统以探测血清，那么以某种方式对血清进行预先处理是差不多总是必要的，以使得血清适合于测试。很多这样的血清处理方法已存在，并且也许最简单的办法是把血清稀释于合适的溶液中，这通常是天然的水。另一常用的方法是以这样的方式进行实际的测试，这方式就是，在产生示踪物的特定光的出现得到确认之前，移去不理想的血清成分。从费用和劳动力的观点来看，需要进行测试的力量和试剂越少越好。完全不预处理样品是最理想的。这种能力对于测试的操作可能也是有利的。本发明的方法提供了一种方法，在几乎是纯血清中进行这样的分析物测试，并且更是提供一种方法，在高浓度血清中更专门地探测比以前可能的更少或更多数量的颗粒。
例如，通常在用荧光示踪物，如荧光体分析血清样品之前，把它稀释到大约百分之五的血清浓度。血清样品在490nm的单色光照明下，光学滤波片用于把非特定散射光背景减弱到最小。非特定光信号等于含有10-8M到10-9M荧光素很纯的液体样品产生的信号。这样，在5％血清样品中，能够探测信噪比为2时的10-8M到10-9M荧光素。在95％的血清样品中，荧光素探测的最低限将有约高19倍，或者约1.9×10-7M到1.9×10-8M。这样，在95％的血清样品中，使用光学滤波片，荧光素探测的最低限约为1.9×10-7M到1.9×10-8M，并且这数量荧光素的光信号产生(总光信号)对(非特定光信号)比值大约是2比1。
表17给出实验中可测量的探测限度。在非常高浓度血清中荧光素的限度为(总光信号)对(非特定光信号)比值2比1。在这个高血清浓度并且用光学滤波清除由散射的入射光引起的非特定光信号，荧光素的探测的最低限约为6×10-7M。
表18给出，当用于减弱由散射的入射光引起的非特定光信号的光学滤波片放置在样品和光子倍增管之间时，非常高血清浓度中荧光素探测的最低限。在这种状态，高血清浓度中荧光素探测的最低限大约为2×10-8M。
与荧光素对比，表17B部分和表18中给出的结果表明，存在光学滤波，在95％血清中59.6nm直径的金颗粒能够以(总光信号)对(非特定光信号)的比值2比1探测到大约1.8×10-12M的浓度。从血清中观察到的非特定光信号等于大约5×10-7M荧光素的信号。在同样的条件下，60nm直径的聚苯乙烯颗粒在高血清浓度中只能探测约6×10-9M的最低限(看表18)。
表17 59.6nm直径的金颗粒在高血清浓度中的探测<
胎牛血清购自于Biowhitaker,Walkerville，样品编号14～501F。血清出售前通过1微米过滤器过滤，并且是清洁的，略微有点颜色。血清pH值调整在9到9.5。发出的光没有进行滤波。(a)这里得到的光信号表示为值1，这个信号等于3.7×10-7M的荧光素。
表18在92.8％血清浓度荧光素，金和聚苯乙烯颗粒探测的最低限
聚苯乙烯(PST)和金颗粒的测量直径分别为60nm和59.6nm。含有荧光素的溶液pH值在测量前调整在pH9～10。血清中的最大光强度被观察时的入射光波长对于荧光素约为496nm，对于59.6nm金颗粒约为554nm。(a)从样品中发出的光信号在进入光电倍增管之前通过No.16的Wratten滤波片。(b)仪器测量结果都是在同一套仪器装置上得到的，互相可直接相比较(mv=毫伏)(c)光探测仪器探测荧光素发光比颗粒发光稍微较高的效率。例外，对于水平偏振光入射的单色光更丰富，并且这将用于较低的光散射减弱颗粒的结果，但不会影响荧光素的光强度。整个仪器偏向荧光信号大约1.5-2倍。
表19给出的结果表达了，在95.7％血清中，100nm直径的金颗粒，110nm直径聚苯乙烯颗粒，和每个颗粒包含4,400个高荧光化合物分子的110nm直径聚苯乙烯颗粒的相对探测极限的对比(总信号比非特定光信号的比值为2比1)。这些结果更表明，100nm直径金颗粒比110nm直径聚苯乙烯颗粒或包含高荧光化合物的聚苯乙烯颗粒能被探测到更低的浓度。金颗粒在血清中能够被探测到比其他的非金属样颗粒低约230倍的浓度。
表20比较了，在相同照明条件下，从相同浓度的59.6nm金颗粒分别在包含高浓度血清溶液中和只含有水的溶液中，测量散射光的数量。在这些条件下，1.8×10-12M浓度的金颗粒是可以探测的，其信噪比约为3。这些结果表明，血清或其他相同的成分的出现并没有显出对金颗粒光散射能力的任何影响。金属样颗粒的光散射能力的稳定性和惰性使得它们在样品，如血清和其他相关的含有很多其他成分的样品中极其有用的。
在血清中100nm直径球形聚苯乙烯颗粒和金颗粒的探测提供更具说明性的实施例。
哺乳动物血清含有大约质量百分比为3.7的蛋白质，其中大约三分之二为血清蛋白。血清中聚苯乙烯颗粒的探测被妨碍了，被来自血清中的蛋白质和其他物质，还有其他来源所妨碍。在血清中聚苯乙烯颗粒与蛋白质以及其他物质具有类似的光散射能力对入射光波长的关系曲线，这严重地限制了探测在血清中或其他高散射介质中聚苯乙烯颗粒的能力。
表19在高血清浓度中，由金、聚苯乙烯(PST)和含有荧光化合物的聚苯乙烯组成的颗粒的探测
(a)来自于Interfacial Dynamics Corp.,Portland,Oregon.每个颗粒大约含有平均4400荧光分子，对于荧光分子激发和发光最大值分别为490nm和515nm。颗粒中的荧光化合物浓度约为3×10-2M。(b)来自于Interfacial Dynamics Corp.(c)由本领域熟知的方法制备(d)没有对发射光滤波(e)观察的光信号表示为值1，所有其他值与这个值比较而得，这个信号等于从约2×10-7M的荧光素的信号。
表20产生于在高血清浓度和O血清浓度中59.6nm直径金颗粒的信号
金颗粒相应地具有59.6nm的测量直径。95.7％的血清稍微有点颜色，并且其光学不透明度在543nm波长时为每厘米光程0.14。限定的散射测量在一6mm×50mm具有5mm内径的玻璃管中进行。据估计血清的光吸收减弱大约15％的散射光信号。
使用575nm的入射光代替300nm照明血清，导致非特定光散射信号约13倍的减弱，但是也导致聚苯乙烯的特定散射信号大约同等程度的减弱。对于聚苯乙烯或其他非金属样颗粒，增加照明光的波长并没表现出，显著增加特定信号与背景的比值，也就是说，样品中聚苯乙烯颗粒的可探测性。
相比较，通过增加照明和/或探测的可见光波长，金属样颗粒相比于非金属样颗粒探测到更大信号与背景的比值。100nm直径的金颗粒在类似于水的含水介质中的散射光最大时的波长大约为575nm。用约575nm波长的单色光照明样品导致金颗粒的最大光散射信号的产生，并且显著地减弱非特定光散射信号。例如，在这样的条件下，相比于在与300nm波长的入射光相关的300nm波长的照明光下，其总的非散射光散射减弱大约13倍。
用入射光为白光照明血清样品，再加使在兴趣波长以外的光的数目减至最小的适当的光学滤波片(低于或高于中心波长为575nm的特定光波带)，提供了另一方法来探测血清中的较小数量的金属颗粒。在这些条件下，产生金颗粒的最大光散射强度的入射的可见光得以利用，而来自于血清蛋白质和其他物质以及其他来源的非特定光散射信号极大地减弱。当用白光照明(或几种不同的波长)，并且使用适当排列的光学滤波片，复合类型的不同金属样颗粒在血清样品中是可以探测的。这种方法利用了每种颗粒在最大光散射出现时入射光波长不同(的性质)。
另一种方法包括，通过一合适的偏振滤波片和/或一带通滤波片过滤来自于样品的总的光信号。使用合适的偏振滤波片将导致有效地排除非偏振的荧光背景，但很少影响非特定光散射背景，因为它是大部分偏振的。当使用宽波带照明时，如白光照明，使用大波长的光学带通滤波片能够显著地减弱非特定光散射和荧光背景。很多金属样颗粒在长波时具有高光散射强度，这个特性能够与带通滤波片和/或偏振滤波片方法结合起来加以利用。例如，300nm直径的球形金颗粒在大约700nm波长时具有接近的最大散射效率，它的散射光强度大约6倍于100nm直径的金颗粒。使用300nm颗粒和中心波长为700nm的带通滤波片减弱一半的非特定光，并且增强金颗粒散射能力6倍(相比于100nm的颗粒)。因此，在这个系统中信号与背景的比值增加12倍。把这种方法用于非金属颗粒，如相同大小的聚苯乙烯，不能显著地增加信号与背景的比值，反而可能实际降低了它。使用仪器中光学元件和/或样品室上抗反射膜，也可能增加信号与背景的比值。很多其他手段和方法也是可能的，这些对于本领域的技术人员是明显的。
本发明的这个方面导致分辨诊断性检验系统中特定光散射信号和非特定光散射背景信号的能力得以提高，超过把散射光的探测作为测试系统的一部分的其他方法。另外，利用白光照明下不同种类的金属样颗粒表现出不同的颜色，使得在一种样品中探测多种颗粒的存在成为可能，这对于探测一种样品中多种分析物类型具有实用性。
金属样颗粒更多的优点是这些颗粒相比于荧光化合物的化学惰性。这样的颗粒不会光漂白，并且它们的信号产生能力不受这样的机制影响。
对于利用由金属样材料组成的颗粒来提高分辨自于颗粒的特定光散射信号和来自于各种来源的非特定光散射信号的能力，上述的方法只是很多可能方法的一种。例如，很多手段是可行的，在这些手段中，这样的颗粒在与最大光散射发生的波长不同的波长时特定地探测。很多其他的手段或方法也是可行的，并且这些对于能力域的技术人员是显而易见的。
下面讨论通过检测一或多种光散射特征来检测固相或相关样品中的一或多种分析物。固相探测方法在前面的部分中，我们描述本发明的各个方面，它们涉及到金属样颗粒的某些光散射特性，和液体中这些颗粒的探测。现在我们来描述颗粒在一表面或非常接近一表面时的探测方法。
我们已经认定，利用金、银、和其他金属样颗粒，以我们的DLASLPD照明和探测方法，我们能够探测在单位面积里数量很低的颗粒和颗粒标记的结合剂(包被的颗粒)。使用简单的照明和探测手段，能够探测单种和位于或接近某一表面的结合剂所包被的颗粒。这些方法能够用于光学透明的或者光学不透明的表面。
我们已经认定，利用颗粒与照明和探测方法的某种结合，我们能够探测样品中颗粒浓度很宽的范围，从每平方微米(μ2)大约0.001到103个颗粒。使用合适类型的颗粒，不同种类的分析物能够被探测到非常低的水平，并且在同样的样品中，如在微排列中，达到非常宽的浓度范围。在一装置中，利用在同一样品中颗粒记数(在低颗粒浓度)和聚集光强度测量(在高浓度)，这便可实现。例如，如果利用固相相关的方法如排列切片或其他固相方法，一样品被针对两种或更多不同的分析物分析的话，样品中不同种类的分析物是以不同的浓度存在的。这就是说，样品中一些分析物可能存在较好或较低的浓度，相比于其他分析物从2到很小的数量级。采用这种方法，要达到理想的分析物探测灵敏度和浓度范围，选择合适种类的颗粒是非常重要的。这里我们描述的我们的方法提供对同样样品中分析物探测的方法。如果更强的光源如激光予以利用，并且把更高级的探测方法如共焦成像加到我们基本的照明和探测方法上，更宽的探测范围和更大灵敏度是可能的。
我们已经认定，我们能够更专门的更容易地探测高浓度的颗粒，也就是说，使用简单的方法可得到非常好的信号与背景的比值。在本发明的某些方面，要使用一聚光透镜(成像透镜，反射镜或其他装置)，在其他方面，则不用聚光透镜。
颗粒的散射光用一光学探测器探测，例如，光电二极管或光电二极管阵列，光电倍增管，照像机，摄像机或其他CCD设备，或人眼。颗粒的数量决定于单位面积的颗粒的数目计数和/或测量单位面积总的聚集光强度。探测和测量的特定的散射光特性为下面的一种或多种一个或更多波长时的散射光强度，颜色，偏振，RIFSLIW，和/或单位面积散射光的颗粒的角度依靠性。这与样品中分析物的存在，不存在和/或数量有关系。
在某些检验中，一种或多种分析物要决定，颗粒计数或聚集光强度测量，其中的一种或两种都要用到。应当指出，选择合适的颗粒和使用DLASLPD照明和探测方法，便可得到光学上可解决的和可探测的散射光强度，以致于更高级的光源，空间的和光学的滤波技术是不需要的。但是，在某些样品中，可能存在极大数量的非特定光背景，最终的信号与背景比便通过使用光学滤波片，共焦成像，或其他小孔型空间滤波技术得以提高，以增加颗粒的散射光信号对总的非特定光背景的比值。
在一些分析性和诊断性应用中，散射光强度，仅使用我们的基本方法，没有用聚光透镜或反射镜便可探测和测量。在这些样品中，以上面所描述的同样方法，不使用聚光透镜，散射光的一种或多种特性就可被探测和测量。现在来更仔细地讨论这种方法。利用聚光透镜或反射镜来探测光散射颗粒的散射光我们已经发现，我们能利用各种光收集光学装置来收集颗粒的散射光。我们已经使用颗粒记数和强度测量(单位表面面积的聚集光强)，用我们的DLASLPD照明和探测的方法来探测给定面积上颗粒的一种或多种特定的光散射特性。我们发现，在所做的大多数实验中，当颗粒浓度约为每μ20.1个时，使用计数测量方法通常是有用的，而颗粒浓度比每μ20.1个大时，我们发现测量总的聚集光强度是有用的测量方法。然而，应当指出，可以使用计数测量或聚集光强度测量方法，无论颗粒浓度高于或低于每μ20.1个颗粒。
用特定的一种或几种透镜来收集和/或对样品的散射光成像，我们发现针对我们在测量中感兴趣的表面区域或面积的有用关系，针对被测量的样品容器类型和用颗粒计数测量的颗粒浓度上限的有用关系。例如，如果我们感兴趣的是测量较大面积来探测散射光，一个10倍或更小的显微镜物镜或透镜或反射镜能够用于收集样品的散射光。同样，如果样品的更小面积要被测量，一个20倍、40倍、100倍；或者更大的显微镜物镜或类似的透镜或反射镜能够用于收集光。如果颗粒计数的方法要用于更高的颗粒浓度，更大能力的物镜可得到高浓度颗粒的更好的结果。应当指出，当使用更大的物镜，附加的要求和限制也开始产生影响。例如，工作距离变得非常小，并且浸没油可能必须加到样品上。当照相机、摄像机、或类似的CCD型光子探测器予以利用时，来自样品面积的总散射光被探测到。这信息接着被简单的硬件和/或软件方法处理，以分析散射光测量。这具有极强的能力，因为样品中很多不同的分析物能够使用固相微阵列，阵列芯片，或类似的格式来探测和量化。在微排列格式中，很小面积的表面分别包被上不同种类的结合介质，一个空间可分辨的区域特定结合一特别的分析物。下面我们描述本发明针对固相复合分析物微阵列等的特殊应用。
颗粒计数的方法通常比聚集光强度测量有更多仪器上的要求。然而，对于探测颗粒的一种或多种光散射特性，使用计数技术有很多优点。例如，光源和样品室的波动和不均匀性不会影响颗粒计数测量，而使用聚集光强度测量时，这些问题能够引起严重问题。另外，还有很多软件和硬件方法来增强用计数技术测量颗粒的品质和信号/背景比。没有使用聚光透镜或反射镜时光散射颗粒的探测我们也已发展，不需要聚光透镜来探测在或接近表面的颗粒的散射光的方法。在这个方案里，我们通常用聚集光强度法来探测来自于兴趣区的散射光。这用裸眼或以前描述的光子探测器就可做到。我们发现，当我们使用120nm左右直径的金属样颗粒时，以超出向前的散射光包络的角度放置我们的探测器(眼睛或光子探测器)，我们能够明显地提高颗粒的光散射信号与总的非特定光背景的比值。提高信号/背景比值的基本原理在我们详细地描述照明和探测的DLASLPD方法之前，先概述基本原理，当以一种或另一种形式使用时，它决定了光散射颗粒探测的信号和信号与背景的比值极限。这些方法附加调整和改变各种设备元件，如使用更强的光源，更准直的光源，更窄波带的光源，不同波长的光源，更灵敏的光子探测器，在照明光源和样品之间和/或在样品和探测器的光学的和/或空间的滤波片，和/或共焦的或类似的成像技术。这些策略和方法在下面给以概述。
(1)使用大直径的金属样颗粒，颗粒的光散射能力能够得到显著地增加。大小的增加也可能改变散射光强度对入射光波长的关系曲线。这些特性能够调整到满足任何特殊检验的需要，以致于一种或几种散射光特性能够很容易探测。例如，对于具有高的非特定光背景的样品中分析物的探测，较大的金颗粒，大约80～120nm直径或更大是有用的。与40nm直径的金颗粒相比，最大光散射发生时的最大波长向长波偏移，散射光强度也会增加。与40nm直径金颗粒相比，这两种效应的结合显著提高了信号/背景的比值。
(2)以超出向前的散射光的包络的角度测量样品的散射光，无论在强度还是计数模式方面，信号/背景的比值基本上是增加的。我们已观察到，探测器可以放置在样品表面所在平面之上或之下。并且照明光束安装在样品所在平面的同一侧或相反侧。在这不同的取向，来自于颗粒的特定的光散射信号，在向前的散射光包络以外进行探测，而大多数来自于样品室中和样品中其他成分的光畸变的非特定散射光，在向前的散射光包络以内进行探测。这使得更灵敏地和更专门地探测颗粒的散射光。
(3)正如我们前面所描述的，适量的非特定反射光也影响探测的灵敏度。我们已经发现通过移动入射光表面尽可能远离被探测聚光表面，适量的反射光能够基本上减弱。这以很多不同的方式得以实现，其中包括样品室的可适设计(以后讨论)。例如，我们注意到，如果我们把一薄层浸没油涂在玻璃片的底部，光束穿透玻璃片照在相反表面的颗粒上，我们看到极大增强的结果。在另一个实验中，当我们把小塑料光标粘在塑料样品室的底部，表面的对面有微排列的结合颗粒，我们看到极大增强的结果。我们也使用更好的光学准直手段，如等边棱镜和/或其他类型的棱镜或光标，并且还在样品容器与棱镜交界的表面涂上浸没油。我们总结出这些极好的结果。(ⅰ)具有远离含有光散射颗粒的探测区的光入射表面；(ⅱ)具有零度入射到光标如棱镜面等(对应垂直面)表面的角度和(ⅲ)在系统中产生的反射光的大多数被导出了系统而远离聚光点。所有这些方法对于提高各种样品中光散射特性的探测的信号/背景的比值是有用的。还存在几种光传输方法，能用于有效地把反射光传出系统而提高相对于背景的信号。
(4)折射率增加方法对于提高不同种样品中信号与背景的比值也是极有用的。我们发现提高相对于背景的信号的几种方法。现在来讨论其中几种。用液体包被含有颗粒的表面，液体的折射率越接近含有颗粒的表面的折射率，信号/背景比越好。我们发现，对于探测在干燥的固相上的分析物，在表面上包被上一层液体会提高信号/背景比。例如，当折射率约为1.33的水缓冲液包被在样品表面，我们便得到相对于空气中测量同一表面上颗粒更好的结果。甚至，使用非常接近固相折射率的液体，也可得到更好信号/背景比。例如，用包被着结合介质的光散射颗粒把分析物粘附在浸在样品介质或其他合适的反应混合物或缓冲层中的固相上，可以进行一种检验。样品中的溶液，在探测颗粒之前，被稀释或用包被在固相上的选择折射率的溶液所代替。以这种方式，高灵敏度的结果可以得到。
除了上面的方法，在照明光束和样品之间或在样品和光学探测器或眼睛之间再使用窄带通光学滤波器，截止光学滤光片，空间滤波器如光栏，将也提高信号/背景比。在某些分析性的检验应用中，使用共焦成像技术可能也是有用的，这种技术和装备的费用和复杂性是不成问题的。使用长波光源，无论进行或不进行光学滤波，也是增加信号/背景比的方法。使用特殊设计的样品室消除多余光，把非特定光传出系统，这是另一种有用的方法。通常的样品室设计是有用的，后面要给以描述。本发明一个或多个方面的所有变化用来提高信号/背景比，并且还用来对样品一种或多种分析物的更专门更灵敏的探测。
DLASLPD照明和探测方法有很多不同的方法能够专门地应用于样品，并且这些在图15中给出轮廓图。图14给出一个图用来定位和描述在图15中表示的DLASLPD方法的轮廓图。本领域的技术人员将认识到，当使用某金属样颗粒探测在固相或类似的样品中一种或多种分析物时，本方法所提供的用途。
现在来描述本方法的细节。照明和光聚集光学1．基本原理现在我们描述的固相方法能够应用于光散射颗粒的测量。一种或多种光散射特性的探测和测量与样品中一种或多种分析物的存在与否和浓度有关。这些方法能适用于大多数，虽不是所有已知的固相分析方法，包括微阵列，阵列芯片，或类似的格式。这方法设计得具有宽范围的灵敏度(从低灵敏度到特高灵敏度范围)。这个灵敏度范围，用易于使用，便宜的设备就可实现。
在这项技术中，表面上颗粒的数目或相对数目通过依靠颗粒光散射特性的方法来决定。探测系统基本上包括(1)一放大透镜(也称作成像或聚光透镜)以形成光散射颗粒斑点或其一部分的放大图像，和(2)一照明系统，使得颗粒作为黑暗背景中的明亮物体出现(DLASLPD方法)。此方法不需聚光透镜也能进行。放大图象中的颗粒数目，用颗粒计数或测量散射光强度(正比于颗粒数目或浓度)便可得到数值颗粒计数可以通过(a)眼睛(不借助或借助目镜，依赖于颗粒大小)，(b)一电子成像系统(例如摄像机、CCD照像机，图象放大器)或(c)具有场限制光栏和扫描光束设计的光敏探测器来实现。散射光强度可用电子成像系统或光敏探测器来测量。表面上颗粒浓度低时(低于每μ20.1个颗粒)，颗粒计数方法优选，而表面上颗粒浓度高时(特别是，单一颗粒接近于放大透镜的空间分辨能力)，可靠的光散射强度方法优选。本技术被设计能很容易在两种探测方法之间切换，并且能够使用直径小于20nm的颗粒，这依赖于颗粒的光散射能力和探测装置的专用硬件部件。光照明系统照明系统是本技术中的关键部分。照明系统被设计为以高光强度照明颗粒点或颗粒点组，这种方式就是让单一颗粒以黑暗背景中明亮物体出现。这使得依附在表面或在表面上流体膜中游离的颗粒可以看见。游离颗粒区别于结合颗粒，是由于游离颗粒作布朗运动，结合颗粒不作。在下面的部分中，我们描述照明系统的细节和必然关系。
申请人已经实验过很多不同的照明系统，包括昂贵的商品暗场照明装置，这叫超聚光镜(Zeiss)。照明的两种基本方法和这两种方法的几种样式能够利用。这些方法比，如超聚光镜更简单，并且似乎能产生更高的照明光强度。基本照明方法的一般描述照明系统被设计为(1)传输一束高强度光到一光散射颗粒点(或点组)和(2)使直接进入探测系统或反射的照明光的数量最小。这通过限制光束和它的反射束到某角度，使其在探测系统的光收集角度以外。在一种照明方法中，聚光透镜和光源位于固相表面的相对的两边(从下面照明)，在另一方法中，照明光源和放大透镜位于表面的同侧。从放大透镜下面直接照明图1表示所用一种基本照明方法的示意图。在这种方法中，光从表面下面照射到固相表面S上。假设S是透明的(尽管它可能有点颜色)。O是表面上含有光散射颗粒的区域。放大或光聚焦透镜L位于S上面。L收集光的角度表示为带阴影的锥形C(透镜L光收集锥)，其有在表面S上有一顶点(光散射颗粒位于其上)和由透镜直径D决定的底面积。照明光束(LB)成一定角度使得其不会进入L的光收集锥中。箭头表示LB的传播方向。
固相可以是，如显微镜玻片，微量滴定板或在临床诊断中使用的其他透明固相。光源可以是任何种类的光源，如阴极灯，放电管，发光二极管，激光等。使用光导纤维和聚光透镜把照明光束收集起来，然后用聚光镜聚焦在散射光颗粒上。光束与表面S的平均夹角θ被调整，以致于光束不会进入透镜L，这正如上面所解释。通过放大透镜或目镜观察光散射颗粒，角度θ很容易被调节，调节角度使得颗粒表现为黑暗背景中的明亮物体。既使在颗粒浓度高时，对光散射强度测量，这个角度也有好处，聚焦并不是必需的。
角度θ的大小可以从放大透镜的数值孔径求出。对于超灵敏探测，显微镜物镜用作放大或成像透镜。显微镜物镜的数值孔径通常刻在其机架上。可以按照图2中图示来定义数值孔径。这个数值代表一聚焦在O上的光散射颗粒点的放大透镜(焦距f)。透镜与O之间的距离等于f。透镜(L)收集所有从O散射的光，进入立体锥，其底面是棱镜的直径D。角度θH定义为此立体锥的角的一半。此锥的数值孔径(N.A.)与θH存在如下关系，其表达式为N.A.=nSin(θH)(36)其中n是透镜和点O之间介质的折射率。介质可以是，例如空气(n=1)，水(n=1.33)或浸没油(n=1.5)。对于很小的θH,N.A.近似等于D/2f,D是透镜的直径，f为焦距。
下面的表给出了常用物镜(n=1)的数值孔径和θH的典型数值。
放大倍数N.A.θH(以度表示)×100.25 14.47×200.5 30×400.65 40.54×630.85 58.2如已经提到的那样，激发光束必须成一定角度，使得光束在放大透镜的光收集立体锥之外。对于高放大倍数，激发光束投射到固相表面的角度必须大。例如，对×40的物镜，入射角必须比40°大。因为表面反射的光随着入射角增加，我们必须考虑，必须在我们照明系统中使用的角度是否会导致由反射引起的大量损失。而且，我必须考虑临界反射(全内部反射)是否在大入射角之中。下面简洁地讨论了折射和反射的基本规律，它用在随后的关于此照明系统中反射的影响的讨论中。斯涅耳折射定律我们根据图3来描述斯涅耳折射定律，此图表示，一光束沿折射率为ni(i代表入射光介质)的介质传播，照射在折射率为nt(t代表透射光介质)介质表面S上。入射光的一部分透射入介质t(折射光束)，一部分被反射回介质i中(反射光束)。如果入射角是θi，那么反射角可由斯涅耳定律给出，写作niSin(θi)=ntSin(θt)如果ni＜nt，那么θi＜θt，如果ni＞nt，那么θi＞θt，注意角度是相对于垂直表面S的垂线测量的。反射光的角度θr＜θi(也就是说，入射角等于反射角)。反射定律在表面反射的部分入射光被反射的不同入射角θi的入射光强度的比值R能够用菲涅耳反射方程计算出来。(应当指出，强度这里定义为单位时间单位面积的能量，强度也叫辐照度)。然而，为了简化，我们按照R和θi的关系图给出我们的讨论。实际上，R与θi的依赖关系决定于ni和nt的值以及入射光的偏振态。关于反射率的重要事实如下。ⅰ．光束从低折射率介质传入高折射率介质情况时的反射率(ni＜nt)图4表明了R对θi(ω=θi)的关系图，此时ni=1(空气)，nt=1.5(后者接近玻璃或塑料的折射率)，并且针对平行于(rp)入射平面和垂直于(rs)入射平面的光。入射平面定义为包含入射光束和垂直于表面的垂线的平面(看图3)。非偏振光的反射率R由平行于和垂直于入射平面的偏振光的曲线取平均给出。在图4中，非偏振光的反射率曲线标志为Ord(普物光)。图4的曲线表明a．rs随ω增加而连续的增加(图3中的ω与这里使用的θi一样)。直到大约70°时，rs的增长是缓慢(反射率仅仅约为15％)，而后增加的很快，在90°时达到100％。这样，在入射角达到60°以前，被反射的光的比值低于20％。
b．rp随ω增加而减小，到约57°时rp为零。rp=0时的角称为布儒斯特角或起偏角。布儒斯特(Brewster)角由表达式Tan(θb)=nt(38)算得，这假设ni=1(空气)。对于nt=1.5，从上面的方程得出θb=56.3°。应当指出，在布儒斯特角时，θi+θt=90°。因此对于nt=1.5，θi=θb=56.3°,θt=33.7°。对比布儒斯特角大的角，rp随ω增加，而增加很快，在90°达到100％。
c．对于非偏振光(普通光)，反射率随ω增加在达到约70°之前增加缓慢，然后增加很快，在90°时达到100％。θi＜70°时，低于20％的入射光被反射。
d．应当指出，反射光和透射光的强度加起来并不等于入射光的强度。这似乎违背了能量守恒定律。这表面上的违背实际上是由于把单位时间单位面积的能量作为强度的定义而引起。因为折射，入射光和透射光并不具有相同的截面。如果考虑到截面的不同，那么就可看出，单位时间反射光和透射光的能量加起来等于单位时间入射光的能量。ⅱ．光束从高折射率介质传到低折射率介质情况下的反射率(ni＞nt)图5表示ni=1.54和nt=1时，偏振光的反射率对入射光的角度(ω=θi)的关系图。此图与对于ni＜nt时图4相比非常不同。最明显的不同是入射光角度大于约41°时，全部光都被反射(100％反射或全反射)。内部全反射发生时的最小入射角称为临界反射角θc。这角的数值依靠于ni和nt的值。从ni和nt的值计算θc的表达式可以由考虑临界角时入射光和透射光的角度得出。在临界角θc，反射光中包含大多数入射光，得到相对于垂线于表面的直线的角θc，正如针对特殊反射，定律所要求的。透射光强度很低，相对于垂线的角θt为90°。这就是说，透射光平行于表面。因此，我们代入θt=90°到斯涅耳方程中，便能得到θc的值。代入后得出ntSin(90°)=niSin(θc)(39)因为Sin(90°)=1，我们可写出Sin(θc)=ni/nt(40)对nt=1.54和ni=1(空气)，上面的方程给出θc=40.5°。应当指出，对于非偏振光和垂直于或平行于入射平面的偏振光，临界角是一样的。这就是说，θc与光是非偏振的还是平面偏振的无关。ⅲ．反射和折射对光照射光散射颗粒的影响首先，我们考虑简单情形，颗粒位于空气中干燥的载玻片的表面上。这就是说，颗粒是干燥的，空气是载玻片两边的介质。图6示出了该情形中的反射和折射的草图。一次反射发生在表面S1(ni＜nc,ni=1和nt=1.5)。图4表明入射角增至70°时反射光所占比例低于20％。因此，用此方法照射S1面上的反射不会有问题。S2面会出现问题，因为光束从低折射率通过到达高折射率，在此表面上有可能存在全内反射。当ni=1.5,nt=1(空气)时，表面上的全内反射临界角约为42°(用方程(40)计算)。现在的问题是当表面1的入射光束角度很大时，S2面上是否能达到这一临界角。
图7为由斯涅耳方程(37)计算出的θi2[θtj])随θi1的变化图，运用了θt1=θi2。如图所示，θi2随θi1增加急剧增加，直至θi1增加至约θi1=70°时。以后θi2的增加平缓，直至θi1=90°也未到达临界角。但是θi1=90°时，没有光通过S1。所以我们断定，对于图4的排列来说，临界照射不可能得到任何实际的角度θi1。进一步讲，θi1的值小于约70°时，反射并不能明显减少照射到S2面上颗粒的光通量。
我们已经在实验上证实了上述结论。但是在我们的实验中，我们已经发现由表面S1和S2上的污迹、灰尘、划痕及其它缺陷或人为破坏痕迹散射的光(非特异性光散射)可以和S2面上的颗粒散射的光相比拟，因此，背景光大大增强，从而降低了颗粒探测灵敏度。S1和S2面上由人为破坏引起的非特异性散射光集中在照射光来的正方向上，而由颗粒(对于小颗粒)的散射光分布在所有方向上。图8说明了这一结果。
图8中，在任意方向Q，表面人为破坏的非特异性散射光的强度由从原点O延伸到强度包络面上的线段(夹角为Q)的长度给定，颗粒的散射光表示为从原点O向外射向各个方向的虚线。在实验上用表面上载有60nm的金颗粒的载玻片说明非特异性散射对探测特异性散射的影响。在空气中，这些颗粒散射绿光，在没有非特异性光散射时，一团被照射的颗粒在黑色背景上呈现出一个绿球。表面人为破坏散射白光，当此类非特异性散射叠加到特异性颗粒光散射上时，颗粒散射的光为浅白色而不是纯绿色。如图8所示，通过在不同角度θv方向上，用眼睛观看散射光，表面人为破坏的择优前散射效应可以被观察到。当人眼在θv=0时，散射光为浅绿色。随着观察角θv的增加，白色减弱，当θv增至30°时，只见到金颗粒的纯绿色光。因此，本发明中，在角度θv大于30°方向上，用眼睛观察或用光探测器具探测是有用的。在后面我们会看到，用光导如棱镜装置照明能进一步减少非特异性散射。
下面我们考虑的是水薄膜中的光散射颗粒，水薄膜在载玻上，用盖玻片盖上，见图9。照明光束遇到四个表面，即S1(空气对玻璃)、S2(玻璃对水)、S3(水对玻璃)、S4(玻璃对空气)，表面处折射率发生变化。象前几节一样，考虑每个表面的反射和折射可得到这样的结论。图9系统中，反射并未明显减小传输光散射颗粒的光能，在任何表面处都未出现临界反射。如图8的情况，表面S1和S4上的人为破坏，出现了非特异性光散射。但是，水的出现大大减少了表面S2和S3上的非特异性光散射。从放大透镜的同侧直接照明这种照明方法见图10。此处S、L、C和LB的意义与图2中的相同。激发光从上表面照射到表面S上。集光透镜也位于S之上。激发光束斜入射使得入射光和反射光都不能进入透镜L的集光锥面内。用这种方法照明，重要的是，使光路上不同面反射的光不被反射进入凸透镜或成像透镜L的集光锥面内。由于在每一面上反射角与入射角相同，可通过将照明光束限制在锥体C外面的角度内，来减小L对干扰反射光的收集。正如上一节所指出的，反射并不能明显减小输送给光散射颗粒的能量，以及在干燥和被水浸没的颗粒中不会发生临界反射。由表面破坏痕迹引起的非特异性光散射与上一节的讨论相同。通过棱镜装置的照明1．从下方照明图11给出了棱镜放置的草图。在一种最简单的结构中，包括有一个三角棱镜。三角棱镜之上安放有微滴定池、玻璃片、塑料上的微阵列或玻璃等，他们含有被测光散射颗粒。含有光散射颗粒的样品室或薄片位于棱镜的上表面之上，含有颗粒的表面位于透镜L的焦点上。浸没油抹在样品室或薄片和棱镜之间，以减少由折射率匹配引起的非特异性散射光。空气中颗粒是干燥的。如果S2面上的折射率匹配恰当或大致恰当，那么光束在S2面上就不会发生明显的折射和反射。因此，当一束照明光束横向照射到棱镜上和含有光散射颗粒的表面上，基本上以直线传播。但是在空气-棱镜的界面S1和在S3面上存在折射。这里考虑的是入射到棱镜的照明光束垂直于S1面(入射角为0°)以及假设棱镜是45°棱镜(角度γ=45°)。因光束从S1面到S3面上的O点是以直线传播的，光束是以45°角照射到表面S1上。由于玻璃对空气的临界约为42°，因此光束会发生全内反射。因此，与没有棱镜从下方照明(见图6)相反，棱镜装置可发生临界反射。回顾一下，没有棱镜(图6)，正如图6所示(也可见图7)的S1面上的光折射，不可能出现临界反射。为了利用如棱镜这样的光导传输高能量的光束，照明光束必须有方向性，要求光束以小于42°的角度入射到S3面上(图11)。现在的问题是不是在S3面上入射角小于42°就能满足从S3面上出射的光一定在透镜的收集锥面之外这样的条件。假设S3面上的光入射角为35°，由斯涅耳定律(所有ni=1.5和nt=1)我们可计算出射角为62°，在大多数所需物镜收集锥面之外，如×40的物镜θH=41°。我们可以得到这样的结论图11的棱镜装置维持一个黑背景时，可以向空气中干燥的光散射颗粒输送高的光能。
我们现在考虑图11的棱镜装置，其中用水和盖玻片包被在光散射颗粒上。正如前面所描述的，激发光束沿直线从S1传播到O，在O点遇到玻璃-水界面。然后，光束穿过水和盖玻片，最后至盖玻片的上表面遇到玻璃-空气界面。考虑玻璃-水和玻璃空气界面上的反射是有意义的。空气-水界面上临界反射角度等于62.5°(在方程(40)中用ni=1.5和nt=1.33)。因此，表面S3上水的引入，使得不发生全内反射的照明角比在空气中要大得多。此外，小于62.5°角度时，玻璃-水界面的反射低。现在我们考虑盖玻片-空气界面上的。反射考虑一束垂直入射表面S1上的光。如棱镜是45°棱镜，那么光束以45°角入射到S3上，发生全内反射。S3面(玻璃对水)上的折射将光束的角度改为55°。但是，水-盖玻片界面的折射使光束折回到45°。所以光束以45°角照射到盖玻片和空气的界面上。因此，颗粒在水中和在盖玻片内的棱镜装置，可将光能有效输送到光散射颗粒(附着在表面S3或游离在水中)，但在盖玻片上入射光被全反射。
从以上讨论我们可归纳出，反射并没有严重影响光能输送到水薄膜中的光散射颗粒。在盖玻片-空气界面上确实发生全反射，但此反射并不影响入射光能量输送到散射颗粒上。
以上讨论很明显，有棱镜的装置和没有棱镜的装置都可通过倾斜照明附着在表面的颗粒或悬浮在溶液中的颗粒而有效地输送光能量。我们所说的有效输送意即在任何有关的表面上不会发生全内反射以及非特异性散射被降至最小。但是，实验上，我们发现在某些实际应用中用棱镜装置可以得到最佳的探测能力，因为棱镜装置可以消除或大大减小不规则缺陷引起的光散射干扰，此不规则缺陷来自于靠近光散射颗粒的玻璃表面或塑料面上。浸没油被用于耦合固体和棱镜，可消除几乎全部S2面(图11)上不规则缺陷引起的非特异性光散射，这些效应看起来是缘于折射率的匹配机制。在S1面上的光束入射点的非特异性光散射可以从O点的特异性散射颗粒中移到远处(假如棱镜足够大)，因而对放大透镜收集的散射光没有贡献。而且，如果特异性散射是在水中，由水膜匹配的折射率大大减小S3面上的非特异性散射。并且，水和盖玻片的出现，在其界面处照明光束发生全反射。这一反射大大减弱了盖玻片-空气界面上的不规则缺陷引起的非特异性散射，因为只有少部分的光能到达此表面上的不规则缺陷。另外，全内反射减弱或消除了照明光能直接进入放大透镜的光收集锥面内的可能性。应注意全内反射也可影响透镜L的收集角，因为入射到盖玻片-空气界面上角度42°的颗粒散射光被全反射。但这一效应并不严重。显微观察上一节，我们着重于几个因素(反射和折射)讨论了照明和探测(放大透镜)系统，在减小收集非特异性散射光的同时，这些因素决定着将光能有效地输送给光散射颗粒(附着在表面上或正好悬浮在表面之上)。在这一节中，我们给出一些通过目镜进行肉眼观察的实验细节，其中放大透镜L给出所观察的放大像。a．光源和光纤的细节我们已经使用过如下三个不同类型的光源。ⅰ．莱卡(1eica)显微镜照明器这是一种标准的，商业化的显微镜照明器。它用的是一只钨丝灯泡和一组透镜。这组透镜在距离照明器的端部22mm处成一个5×7mm的灯丝聚焦像。为了得到一束聚焦好的光束，我们在显微镜上安装了一只10倍的物镜。这一透镜距离照明器的端部约6.5cm。在距物镜约7mm处得到一个直径大约4～5mm的聚焦光斑。ⅱ．Bausch和Lomb Fiber Lite照明器这也是一种商业化的照明器。它有一只150瓦的钨丝灯泡。安装在一个抛物反光镜上。反光镜产生一束直径约25mm几乎平行的光束。一根直径11mm的光学光导(由许多捆在一起的细光纤组成)靠近钨丝灯泡。将这根光学光导分成两根相同的光导，每一根的直径约5.3mm，长度约为2英尺。我们用其中一根。为了得到一个聚焦光斑，我们在光纤的一端约25mm处放置一只25mm焦距的透镜(20mm直径)，用来准直从光纤出射的光。然后，在离准直透镜50mm处放一只×10的物镜，将准直后光聚焦成一个5mm直径的光斑。准直透镜和物镜安装在一个与光纤紧固的小型(compact)支架上。光纤的可弯曲性使这一类型的光源系统比固定的莱卡(leica)显微镜照明器更易于使用。ⅲ．自制照明器(Custom Illuminator)这是我们制造的照明器，它有一只12V,28W钨丝灯泡，安装在一个抛物型反光镜上。反光镜反射一束几乎平行的光束，此平行光束经聚焦进入一根直径为0.125英寸的光导。光导长为36英寸。反射器反射的光被聚焦在带有一个透镜(焦长23mm，直径9mm)的光纤上，光纤靠近灯。光导的数值孔径为0.55，接收光锥体的平面半角为60°。和一个焦长为12mm的透镜(直径为11mm)准直由光导的另一端出射的光，透镜放在离光纤端部17mm处。最后，准直光由一个×10的物镜聚焦成一个直径为5mm的亮斑。物镜放置在离准直透镜约26mm的地方。5mm的亮斑位于离聚焦透镜12mm处。b．棱镜(光导)图12给出了一些象棱镜这样的光导，我们发现这些光导对我们的照明系统有用。有些并不是传统意义上的真实棱镜。应称作光导器或光导。当与入射光面相对的面上反射出反射光时，光导能以某一角度有效地传送光。因下列原因，光导的尺寸一定可以减至最小。由于表面不规则缺陷，入射光和反射光的光斑能产生明显的非特异性散射。必须从特异性光散射颗粒中充分除去这些光斑，将非特异性散射的贡献降至最小。光导与样品室在制在一个片上，因此为消除这一个足可以将浸没油抹在光导和分析片之间。我们已经制出了样机，如将一个小光导粘在塑料池的底部，塑料池里有链霉抗生物素蛋白点(Streptavidin Spots)微阵列，铺在样品室的内表面。用这一台样机对结合在微阵列上的各个独立小点上的光散射颗粒，进行探测和测量，实质上与我们用颗粒计数的测量和用样品室放置在棱镜上的强度测量相同，上述强度测量中样品室和棱镜两表面间抹有浸没油。c．显微观察用目镜来肉眼显微观察，我们已经评价几种照明装置，特别着重于颗粒的亮度、背景的暗度及在不同类型的临床检定方式中的应用。我们已经找到了可得到好结果的几种装置。这里我们限于讨论最易于使用、最便宜、能给出最佳结果的照明装置之一。我们所指的最佳结果就是指用×10和×40的物镜作为放大镜在黑暗背景上的明亮颗粒。
成像系统是一台Edmund Scientific的价格低廉的显微镜。这台显微镜由一个物镜(×10或×40)和一个目镜组成，目镜在一个标准的160mm的镜筒内。使用显微镜的原因，是为细/粗调节显微镜的焦距提供方便，而不是仅仅简化物镜和目镜。但是，我们已经改装了显微镜的平台，使之能适用于我们的照明方法，如图12(d)所示，已经用光导(棱镜)替换了显微镜的聚焦透镜。棱镜下方的镜筒(cylinder)安装在聚焦透镜支架里。改装后的显微镜平台和照明器使得用载玻片、微滴定池和其它塑料池测量成为可能。但是，×40的物镜不能用于厚塑料池，因为此物镜的工作距离小(约0.45mm)，而×40的物镜工作距离较长可以使用。用自制照明器照明。
为了要建立DLASLPD显微系统，在显微镜的平台上放置一块含有悬浮或结合金颗粒(用盖玻片盖住水薄膜，其中有60nm的金颗粒)的载玻片。安装棱镜使其表面几乎与载玻片接触。载玻片和棱镜表面用浸没油连接。安装照明系统中的×10聚焦物镜，使其几乎与被光照射的棱镜的边相接触。物镜倾斜成一定角度，使得光垂直入射到照射面上，以45°角照射表面S(与载玻片接触的表面)。如载玻片上的金颗粒膜有足够高的颗粒浓度(约6×109颗粒/ml或更高)，光穿过颗粒膜时的光斑，由于颗粒的光散射，呈现强黄绿色。调整×10照明物镜的位置和倾斜角，在黑暗的背景上产生明亮的物像。重复上述调整，同样调整显微镜中×40的物镜。对于×10和×40倍的物镜，在黑背景上成出明亮的像，其物镜位置的变化范围窄。
应该注意的是当照明光束以高于42°(在塑料或玻璃-空气界面上全内反射的临界角)的角照射到棱镜表面上时，没有照明光传播到载玻片上方的空气隙中。这可以在载玻片上方放一张白纸来验证。但是，用肉眼观察照明光束，检测其形状或空间断面是有意义。进行这一观测可以在载玻片的上部放一块若丹明塑料块，用浸没油连接。若丹明块是透明的塑料块，含有荧光分子若丹明。光束在若丹明块中传播可以从产生的若丹明荧光中观察。浸没油消除空气气隙，使照明光束进入此塑料块。如图13中所示，通过塑料块的内侧的荧光可以观看到照明光束的断面形状。
一旦照明系统被调整好，在载玻片、塑料池以及固体微阵列或阵列芯片上，可观察到大于约30nm的金颗粒。×10的物镜可以观察到颗粒的密度小于每平方微米0.005个颗粒。×10物镜的工作距离约8.5mm，因此，能适用于8mm厚的塑料片。DLASLPD视频相差的提高方法我们确信运用此方法DLASLPD视频相差提高法，样品中的金属样颗粒和非金属样颗粒可探测到更高的灵敏度。这种方法是调节电子像的非特异性光背景，因此要使各个颗粒都能被观察到，实质上就是从像场中消除非特异性光背景。与本文中所述的其它方法相比这种方法很好，用这种方法我们已经观察到改进后的特异性和灵敏度结果。样品室的改进我们积极承担了本发明中某些工作，本着易于使用，适用于不同的测试环境和条件的原则，现对本发明作进一步改进。样品室是用于导入样品和检测分析物的，我们已经发现本发明中几方面的工作在样品室的设计方面得到了具体体现。
例如，我们在观察和推理的基础上，将我们的原理应用到样品室的一般性设计中，样品室为装载被分析样品的容器。这些改进能有利于易于使用以及应用到以上简述的测试类型和测试条件中。但是应该说明，没有运用下列样品室的改进，本文所述发明同样能很好地实施。这些改进是为了增加本发明实际应用于特异性测试条件和环境中去，这些条件和环境在本文其它地方叙述。
我们已经发现将表面S1(入射光表面)从含有待测颗粒的区域内移出尽可能远的地方，可以明显提高信噪比。前面，我们已经描述了诸如棱镜或类似于光学光导的准直器具的应用，准直器具有助于将照明光束定向传输到表面S1上。通常人们用浸没油抹在光导(棱镜等)和样品室的表面之间。在分析测试中，多数情况可能不倾向于用浸没油作为一种实验分析的器材。正如前面所叙述的，我们决定通过增加颗粒附着或接近的表面厚度来大大降低非特异性光的水平。
我们已经将本专利发明或其它方面的专利发明应用到样品室的设计中，来探测样品中的一种或多种分析物。这些通常的样品室设计草图见图17、18和19。图17的一个样品室侧面是斜截平台侧面。斜截平台侧面的角度与照明角相近，这样照明光束以尽可能接近0度(相对于垂直方向)的角度入射到斜截侧面上。这种方法中，非特异性反射和散射被降至最小。图18所示的样品室侧面是弯曲型面，而不是图17中的斜截平台侧面。此样品室中，出射光发散，曲面可更有效地消除这种非特异性光。图19所示的样品室运用两种思想，将光束入射到样品上的入射面从待测区域中进一步分开；曲面可更有效地除去非特异性散射光。因此，这种样品室增加了室底表面以下物质的厚度，室底表平面以下的斜截平面用于照明，样品室底部表平面以上的曲面可有效地去除非特异性光，图17、18和19所示的样品室不仅对溶液样品测量有用，而且对测量不可移动样品也有用。本发明应用于分析诊断化验-装置类型和测试试剂盒(Test kits)众所周知本领域中分析物类型范围宽。这些分析物存在于不同样品环境中，如水、尿、血液、痰、组织、土壤、空气等。根据分析化验颗粒类型的需要，人们可以获取到所感兴趣分析物的半定量或定量，或两者的信息。在一些情况下，用小型的、价格低廉的、便携的仪器进行分析是最理想的。例如，消费者使用、野外(远离实验室)使用、或医院临床护理。人们希望能快速对有疑问分析物进行半定量和/或定量测量。在其它应用中，对于小型实验室里分析物检测，一天只检测少许几个样，最理想的是用小型、便宜的仪器，就能得到定量结果。例如，医生的办公室、小诊所、辅助测试实验室、研究实验室等。也有一些情况，人们想要一天测试几百个到几千个样，诸如大批量的测试。因此，上述每一种测试情况和环境都需要不同类型的仪器设备。一旦检测样品中的分析物的准确需要完全确定下来后，才能仔细考虑这台仪器是否易于使用和仪器的价格方面优缺点。
我们已经决定对于上述测试环境和应用，随着DLASLPD探测方法的某些变化，某些金属样颗粒的使用应考虑特异性试剂盒和仪器的发展。对于分析物、测试环境、样品类型、检测方式、分析物检测需要和仪器价格、尺寸大小的需要有多种不同的结合。一般本领域的技术人员将会认识到本发明的巨大作用，其中现发明应用会以一种方式或另一种方式导致仪器易于使用、价格便宜、以及试剂盒能满足大多数分析物或诊断测试的需要。
DLASLPD方法，颗粒类型和样品类型形成多种不同的排列与组合，组合在一起使用能获得特异性分析物的检测能力。在任何特异性诊断化验应用中，样品类型、照明方法、检测方法通常是固定的，例如象化验方式、样品室类型和检测仪器。金属样颗粒有独特的光散射特性，随着颗粒的大小、形状、组合物和均匀性变化，其光散射特性发生变化。探测和/或测量颗粒的光散射特异性，是根据上文所述的颗粒特性及用于探测测量散射光特性的仪器设备和方法来进行的。因此，现发明在某方面的最大实际应用就是将各种照明、探测器具、样品类型与光散射颗粒的合适类型结合起来。其结果产生特异性仪器设备和试剂盒。
在许多不同组合中，通过运用各种颗粒类型、检测方式和仪器设备，本领域的技术人员能实际运用本发明许多不同方面的成果以获得许多结果诊断分析探测能力。图22画出了本发明各种不同方面的方框图，当特异性结合形成后，本发明提供了仪器设备和试剂盒，以适合特异性诊断分析测试的需要。最终仪器和试剂盒的构成是通过选择方法学/设备类型组合(图23)和颗粒类型组合(图24)的合适模块单元(component)。图23表明，本领域的技术人员可选择照明光源，方法和其它仪器配件，检测化验类型和样品类型，以及探测方法和仪器配件。图24表明，本领域的技术人员可选择合适的颗粒组合物、形状、大小和均匀性，来探测颗粒理想的光散射特性。图23和24概括的流程以及图22总结的流程导致生产出了特异性仪器和试剂盒。方框图25示出了普通检测方法中的一种，为满足特殊诊断的测试需要，我们运用这种方法开发出了特异性仪器和试剂盒。本领域的技术人员无需运用图25中的方法，就能在某一方面运用本发明。
正如本文所述的，将金属样颗粒与照明和探测DLASLPD方法结合起来，其显著信号的产生和探测能力可拓宽分析物探测灵敏度范围。借助于测试环境的一般类型和上述简图22-25，本领域的技术人员容易研制出仪器和试剂盒，其中在一些诊断测试应用中，人们只需用裸眼就可探测和/或测试，而在其它情况下，用的是简单的光源，诸如LED(发光二极管)或低功率钨丝灯泡，用光电二极管或光电二极管阵列来探测和/或测量信号。在其它分析测试应用中，用激光器、激光二极管、钨丝灯泡等作光源，配带有照相机、摄像机或其它CCD器件(电荷耦合器件)成像，利用简单的图像处理装置，微阵列模式或其它任何模式的颗粒散射出的光能被观察和测量到。这些实施例并不意味着限制而是一般地展示了本发明的多功能性，将本发明的应用拓宽到探测样品中一种或多种感兴趣的分析物。
例如，一台小型手持便携式仪器，所用光源为低功率灯泡，LED或激光二极管，它能检测样品中一种或多种分析物。光电二极管或光电二极管阵列用作探测器。依据所需探测灵敏度，用一定类型的金属样颗粒，使用该仪器就能满足分析物探测的需要，试剂盒是为液相或固相样品中的多分析物或者单一分析物而设计的。例如对于液相样品，利用不同颗粒类型都有不同的易可探测的散射光特性。在固相样品和模块如微阵列中，一种颗粒类型可用于所有不同分析物，或者可以应用颗粒类型的各种结合体(依赖于样品中不同分析物的浓度)。
在另一实施例中，按如下列方式设计了一台便宜仪器和一个试剂盒，能测到很低的浓度。用低功率或高功率光源、配备光电倍增管、光电二极管或摄像机，用一只透镜收集从含有颗粒表面散射出的散射光。用微处理器或外部台式计算机收集并分析散射光数据。多分析物固相分析的试剂盒是由适当的颗粒类型制得的，它包括有合适的微阵列样品室，能得到所需的浓度范围和探测限。这种类型的仪器和试剂盒可用于科研实验室、医生办公室、卫星站所、环境测试实验室和大批量测试实验室。
上述仪器和试剂盒的实施例是为说明解释而举的例证，不应理解为本发明仅有的应用。本领域的技术人员将会看到本发明广阔的用途。通过应用本发明中一项或多项成果来满足特异性分析物测量的需要，本领域的技术人员将会认识到所制造出的仪器和试剂盒使用测量范围宽。涉及分析物与特异性分析物识别试剂相互作用的两个或多个颗粒结合或聚集的分析在本领域中，已知通过运用合适的结合剂以及合适结合剂、分析物浓度、结合、聚集、交联、结成网络(networking)以及类似的结合方式就会出现，运用这些结合方式可以探测样品中一种或多种分析物。在一些免疫化验中，如抗原特殊和多价态，凝集或结块(clumped)颗粒就会形成，与此同时，如抗原是可溶和多价态，能看见形成沉淀。在一些核酸检测中，一种特异单链探针能“交联”两个或多个单链靶和使网络扩大。另外，两个或多个不同单价态单链核酸探针能用于结合相同靶单链核酸上的不同位点。此研究中，可实现两个或多个靶交联，或可以利用正好有两个单价态的探针，用结合于相同靶上的序列来进行探测。
本发明比以前可能有的发明更能易于使用、更灵敏、更多的分析物探测功能。在特异性检测方式中，本发明中的亚显微颗粒可形成不同类型的聚集物，无需从分析物结合颗粒中分离成游离态，就可用显微镜或通过肉眼看到或通过仪器测量观测到这些亚显微颗粒形成的聚集物。该类型的聚集物形成依赖于交联剂及其价态，依赖于附着到颗粒上的结合剂类型。聚集物包括两个颗粒到多个颗粒。
用于均匀、液相、聚集检测中的颗粒被直接或间接作了标记。在直接标记检测中，能直接结合分析物的试剂被附着到信号发生颗粒上。例如，在一项直接标记核酸分析物检测中，DNA探针被粘附到光散射颗粒上。在一项间接检测中，分析物探测剂用光学基团A来标记，因而颗粒用能识别的组合物A作了标记或被包被起来。用直接或间接标记，一项检测就被格式化了，以致于分析物的已知结合剂与分析物相互作用(在间接标记的情况中用基团A)导致形成颗粒聚集。聚集物包含有两个或多个颗粒。
我们已经发现，如果一项测试中的聚集或交联剂尺寸小，以致于聚集物中的颗粒间靠得极近，那么在显微镜下含有两个或至多几个颗粒的聚集物外观表现为一个单颗粒(亚显微颗粒)。但是，由于颗粒--颗粒的微扰，与非聚合颗粒相比这种亚显微颗粒表现出不同的光散射特性。我们已经观察到散射光颜色、强度RIFSLIW、偏振的变化依赖于颗粒的基团、大小和形状。这些变化能用于测量分析物的量，无需从结合颗粒分析物中分离成游离态。在显微镜下，这些变化能用于区分亚显微聚集和非聚集颗粒，即使两者在显微镜下外观可能表现为单颗粒，如聚集或交联剂的尺寸很大，如长DNA链，聚集物中颗粒间的距离大于显微镜的分辨，那么就能分别观察到聚合物中的颗粒，通过聚集颗粒和非聚集颗粒靠在一起或移动到一起，还能将他们识别出来。当聚集物中的颗粒少到只有两个时已能在显微镜下观察到这些显微聚集物。如果两颗粒间的距离足够大，以致于颗粒-颗粒间的微扰小，那么聚集物中的颗粒保持原来的光散射特性。以上讨论的两种普通的情况中颗粒--颗粒间也有分立距离，在一些特殊情况中，我们已观察到亚显微聚集物中的颗粒大概不会对其光散射特性产生扰动，因为这些颗粒没有靠得足够近，颗粒-颗粒间未出现微扰。尽管如此，仍可将聚集物从非聚集颗粒中区分出来，因为聚集物的强度是非聚集颗粒的几倍，这里n是一个聚集物中的颗粒数和/或相对于另外颗粒位置固定的颗粒数。
由以上讨论可见，如现有颗粒产生的聚集物与游离非聚集颗粒相比具有不同的光散射特性，那么在宏观测量和用眼睛观察基础上，已能进行液相、均匀检测。如果聚集物中颗粒--颗粒间的扰动小以致于聚集和游离颗粒的光散射特性类似，仍有可能利用眼睛观察或仪器测量分立颗粒和聚集物的光散射强度的方法来进行均匀检测。在能看见聚集物中分立颗粒的情况下，如上文所述通过肉眼观察或电子计算机化图像分析，容易将聚集物从游离颗粒中区分出来并定量化。由于聚集物比独立颗粒光强高，也能用流式细胞计或类似的仪器设备将聚集物从游离颗粒中区分出来并定量化。在用显微镜不能看到聚集物中各个独立颗粒，以及不存在颗粒-颗粒间扰动的情况下，通过游离颗粒和聚集物散射光强度的差异，以及由聚集物的散射光强度确定的聚集物中颗粒数的差异(假定强度是外加的)，能区分游离颗粒和聚集物。这可通过图像分析或流式细胞术来完成，图像分析或流式细胞术包括通过激光扫描或空间分析一个区域或样品整体的其它方法的成像处理。
随着亚显微聚集物中颗粒数目的增加，聚集物可被看成是一个扩大的颗粒或大颗粒，尽管通过显微镜还不能看到聚集物中分立的亚显微颗粒。在显微聚集物的情况中，聚集物中颗粒数目的增加产生了可见的网格，并且网格中颗粒能被数出来。大网格和颗粒聚集物产生用肉眼就能观察到的宏观条纹，并且形成沉淀物或凝集物。
本领域的技术人员将认识到前文所述的不同的聚集现象能被用来开发许多不同类型的均匀检测，其中有些检测用到显微镜或其它图像分析技术以及其它有关宏观观察或测量的技术。
以下选取几例说明如何操作均匀型检测或其它类型的检测。应用光散射颗粒的检测方式之例下面给出了几个有说明性的实施例说明了在不同检测方式中本发明宽广的通用性和广泛的应用。本领域的普通技术人员将会认识到此发明的许多方面，比以往可行的方法能更有特异性，更易操作，更高灵敏性探测到样品中一种或多种分析物。ⅰ．涉及通过以结合为基础的分子识别而进行的两个或多个颗粒的结合的分析方式一般性原理在一组实验中，用基底材料分子粘贴方法，将40nm直径金颗粒制品的表面生物素化。经离心和漂洗纯化后，我们滴一滴这样的物质到玻璃片上用一个盖片盖上，然后，借助于光学显微镜用光照明和探测DLASLPD方法对其观察。此物质为均匀性物质，其中颗粒为绿色，在布朗(Brownian)运动中运动很快。然后我们去掉盖片，在玻璃片上滴一滴链霉抗生物素蛋白溶液，再用盖片盖上，一段时间后，溶液中出现新的桔黄色，橙色和浅橙色颗粒结构，这些颗粒比绿色颗粒的光强要强得多，布朗运动的速度要慢得多。有些在溶液中旋转时，出现闪烁，表明这些颗粒结构为非对称性。一段时间后，许多绿色颗粒消失，而出现许多桔黄色和橙色颗粒聚集物。在显微镜下，当看到盖片的边缘时，上面包被有一层色彩非常鲜艳的橙色、桔黄色和浅橙色的颗粒聚集物。我们已经在均匀聚合物核酸系统中，观察到了类似的现象。这些观察表明在本发明的各个方法中，颗粒散射光特性的变化能被用于探测分子结合情况，此探测是通过减小“游离”单颗粒的数目，观察聚集物，或者在整个溶液中通过运用其它方法。例如，对于在溶液中或流体系统中探测，在适当条件下通过光照一部分溶液，具有独特散射光特性的新颗粒结构的数目增加和/或原始特性的颗粒数目减小，因而发现从溶液发出的散射光有变化。另外，通过以流动为基础的系统，样品中的物质能被更特异性地分析出来。例如，用微通道、毛细管或流式细胞术仪器或设备装置，对部分或全部样品溶液分析颗粒基底上的一个颗粒。溶液流经照明光源和探测器或者另一方法是溶液吸附到一个微通道或毛细管，然后沿样品长度方向移动样品容器，光源或探测器(或其中的一些组合)，分析所有或部分微通道或毛细管。
例如，某一核酸分析物是由约100个核酸碱基组成，并出现在样品中。制备此样品使得该核酸为单链形式。两个或多个独特单链“探针”核酸序列被添加到样品中，样品中这些不同的探针核酸结合到靶链的不同区域上。通过间接或直接标记方法，每一个这些探针核酸也已被吸附到一个或多个颗粒上。接着培养样品，将样品放入流式细胞仪或类似流体仪器设备中，对其中含有样品的溶液进行分析。如靶序列存在，就会出现结合在一起离得很近的两个或多个颗粒。依赖于颗粒间的分立距离，颗粒-颗粒间的扰动或许存在或许不存在。当探针链与靶链杂交后，用前述的适当方法，可探测含有两个或多个颗粒的这些分子结构。ⅱ．涉及分子本体释放的测量本发明中有几种检测方式的应用，通过分子、化学或其它方面，可用于探测分析物的存在。例如，分子内或分子间的成键，交连或其它分子结构的改变，使得整个分子几何结构发生变化，或者，此过程使得分子碎片(pieces)解体。例如，肽、蛋白、核酸或药物等通过应用本领域中已知的各种方法吸附到样品容器的表面上。在这些物质中有些有一个或多个分子内的交联或成键位置，通过化学、生物或其它处理方法，裂解或者改换这些位置。例如，通过监视由一种特异性酶或核酶的活动释放出的裂解产物的量，探测这种特异性酶或核酶的存在。一种光散射颗粒直接或间接粘附到分子衬底区域上，这样裂解过程受到的影响最小。溶液中游离颗粒的存在和数量，或者吸附在样品容器上或其它颗粒上的结合颗粒的减少量与酶存在、数量以及活性有关系。另一例中，用一种抗原物质包被光散射颗粒上并与抗体混合，这样通过抗体-抗原以一种多价态形式键合，所有的颗粒都结合在一起。这种网状或凝集物放在或如需要吸附到一个样品容器内。一个样品放入盛有分析物的容器内(分析物或许是相同的抗体或抗原或许是一种有些类似结构的对抗性抗体或抗原)。依赖于样品中抗原或抗体特异性分析物的存在和数量，抗体的某些部分和包被有抗原的颗粒通过竞争从网状结构中分离出来。通过测量溶液中的颗粒数量和/或残留在凝集网络上的颗粒数量，可探测分析物的量。通过在颗粒上包被抗体，或用其它结合剂例如核酸、肽、受体、药剂、激素等改变测量方法，改变后的方法也可应用。ⅲ．分子结合情况的探测和特征描述在另一个有说明性的实施例中，用包被有结合剂颗粒的布朗运动，在图像分析方式中，探测一种分析物的存在和数量。这种方法也能用来研究在一个结合对中分子结合情况和特性，这里结合对中的一方被吸附到颗粒上，另一方悬浮在溶液中。这种能力在表现抗体、抗原、药剂、受体和任何物质的结合特性方面是极其重要的，此处分子的结合特性是重要的。例如，一种40nm金颗粒的制备方法是使其表面含有或者抗原、药剂或者抗体。然后，在显微镜载玻片上放上这些结合颗粒物，用DLASLPD照明和探测方法在显微镜下观察，他们的布朗运动特性和定量化分析。然后，加进含有一种分析物的样品溶液，该分析物可与吸附在颗粒上的结合剂结合。假如添加的溶液含有结合剂中的配对体(partner)，它就会结合颗粒上的结合剂，观察到布朗运动中的变化。另一方面，为了表现应用性，在已知浓度附近，滴定入已知浓度，具有分子特性的物质，来确定此物质的结合特性。在这种测量中，能研究大多数任何分子已知结合对的分子结合情况。ⅳ．分析物的放大探测在某些分析检测和诊断检测中，优先选用的检测方法可增加颗粒散射光特性的探测能力，使得所需探测仪器非常简化或无需探测仪器。通过使用适当的分子识别结合对和颗粒，有可能明显增加探测灵敏度水平。可用单链均匀聚合物序列、亲合素、链霉抗生物素蛋白-生物素以及其它结合对系统“链接”和“组建”许多颗粒。例如，设计一个固相检测方案，其结构为一个三明治结构抗体-抗原-抗体。其中一个抗体被吸附到一种固相体上，使得可捕获到抗原分析物。然后再加上另一个含有生物素团的抗体。接着将包被有链霉抗生物素蛋白和游离生物素加入溶液中。从固相抗体-抗原-抗体生物素中，复合生长一种···链霉抗生物素蛋白颗粒--维生素--链霉抗生物素蛋白颗粒-···结构，其中包含有许多结合在一起的颗粒。这样的一种颗粒聚集物或网状结构产生一个高散射光强度水平，比单颗粒更易探测。另一个实施例用的是多聚脱氧腺苷酸(poly dA)和多聚脱氧胸苷酸(poly dT)或其它同聚物单链核酸，此处poly dA同聚物序列被掺合到单链“探针”分子的区域内。用与此同聚物互补的dT序列包被颗粒，将此颗粒添加到含有另一种“游离”dA单链物中，生成多颗粒结构。列举上述实施例是为了说明作用。本领域普通技术人员会认识到本发明工作的许多方面都依赖于分析物和诊断条件以及需求。改进后的颗粒结合剂的组成物质本领域中，众所周知，用吸附方法将诸如抗体那样的蛋白结合剂吸附到金属样颗粒和非金属样颗粒以及其它表面上(参见M.Horisberger，扫描电子显微术(1981),2,p.9-31)。(杂志名原文为ScanningElectron Microscopy)用这种吸附方法例如通过抗体分子，将具有结合特性的物质附着到颗粒上。就抗体而论，将抗体分子附着到颗粒上也使颗粒具有部分化学稳定性。如果仔细控制吸附条件，一些抗体分子仍会对其相应的抗原具有活性。在本领域中，应用合成聚合物和生物聚合物作为金属颗粒的化学稳定剂也是众所周知(参见Heller et al.(1960)，聚合物科学杂志(Journal of Polymer Science),47,p.203-217)。因此，此处所列的参考文献包括了这种方法，将物质附着到颗粒和其它表面上。
物质吸附到颗粒或其它表面上的准确的机理和特性不是很清楚。当抗体分子被吸附到颗粒或其它表面上时，被吸附抗体的密度和取向看起来与结合活性的水平有关。由于难以控制吸附过程，很可能许多结合抗体分子以这样一种方法被吸附，这样改变了分子结构的分子识别区域，以致于结合活性可能明显减小或者完全不具有活性。
提供的此吸附法可使得蛋白结合剂和其它物质附着到颗粒上。所述蛋白结合剂和其它物质在分析物测试中可能有用可能没有用。与此同时，附着某些类型的物质是困难的，此类物质在分析测试及其它领域可能是有意义的。例如，核酸、小蛋白质和类蛋白物质如肽，以及其它非蛋白物质如小分子量抗原物质、激素、药剂等，不能通过此吸附过程有效地附着到颗粒上。吸附技术更进一步的限制就是对于每一种类型的物质存在唯一的、必须仔细控制的吸附条件。甚至当严格按照这样的操作程序进行操作时，蛋白的量和吸附到表面上的物质的总量和结合特性也都会发生明显的变化。在许多情况下，与非吸附形式相比，被吸附结合剂的结合活性(亲和性和特异性)会明显减小。
我们用这种吸附方法，对附着在颗粒表面上的各种蛋白结合剂如抗体进行了实验。我们的实验表明结合剂的特性以及最终颗粒结合剂物质的稳定性有很大的可变性。被吸附抗体或其它结合剂的结合亲合势对标记条件有高的灵敏度，不同批次测量样品也有明显的变化。被吸附在颗粒上的抗体、亲合素、链霉抗生物素蛋白以及其它结合剂的结合活性都共同地明显减小。在一些样品制备中，表明被吸附结合物的一些碎片很可能是从颗粒中解离出来的。在分析或诊断测试中，当此解离物与分析物颗粒结合剂相竞争时，就提出了严重的问题。
如此难以控制附着过程，结合活性的不稳定性和通过吸附方法对附着在颗粒上的这类物质的限制的不稳定性提出了许多分析检测所用此物质的制取和使用方面的问题。或许最重要的是用吸附技术制备的颗粒结合剂的成对之物对许多分析应用可能没有足够的量，在许多分析应用中，探测的是很低浓度或超低浓度的分析物。
在本领域中，有一种方法，包含有大小和组分变化的结合剂的任何类型的物质可特异性地附着在颗粒或表面上，是大有用处的，在颗粒或表面上被结合物的结合活性所受影响被减至最小。在本领域中，获取到所需密度每一颗粒(或普通任何表面)上的结合剂，也大有用处。另外，对于这些方法理想的情况就是允许多种类型结合剂的结合。从制造和价格考虑，如果此合成工艺容易操作、费用低廉，以致于用相同的基本程序能广泛地将各种不同类型的物质附着在颗粒上，那是大有用处的。
我们已经开发出了新的方法，可将结合剂和大多数其它物质特异性地附着在金属样颗粒和其它表面。按此新方法制取的颗粒剂稳定性高，具有强结合亲合力，非特异性结合性小。这些新方法克服了以前本领域中吸附工艺的许多限制，另外收益之处就是吸附工艺易于操作，费用低廉。在一些实施方案中，这些新工艺设计了一个万能联结器(universal linker)化学平台(chemistry platform)，在此平台上用许多相同的材料和工艺，几乎任何类型的物质都能被快速、简单地被附着在颗粒或表面上。这对于每天都制取这样的颗粒结合剂组成物用于分析物的测试是极其重要的。
以下一些工艺技术适用于任何物质，包括结合剂或其它物质，例如抗原、抗体、外源凝集素，碳水化合物、生物素、亲合素、链霉抗生物素蛋白、核酸、肽和蛋白质、受体、药剂等。此方法能用于将大多数物质附着在金属、类金属、以及一些非金属样颗粒和宏观表面上。例如，非类金属表面和颗粒可以包括由有机材料或无机材料组成的材料，如玻璃、塑料等。将物质附着在颗粒和其它表面上的方法ⅰ．基本材料分子方法在将物质附着在颗粒或其它表面上的这种方法中，用了两步法，运用基本材料分子。合适的基本材料分子是能通过吸附或其它化学处理接近于表面和与表面相互作用的任何物质，以及具有易接近的官能团，能附着其它物质如结合剂。基本材料分子还具有另外的性质，使颗粒具有化学稳定性。一般地，基本材料分子为大分子形式(分子量大小＞1000MW)，但可以比这小或更大。优选的基本材料分子是那些以高亲合力附着到颗粒上的分子，可使颗粒具有一定的物理稳定性水平，还具有易接近的化学官能团，易于与大多数其它任何物质结合。化学官能团通过化学结合、共价键结合或非共价键结合使结合剂或其它物质连接在一起。例如，共价结合可能涉及到光化学或化学结合。非共价结合可能会涉及到与诸如象链霉抗生物素蛋白分子的交连，或者通过疏水、氢键键合或静电相互作用的吸附。这些基本材料分子也可包含有一个或多个化学官能团，通过运用适当的化学物质或交连剂，用这些化学官能团可跨越颗粒表面将几个基本单元的分子交连在一起。
下面选出了几个实施例，说明了如何用基本材料分子吸附方法合成颗粒结合剂组成物。这一物质具有高稳定性，对于与之结合的部分有高结合亲合力。这一物质提供了一种高灵活性，易于使用以及费用低廉的方法，可将大多数任何物质附着在颗粒或其它表面上。一般性本领域的技术人员会认识到在多数任何实际场合中有许多通用技术可合成颗粒结合剂组成物。用这种新的方法，以一种易控制和可预见性方式，将抗体、肽、蛋白质、核酸、药剂和大多数任何其它物质附着在颗粒上。
例如，我们已经用的是一种分子量大小约为MW 20,000的聚乙二醇化合物的衍生物作为基本材料分子。这种分子(二(聚氧乙烯二[3-氨基-2-羟基丙基]))的特性可以用作基本材料分子。这种聚合物的每一个分子有四个胺基团，胺基团用作连结位置结合其它物质。聚乙烯衍生物的疏水主链与颗粒相互作用并通过吸附或一些其它过程，被附着到颗粒表面。这种相互作用是很强的，在下面的标记和分析诊断检测的应用中，正如所表现的那样，我们并未探测到有任何这类物质从颗粒表面解离出来。胺基团并不是与颗粒表面相互作用，而是作为吸附其它物质，如结合剂的易获得的配对位置。用这一聚合物作为基本分子，我们已制备出了两种不同类型颗粒结合剂的组成物质。一种组成物包含有作为结合剂的生物素，而另一种颗粒结合剂的组成物质是用包含有作为结合剂的单链核酸制成的。被用于吸附的生物素为一种化学修饰形式，它以共价键与胺基连结。对于核酸，5＇端被化学修饰，以致于他们与胺基团发生化学反应。在各种检测方式中，我们利用这些组成物检测，已发现这些颗粒结合剂中的两种组成物都表明了低浓度和高浓度盐水溶液中有高度的化学稳定性，但结合活性例外。在应用颗粒生物素组合物的实验中，未探测到对结合亲合力的影响。这可以通过配置颗粒生物素试剂悬浮液，浓度为6×10-14M并在此溶液中浸没一块包被有亲合素的塑料固体来确定。经一两个小时温浴后，取出固体冲洗。用DLASLPD照明和检测方法，在光学显微镜下检测时，可探测到颗粒被特异性地结合到固体上包被的亲合素，同时对照固体(不合有亲合素)上未见有颗粒结合。在颗粒生物素试剂的这些工作浓度下，如果附着在颗粒上的生物素结合特性大幅度下降，就不可能观察到结合现象。
在另一个实施例中，明胶用作基本材料，通过用铬酸盐离子或其它交连剂，在颗粒表面上，明胶能被交连以最大限度地减少吸附机会。然后，为了将结合剂或其它物质吸附在可结合的氨基团，羧基或其它可实现吸附的化学基团上，通过合适的结合化学性质，将这些结合剂或其它物质连接到颗粒上。
再有一个实施例，用链霉抗生物素蛋白或亲合素作为一种基本材料。用含有至少一种生物素基团分子的一种化学修饰方式，将如结合剂等这样的物质附着在颗粒上。
再一个实施例中，在溶液中，适当条件下，正好位于颗粒表面上，共聚物单元也能聚合成类聚物和具有类聚物特点的其它材料，如，碳水化合物、聚氨基酸、蛋白质等。
对于上述所有实验，也可首先将结合剂或其它物质与基本材料结合，然后将这种材料附着在颗粒表面上，颗粒表面带有或没有化学交连在一起的基本材料。另外，两种或更多种不同类型的基本材料分子或者一个或多个基本材料分子与其它化学稳定分子一起使用，使得供结合的化学反应基团的数量和颗粒结合剂结合物的化学稳定性得到调整，可满足多数任何分析的需要。
上述实施例中，使用选取了合适的材料用作基本材料分子，本领域的技术人员可以合成新类型的基本材料分子，进一步优化他们的应用，将物质附着在颗粒和其它表面上。有关吸附结合物或其它物质的结合亲合势方面，下列改进方法可使颗粒结合剂试剂有更高的化学稳定性，优化了结合过程从而增强了操作性。例如，辅助化学基团被添加到聚合物的主链结构上，增加了基本材料分子与颗粒表面结合的稳定性。各种不同长度连接键臂，其端部或靠近端部处有合适的反应化学基团。这些连接键臂的引入增加了颗粒与最终残留物的距离，在颗粒上附着有结合剂或其它物质。在基本材料中加入不同类型的反应化学基团可进一步改善交连的能力，或者反倒使各单个的基本材料分子跨越颗粒表面结合在一起。ⅱ．通过能吸附于金属表面的化学基团将物质直接附着于颗粒或其它表面我们发展了辅助方法，它允许许多不同种类的物质，包括结合剂，直接附着于金属和金属样颗粒及表面。在材料科学领域和相关领域中，已知某些种类的小分子(＜1000分子量)能吸附于金属表面等。对于大多数这些小分子，在分子中的特定位置上存在某些种类的化学基团，这些基团可以使小分子的一部分结合于金属表面而其它部分则不结合于该表面。例如，附着含有硫醇类及二硫化物的物质、和亲水性物质如n-酮酸及某些洗涤剂分子于金属表面在材料科学领域中是已知的(见Nuzzo et al.(1983),Journal of the American Chemical Society,105,p.4481-4483；Allara et al.(1984),Langmuir,l,p.45-52；andBain et al.(1989),Joumal of the American Chemical Society,111,p.321-335)。附着物质于金属表面的方法特在此引入作为参考。××××××因此，允许上述物质附着的性质能被赋予结合剂和其他物质，方法是在那些准备用于附着的物质的分子结构中特定位置上引入恰当的化学基团。某些种类的物质用此方法将比其它方法更容易附着。例如，物质若其分子结构是带电的或者是离子性的亦或是极化的致使分子结构一端疏水而另一端亲水，则在此方法的这种特殊变更方法中是普遍有用的。
例如，核酸包含着一个带有强负电荷的磷酸盐构架。一个单链核酸有3＇或5＇端上标记以硫醇类或二硫化物，分子中相同区域带有或没有附加的疏水基团。此被修饰了的核酸将以这些标记端上的基团与金属表面或颗粒结合。核酸的离子性部分保持核酸分子结构的主链远离表面，这使得分子容易与大多数任何能与之特定地结合的物质相互作用。
其它物质诸如生物素、肽、药物结合剂、聚合物等能用此方法附着于颗粒上。此方法对于大多数在其天然状态下不与颗粒或表面显著反应的物质普遍有用。对于那些会与颗粒或表面反应的物质则需要用另外的方法。例如，某些小分子、蛋白质等会与颗粒或表面反应致使它们的结合活性降低。在此方法的一种替代方法中，颗粒首先标记上比如一种聚合物稳定剂。接着上述标记。在表面或颗粒上通常会露出一些区域而分子本体(molecule entities)能结合于此。那些经过恰当修饰的物质便可加到用化学方法稳定过的颗粒中以得到一种所需的结合活性或其它性质。或者反过来也行，在与颗粒或表面混合之前，让化学稳定剂和经化学修饰的结合剂以所需比例混合在一起。利用这些方法、大量、多种的附着于颗粒或表面的物质能在控制下产生一个包被的表面或颗粒，它们具有所需的化学稳定性和结合活性。
各种长度和组成的接头臂也能够引入分子结构中。例如，可以应用一种分子量小的基本材料分子，在其分子结构最适宜于附着在颗粒或表面且最适宜于以高强的结合活性和所需取向吸附几乎任何物质。作为一个实施例，一种长度为20个氨基酸的线性多肽，在一个末端通过引入二硫化物或硫醇类化学基团作化学修饰。天然的多肽包含氨基酸成分，使得多肽链不会与表面发生作用。除非通过经化学修饰的那个末端起作用。在另一个末端存在一个游离的氨基，或是另一种情况，即此端经化学修饰形成所需的偶联突起(conjugation process)，使得几乎任何物质能被吸附于此位置。这种低分子量的基本材料分子于是可用于本文所描述的一种或多种本方法的变化中。
本文所描述的基本材料分子偶联方法和直接附着方法允许更特定地对大量、多种及各种取向的能附着于颗粒或其它表面的物质进行操纵。一种更进一步的利用是这些方法为合成颗粒结合剂提供了试剂，此处附着结合剂的结合力可保持高水平。
此利用小分子量或大分子量的基本材料分子方法的一个重要特色是通过正确选择和使用，基本材料分子能用作为一种普遍的接头平台(linker platform)，在此处几乎任何物质能附着于颗粒或表面。这种性能在基于颗粒、用于检测分析物的试剂的日常制造业中变得极端重要。这许多不同种类的新附着方法能通过改变化学基团、分子量、分子结构、标记反应条件及所使用的偶联化学类型(即交联、共价附着等等)而实现，这些方法将为本领域的普通技术人员所认识到。利用光散射颗粒作微阵列(Microarray)或微图案(Micropattem)分析这种微阵列微图案分析方法利用分立的空间上可达到的固相区域来探测不同种类的分析物。例如，各个空间可达到的区域或微点(microspot)可能包含不同种类的抗体、受体、核酸等。固相上空间可达到区域的分布受控于固相的尺寸、分析物的数量或将被利用的不同区域，和探测方法。各个包含一种特殊结合剂的空间可达到的微点其形状可能是方块、圆或任何依赖于制作微阵列方法的形状。其面积可能是几个平方微米到几个平方毫米或甚至更大。这种微阵列方法可以利用多固相形式中的一种而实现，这些多固相形式用于单种分析物的探测且在其中最终定量分析通过测量与结合于固相的分析物数量有关的固相信号而实现。实际中，此微阵列方法的主要分析步骤如下。此微阵列暴露于一种待分析样品中，比如血清，在一个合适的培养期后，清洗阵列并暴露于第二种分析物的结合物结合本体中。在一种形式中，第二种分析物的结合物结合于光散射颗粒，而探测的是这些颗粒的光散射性质。附着在每个微点上光散射颗粒的数目便是对出现在每个微点上分析物的量的一种测量，并且与样品中分析物的浓度有关。在另一种形式中，第二种特定的分析物的结合物并不结合于光散射颗粒。在后一形式中，结合于光散射颗粒的是第三种本体，它特定地与第二种特定结合物结合。这第三种本体比如，可以是链霉抗生物素蛋白，能特定地结合生物素，而此生物素共价附着于第二种本体。有许多其它的分析方法可用来探测第二种本体，它带有结合于光散射颗粒的第三种本体。在任何这些形式中，结合于各个微点的分析物的量可通过测量光散射信号而确定，被测的光散射信号与结合于各个微点上光散射颗粒的数目有关。
不同的方法能用于探测微阵列中各微点上光散射颗粒的数目。结合于各个点(spot)上分析物的量根据附着于各个点上光散射颗粒的数目确定，这在最终的分析步骤中实现。通常，某种成像系统需要从阵列里的不同区域中分离光散射信号。许多不同的方式能用于成像及定量分析颗粒。选择何种方法取决于所需精度及每天需测的样品数目。所需精度有很大的变化范围，从仅需得到一个肯定或否定的回答的低精度情况到把分析物的量确定到几个百分点的极高精度情况均可以。
一些特色能被引入到微阵列中用于任何成像方法，比如，阵列中某些微点上的化学组分能被格式化产生一种本底信号，或被格式化用作包含分析物已知量的校准点。从这些点来的信号能用于校准入射光的强度变化、多微点与阵列载体之间的透射光、集光效率和从一个样品到下一个样品光探测器的灵敏度。现在描述一些特定的成像和定量分析光散射颗粒方法在阵列微及阵列片(array chips)中的应用。a．借助简单光学显微镜的DLASLPD方法ⅰ．点上颗粒表面密度低(小于0.1个颗粒/μ2)情形如果将待检测的样品数目不大，则各个点上的颗粒数目可以通过对各个点上颗粒数目进行目视的或其它的计数方法而确定。本底计数也进行了。计数能在液体包被的或干燥的微阵列上进行。每个微点上的颗粒数目其数值被认为是正的，由先前的检测实验所定义。如果需要检测的样品有许多，则可以利用一个简单的视频检波器和靶计数软件自动完成计数。ⅱ．点上颗粒表面密度高(大于0.1个颗粒/μ2)情形对于只要求结果为肯定或否定的此类分析，各个点上的强度可以通过目测或光探测而检测到。一个结果是肯定的若其强度大于本底强度。如果需要得到定量结果且待检测的样品不多(例如，床边、野外、小诊所、或研究室检测)，则一种利用双观察点显微镜的技术指南可以使用如下。单个微点用一窄光束照明。利用其中一个观察点通过目测将光束定位于点上，而强度通过光敏器件定量测量。此光敏器件带有或不带有空间滤波孔，取决于杂散光信号的等级。各点上散射光强度通过在光束中手动扫描各点而测量。或换一种方式也行，手动扫描光束，从各点来的光用一个大范围光探测器或小范围光探测器探测，其中探测范围保持与照明点共焦。这也可以自动化。如果需要分析许多样品，则微阵列可用扩展光束照明，且微点的图像可通过视频摄像机和帧获取器(framegrabber)数字化。各个微点强度便可通过软件图像分析确定。我们已经明确，这些方法允许一个待测样品中一种或多种分析物有很高的灵敏度和宽大的浓度范围。本领域的技术人员将体会到本方法的多种变更方法是可能的。利用某种金属样颗粒在微阵列和阵列片(Array chip)方法中探测分析物在作微阵列分析的工作中，我们发现金属样颗粒作为光散射颗粒是优选的。用于特定的微阵列应用中的颗粒类型，其尺寸、形状、组分及均匀性主要依赖于下列各项因素。样品中无规光本底的数量；微阵列是干燥的还是为液体所包被；分立的固相结合区域的面积；待测物的数量和浓度变化范围；用眼睛探测还是用光探测器探测，测量颗粒计数和/或测量强度。
作为一个实施例，我们能很容易检测到直径为60nm、包被有BSA-生物素的单个金颗粒结合于直径为80微米的点上，此点包含链霉抗生物素蛋白于一包被有缓冲溶液的微阵列形式中的一个塑性固相上。我们使用DLASLPD条件下传统的照明装置和我们自己开发的廉价显微镜系统。在微阵列链霉抗生物素蛋白微点上直径为60nm、密度较低、包被有BSA-生物素的金颗粒，我们对结合颗粒作了计数。在高密度情况，我们测量来自结合于单个链霉抗生物素蛋白微点上的颗粒的散射光强度。当信号与本底比例为13时，我们可探测的颗粒密度可低至约0.06个颗粒/μ2。这暗示对于此类分析，当信号与本底比例约为3时，我们可探测的颗粒密度可低至0.015个颗粒/μ2。密度非常高的结合颗粒也可探测(每个直径为80微米的个体微点上有效结合位置的饱和)。为了在一个干燥形式(没有流体包被)下实施同样类型的微阵列分析，需要使用直径更大的金颗粒或其它具有较大光散射能力的金属样颗粒以达到同样灵敏度。并且，使用波长较大的光源如氦氖激光器是有好处的，此激光器能发出波长大于600nm的光波并且具有空间滤波特性。
为了用小型手提式或其它类型的轻便装置来探测样品，可能需要更大的颗粒，这依赖于所需的灵敏度等级。典型的是，本领域的技术人员必定会在此装置中使用低功率光源。
对于微阵列形式中多分析物的探测，不同分析物的浓度可能存在很大不同，其差异在浓度上从1,000到1,000,000或甚至更大。在此种情况，光散射功率和颗粒的相关尺寸变得非常重要。例如，如果某人正在分析-阵列片或微阵列上的多种分析物，当阵列或微阵列上个体的分立结合区面积约为100平方微米时，则能结合于此100平方微米区域的颗粒数目强烈依赖于所用颗粒的尺寸。例如，如果采用一种尺寸为40nm的颗粒，在结合饱和情况下，约79,600个颗粒能结合于此区域。然而，如果采用尺寸为120nm的颗粒，大约仅8,800个颗粒能结合于此区域。为使测量可靠，则必须结合于此区域的最少颗粒数目可以有相当的变化，这依赖于无规光本底的量及颗粒的无规结合。例如，在某些情况，可能需要几千或更多的颗粒结合于微阵列上的结合区域以得到正的探测结果。采用大颗粒因而会限制分析物的可检测性。在小面积的结合区域，应该使用能给出充分大的信号/本底比值的最小颗粒。另外，光学和空间滤波、共焦成像、更强的光源及其它仪器元件能最有效地提高探测极限。类似地，如果两种或更多种分析物以非常不同的浓度存在，则需采用尺寸及光散射能力合适的不同类型的颗粒。
这些实施例并不意味着限制，而是表明在各种应用中，选择某种金属样颗粒将如何导致微阵列分析中和多种分析物探测中特定的检测仪器的选用。本领域的技术人员将认识到本发明中的方法有许多其它变更方法可用于探测阵列片和微阵列上的多种分析物。本发明的某些方面在其它照明和探测方法下的使用此发现意味着你可以在本领域中现有的诊断探测方法和设备条件下利用本发明的各个方面，甚至无需使用本发明所公开的最佳光照条件和探测方法及系统。例如，激光共焦显微方法、明视野和落射照明落射显微方法，及反射对比(reflection Contrast)与差动干涉(differentialinterference)对比显微方法，在某种金属样颗粒下可用于测量微阵列等上的多种分析物。
例如，可以使用共焦显微镜，此种显微镜描述于Ekins的美国专利5,432,099(此处引入作为参考)。一般地，这种共焦显微镜依靠点照明而不是场照明，并且通常在落射照明下工作于荧光模式。通常，用光电倍增管作探测器，因为待探测的信号非常微弱。光源常常是激光。在本发明中，尽管信号极端强(对比常规共焦显微镜而言)，并且无需用激光作光源，但仍需要一个与共焦显微镜同样复杂的仪器。很清楚，利用此仪器为探测颗粒提供了更高的灵敏度，正如本发明中我们已发现的那样，并且使杂散光的影响降到最低限度。
如此，在另一个实施例中，Fodor等的方法也可以采用，即利用生物切片探测靶分子，见Fodor et a1.,Nature,364卷，555页，1993年。
当这些方法和仪器的费用及简易程度并不重要时，则这些方法与本发明的某个或多个方面组合使用在某些微阵列分析应用中是很有用的。我们注意到没有任何人将上面提到的本领域现有技术与金属样颗粒和/或折射率提高方法和/或自动金相显微术和/或本发明的任何其它方面相结合利用。我们因此要求对前面已述的本领域现有的探测方法和仪器同本发明的一个或多个方面的相结合利用拥有专利权。本发明的其它修改应用于微阵列本发明的方法提供了非常好的途径以利用微阵列形式探测一种或多种分析物。下面的方法提供了额外的在某些分析应用中有用的变更方法。
我们可以使照明和探测方法小型化，这样便构造了一套单一的或基于多光纤(multi-optical fiber)的装置。这为探测提供了利用成像方法的选择。
采用二维阵列或者其它类型空间可达到的固相系统的一个问题是，微阵列上不同区域的信号之间会发生串音(crosstalk)。串音、眩光或其它类似问题存在几种来源，例如，(1)包含光散射或荧光材料的个体区域靠得太近以致它们显现得似是一个区域，或(2)某区域包含大量光散射或荧光物而其它毗连区域只包含少量上述物质。来自高强度区域的光的一部分将在强度较弱的光出来的区域被探测器采集，这与各个区域之间靠近的程度有关。
在本领域中一个可能的解决办法是采用扫描方法分别照明各个空间可达到的固相位置，并且在照明各个空间可达到位置时分别记录来自各个位置的光信号。这可以通过移动照明光束或样品，一个时刻一个区域地扫描不同区域而完成。然而，这些扫描机构通常是复杂的并且给分析方法增加极大量的成本及复杂的过程，而且对临床检测实验室或高度活跃的研究实验室的日常的艰苦工作来说可能太昂贵而不够坚固耐用。
现在描述本发明进一步变更的一个实施例。一根光纤在一端被斜削成一个合适的角度，并用作分立的照明光源，使得当它被靠近到一待测区域时，此区域上的发射荧光或散射光可以从样品表面的另一侧(side)探测到。这种构形允许单个区域的特定照明并消除了上述串音问题。它也排除了对成像型探测器如视频摄像机的要求，任何类型的光探测器都可以采用。作为一个实施例，对一个待测的有24个微点或独特(distinct)区域的阵列，将采用24根分立的照明光纤，每点一根。所要求的是各个体点彼此之间在不同时刻照明。能用此方法测量的几个空间可达到的小区域，其尺寸可小至光纤直径的1/2。
在本方法的另一个实施方案中，这里需要采用落射照明或类似方法，举例来说，共焦成像，人们可以把系统小型化，方法是在光纤一端放置一个极小的成像透镜并达到共焦条件，在此条件下散射光或荧光能在微阵列中所需区域被测量到。对于在微阵列表面上任何需要测量的区域，采用单根带有微透镜的光纤来输送入射光并采集待探测的发射荧光或散射光。如果需要的话，可以象上述那样采用多根光纤来同时探测表面上多于一块的区域。
本领域的技术人员将认识到上述说明性的实施例仅是本发明的许多可能的变更方法中的一些。组合的合成分子库的筛选在组合合成重要分子的发展迅速的领域中有一个极大的问题，即利用信号和探测技术及分析形式来探测新合成的组合分子的少数拷贝时缺乏高灵敏度、实用性及简易性。
我们已确定，我们的信号和探测技术能很容易用于包含空间可达到位置的固相，比如二维阵列或任何空间可达到的固相。因此，我们的方法在这种或那种形式中可直接应用于筛选和探测在此种形式中一类或多于一类筛选组合的或生物组合分子。此分析方法可以是本领域中任何已知的方法。
我们在本文中所描述的发明，也可以用于探测和量化空间可达到的固相上一种或多于一种特定的组合分子、生物组合分子或另外的合成分子。例如，众所周知，在本领域中多种多样的生物组合和组合的分子能用以下方法合成“裂解合成”、“并行合成”及相关方法(所有这些方法在此是引入来的)。典型地，多种多样的组合分子是合成在小颗粒或其它固体基片上的，此处各个颗粒或基片包含一群独特的组合合成分子。鉴别和净化那些包含合成分子中的“活跃”群落的基片或颗粒，在本领域中还存在问题。
有几种途径可以利用我们的信号和探测系统来探测这些特定的、合乎需要的组合产物。在某种分析方法中，结合剂(它专门用于合乎需要的分析物)包被于一种精选的金属样颗粒上。当带有包被层的颗粒加到样品中，它将结合于分析物。或者反过来用一种间接方法也行，它包含利用生物素标记结合剂先结合于分析物，而此分析物便可通过在探测前加进包被有链霉抗生物素蛋白的金属样颗粒而探测到。光散射颗粒以这种或那样形式结合于合乎需要的、所考虑的分析物，而此分析物驻留于合成的固相。照这样，合乎需要的分子便通过过滤、分离、透析或任何其它本领域所已知的技术从样品中得到鉴别、隔离和净化。或者，可以加进标记了包被有结合剂的颗粒的结合剂，以使聚集体或网状物形成于特定的包含分子的合成颗粒和金属样颗粒之间。与上述类似的方法可用于鉴别和净化合乎需要的分子。
不同组合的合成分子的多分析物分析可以通过利用各包被有不同类型结合剂的两种或更多种金属样颗粒而完成。折射率提高和DLASLPD视频一提高对照方法也可以采用。
在另一个分析方法中，金属样颗粒也包含一种铁电或磁性组合物，以便通过利用外加于反应容器的电磁场使得这些颗粒能被操纵于三维空间。照这样，包含“活跃的”组合分子的基片颗粒能很容易地从所有其它材料中净化并探测。应当指出，铁电体或磁性体与其它特定颗粒的类金属组合物的混合组合物在许多其它领域包括诊断分析是很有用的，对于分离和净化合乎需要的分子也如此。将折射率提高方法与上述方法配合使用，能提高探测灵敏度。金属样颗粒用作固相合成物载体金属样颗粒当包被有合适的物质时，是引导化学或生物化学合成例如组合合成的很好的基片。类金属的特定包被层可以由，例如聚合物、抗体、蛋白质、核酸、氨基酸、活性化学基团等等组成。例如，金属样颗粒可以包被于包含化学活性胺基的聚乙二醇化合物。合成便开始于这些大量地存在于有包被层的金属样颗粒上的胺基上。其它活性化学基团或能被特定地激活的基团能代替胺基使用。在另一个实施例中，氨基酸或小肽直接包被于金属或金属样颗粒表面，或化学性地连接于包被在类金属表面上的聚合物或其它类型的分子。合成便开始于有包被层的金属样颗粒。在此外的另一个实施例中，活性基团附着于金属样颗粒表面以使蛋白质、核酸、化学制剂或生物化学合成能够实现。颗粒表面上活性基团的数目能用下面方法调节。带有或没有活性胺基(或其它活性基团)的聚乙二醇化合物(20,000分子量)以合适比例混合以使每个颗粒表面上活性基团达到所需数目。照这样，金属样颗粒便包被上了特定数量的化学合成位置或结合位置。这些位置的特定数目和活性基团位置的类型可以改变以适合于任何特殊的要求，例如，进一步的化学合成或为诊断试剂用途。例如，对于诊断型的应用，为达到所需的分析性能，每个金属样颗粒增加分立的数目的特定的结合剂分子可能是重要的。另外，两种或更多种不同的活性合成物或结合位置能通过按合适比例混合所需物质(即不同的结合剂或化学基团，等等)并以特定数量置于相同的金属样颗粒上，其方法与上述关于聚乙烯化合物的方法相同。这些类型的有包被层的颗粒是有用的，例如，利用相同颗粒分离、净化及探测两种或更多种不同的分子。许多种金属样颗粒具有高密度(g/cm3)，这也为所考虑的分子的净化、分离、鉴别提供了许多有利条件。MLSP型颗粒为更易于在介质中操纵颗粒提供了进一步的有利条件。上述实施例仅是本方法许多可能变更方法中的一些。其它变更方法对本领域技术人员将是显而易见的。本发明的各个方面在分析诊断领域之外的实践本发明使通过探测颗粒的散射光性质而探测样品中一种或多种分析物的方法具有特色。应当指出，这里所公开的，本发明的各个方面可以直接适用于诊断领域之外的许多其它特定的应用中。这里所公开的东西使本领域或者其它领域如光学信息与存储、图像形成与处理、电光信号转导与转换、电信、信息变换器及许多其它相关应用中的技术人员能够在分析诊断检测领域之外运用本发明的各个方面具体地解决问题并创造新产品。
本发明的一个在其它领域非常有用的方面是通过独特的光学标记能够鉴别某种尺寸、形状、组成和均匀性的特定的颗粒。此光学标记正是那种颗粒的特征。将上述特定的光学标记体现于极小结构，可以使这些颗粒信号试剂能够用于非常多的领域。例如，它们能用于工业质量控制、标记(markers)或标签(labels)以鉴别或示踪任何产品、材料、物质或包含颗粒的物体。这种或那种形式的颗粒能用作鉴别等的手段，类似于本领域所已知的“条形码(barcoding)”方法。例如，包含一种或多种颗粒的包被层能应用于消费产品以鉴别其真实性(authenticity)、日期或相关信息。类似地，地币、链票和票据证书等能在表面包被上或在纸材料本身嵌入某种颗粒，这些颗粒能被探测以确定上述物品的真实性。另外的实施例包括放置少量特定类型的颗粒于处方中或计数药品上以鉴别或示踪药物。另外，颗粒可用作环境的、工业的、医药的或生物的示踪剂以研究某个系统如流体、材料等的配置的物理性质。本领域的技术人员将会认识到这些仅是许多可能性中的一些。
本发明的可以直接应用到其它领域的另一个方面是使用可以通过电场、磁场或相关场物理地操纵的光散射颗粒。我们给上述颗粒命名为可操纵的光散射颗粒(MLSP)，这些将随后详述。上述MLSP颗粒可以利用磁场、电场或相关电磁场在一维、二维或三维空间形成各种排列。这样，颗粒的独特的光散射性质可以用来形成某种图样、图像或色彩。一种或多种MLSP颗粒的特定排列，借助于个体颗粒的光散射性质或最后所得到的光散射信息，即是，形成特定排列的两种或更多种颗粒的光学标记，可用来存储或转换信息。例如，分别散射蓝、红、绿光的三种不同颗粒放置于小区域或体积如荧光屏中的“像素点”里，此荧光屏包含特定数目的像素点于一个二维的阵列上。当被白光照明时，荧光屏形成一个彩色的或黑白的图像或类似于电视图像、视频图像、动画图像等的移动的图画。各个像素点或各组像素点是电场或磁场空间可达到的，因此，外加合适的电磁场，当适当照明时，散射蓝、红、绿光的个体颗粒会排列起来而产生具有某种色彩和强度的特定颜色。例如，在一外加电磁场下，红色和绿色颗粒聚集于非常微小的点上而蓝光散射颗粒则游离地分散于像素点的内部体积中。此像素点便会显现出蓝色。使用不同的电磁场对红光或绿光散射颗粒能产生相应的效果。这样，通过特定地排列各个像素点上不同的颗粒，所需的颜色便可产生。此方法和设备为当前基于阴极射线管的图像信息技术等提供了许多吸引人的便利。
在另一个实施例中，MLSP颗粒通过适当调节电磁场从一种特定的排列转换成另一种排列。例如，能产生绿色和红色散射光和/或还具有两种不同等级散射光强度的反对称银颗粒可使用如下一个或多个颗粒放置于液体型的或固体型的材料的特定位置，此处颗粒能旋转，即是，当外加电磁场于包含颗粒的材料或装置时，颗粒能重新排列。颗粒的不同排列预示着不同类型的信息，这依赖于有多少颗粒被使用及仪器的所需功能。例如，在某种排列，反对称MLSP颗粒的光散射性质表示“关”或二进制编码系统中的0，而在另一不同位置或排列，光散射性质表示“开”或二进制中的1。反对称MLSP颗粒的排列可通过改变电磁场来改变以达到材料或装置中颗粒的所需排列。当光与这些有特定排列的颗粒相互作用，散射光的性质预示着某种上述的特定信息。照这样，可以做成简易的和多组件的光学转换器，它们在电信及相关领域是有用的。类似地，一系列的这种转换器能装配成串列的或并行的样式以存储和处理更复杂的信息。
新型的信息存储器件可以通过利用不同类型和/或排列的光散射颗粒和MLSP颗粒加密或存储信息而制成。例如，光学存储盘能被制造出来，它类似于本领域所已知的“硬盘”或“CD-ROM”盘等等。这里不是用压膜装置(bumps)投射到上表面来对信息编码，而是采用颗粒。颗粒可以置于任何材料上，只要颗粒的光散射性质能被探测到。照这样，存储更多的特定的信息及存储高密度信息是可能的。
本领域的技术人员将认识到，能用各种特殊应用中的光散射颗粒建造多种不同的设备。上面的实施例仅是金属样颗粒和MLSP颗粒用于分析、诊断探测领域之外的许多途径中的一些。这些应用通过这里公开的内容而成为可能，申请人特此对这里所描述的本发明的各个部分在诊断分析领域外的实施要求拥有专利权。液态样品的SpectraMetrix光谱仪及操作理论的描述SpectraMetrix光度计是一种直角(right angle)光度计，它测量与激发光束成直角的散射或发射光的光强。此仪器的示意图给出于图21。光源是显微镜照明器或任何其它类型的光源。这仪器有无单色仪也可以使用。用于连接不同光源的连接器装备于光度计上。散射光或发射光用光电倍增管(PM)探测。光度计有个手动光闸，用来防止在更换样品时光进入到PM管中。光学滤波片或起偏振片当需要时可引入到入射或发射光路中。各种直径的圆柱形小容器(cavets)(例如试管)用来作样品室(sample cuvets)。当然，任何类型的透光的样品容器辅以合适的支架也可以使用。采用直径为6mm×50mm的试管和带有红外(热)滤波片的显微镜照明器以得到本文所报告的数据。
照明器可以直接连接于光谱仪或先经过一单色仪再连接。用于本文所报告的测量的单色仪是一个衍射光栅单色仪。照明器用一稳定的6伏特，3安培直流电源驱动。
在此段中，我们描述无需单色仪操作的仪器的光学系统。一个×10的物镜把从照明器来的光聚集到样品管上。一个集光透镜(焦距23mm，直径19mm)，置于与激发光束成直角的位置上(离样品室中心约1.5英寸)，使样品管的像聚焦于离样品管中心约106mm远的地方。这段距离使得光闸和滤波片支架能放置于集光透镜与PM管之间。带有一个直径为3.25mm的孔(用#20的钻头制作)的挡板放置于像平面。PM管放在挡板后面。挡板阻挡从容易壁上反射来的光并仅允许从样品体积中心散射来的光到达PM管。挡板当减少了到达PM管的散射光的量的同时，也增大了信号本底比率。为了进一步降低探测从样品管反射过来的光，管被置于相对于垂直方向约40-50度的角度上使得反射光不能到达集光透镜。由于这角度和折射率效应，出射于管的光并不通过集光透镜的中心轴，像平面上散射光束从集光透射的中心轴向下移动。这需要将那直径为3.25mm的孔和PM管也从集光透镜中心轴向下移动。此装置制造成可以手动调节向下移动，以达到散射光的最佳探测效率。
当单色仪被采用时，其光学系统除与上述相同外，需用附加的透镜(焦距23mm，直径19mm)置于10×物镜和单色仪出射狭缝之间。此透镜离样品室中心4英寸。单色仪的出射狭缝离样品室中心5.6英寸。照明器在单色仪入射狭缝处与连接器连接。光度计光学系统的调节a．置一60nm、4×10-12M的金溶胶(gold sol)于一个6×50mm的在光谱仪样品支架上的培养管中心。相对于垂直方向调节管的角度使其在40到50度之间。放置此有一定成角的管以使已聚焦的激发光束穿过容器的中心。勿使激发光束射到管的前表面(面向集光透镜的表面)，因为这会增加输入到探测系统的反射光的量。b．调节集光透镜与样品管中心的距离使得在离样品管中心106mm远处形成管壁的清晰的像。散射光束和样品管壁的像能在离管中心106mm处放置的白纸上清楚地看到。在像平面上，管的像的直径约为8到10mm。透镜需合适放置以便得到清晰的容器壁的像。在像平面上，散射光束显得有点模糊，这是由于此光束的有限宽度。透镜的最佳位置是离样品室中心约1.5英寸。激发光束当它穿过散射溶液时可以被清楚地看到。c．上面对集光透镜位置的调节，是在把包含光闸、滤波片支架和挡板支架的构件从仪器中移开的条件下进行的。当透镜正确地放置后，将后面的构件复位并插入带3.25mm开孔的挡光隔板。PM管接入到位。d．在步骤a、b和c后，如下调节光闸(aperture)相对于集光透镜光学系统的位置。放置一块白纸于一处，此处也就是当PM管接入后，其光电阴极平面将定位的地方。在光散射金颗粒置于样品室(Compartment)的条件下，调节光栏位置直到在PM管上可以看到的光为最大量。当光栏恰当放置后，光在纸上显示出直径为0.32英寸(8mm)的点。实施例实施例1到10包含测量从颗粒散射来的或从荧光分子发射出的或两者兼有的光。用于测量光信号的仪器是一个用前面所述的SpectraMetrix制作的光度计。
实施例1到实施例3，用于这些测量的聚苯乙烯颗粒是NIST可示踪的经检定的纳米球(nanospheres)，购买于Duke Scientific Corp.,Palo Alto,CA.金颗粒购买于GoldmarkBiologicals,Phillipsburg,N.J.，英国Biocell Intl.Cardiff uk.的一个分配站(distributor)。
实施例4到实施例10，荧光素购买于Molecular Probes Inc.,Eugene Oregon，金颗粒购买于Goldmark Biologicals,Phillipsburg,N.J.,英国Bioccll Intl.,Cardrff uk.的一个分配站，聚苯乙烯颗粒购买于Interfacial Dynamtcs Inc.,Portland,Oregon。
形状与尺寸相同但组合物不同的颗粒的相对光散射能力，可通过对比垂直于入射光路方向的散射光强而直接比较。如果已知浓度的各所考察的颗粒的光散射强度的测量是在直角方向观察而完成的，则浓度相同，尺寸、形状相同但组合物不同的颗粒的光散射强度能直接比较，并且不同颗粒的相对的总光散射本领也确定了。实施例1、2和3-可比较的聚苯乙烯和金颗粒的计算的和测量的相对散射能力结果显示于表6、7和8。计算利用已知的光散射关系和前述的我们新定义的关系进行。对于水中颗粒的实验测量，通过在给定照明强度和波长条件下利用SpectraMetrix光度计探测被溶液中游离颗粒散射的光而完成。执行下面的步骤。(a)用相同的入射光组成和强度照明对照物和可比较尺寸的颗粒。(b)确定从一个装有水但无颗粒的对照管发射出的光信号。(c)确定从一个装有已知浓度的颗粒的管发射出的光信号。(d)将对照管的光信号值从(c)中的光信号值中减去。(e)比较相同浓度的金和聚苯乙烯颗粒的光信号。实施例4-测量所得的荧光素与金颗粒相对的信号产生能力-白光照明结果显示于表10。探测光的相同方法被实际用来确定在6mm×50mm的玻璃中所有样品发射的光信号。在测量来自金颗粒或荧光素的光信号时，没有使用光学滤波片。
所有测量均在水中进行，包含荧光素的溶液其pH值为8-9。仅包含水的管子的光信号值需要从金颗粒或荧光素光信号值中减去以得到仅仅起因于荧光素或金颗粒的光信号。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施A．(a)用相同组成和强度的入射光照明所有样品。
(b)确定包含水但不包含颗粒的对照管发射的光信号。
(c)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。(d)将对照光信号值(b)从光信号值(c)中减去。来自荧光素的光信号的测量按下面步骤实施B．(a)如上用相同组成和强度的入射光照明样品。(b)确定从对照管发射的光信号。(c)确定从管中已知浓度的荧光素发射的光信号。(d)将对照光信号值(b)从光信号值(c)中减去。C．(a)比较从已知浓度的颗粒和荧光素分子得到的光信号。实施例5-荧光素和金颗粒的测量得的相对信号产生能力-单色照明结果给出于表11。这些结果没有作入射光不同强度方面的修正。采用其波长能使荧光素发生最大光发射(490nm)及使金颗粒发生最大光散射的单色入射光。波长为490nm的入射光强度稍微低于用于金颗粒的强度，其强度在波长520nm入射光时，强度为86％，在波长为565nm入射光强度时为80％。在另一方面，光电倍增管的量子效率从0.34变化到约0.18，前者对应于荧光物质的基本发射波长(520nm)，而后者对应于560nm波长。
除入射光波长外，相同的探测光的方法用于在6mm×50mm的玻璃管中的所有样品。在金颗粒或荧光素的光信号测量中均没有使用光学滤波片。
所有测量均在水中进行。包含荧光素的溶液其pH值为8-9。仅包含水的管子的光信号值需要从金颗粒或荧光素光信号值中减去。以得到仅仅起因于荧光素或金颗粒的光信号。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施A．(a)确定包含水但不包含颗粒的对照管发射的光信号。(b)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。(c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。来自荧光素的光信号的测量按下面步骤实施B．(a)确定从对照管发射的光信号。(b)确定从已知浓度的管中荧光素发射的光信号。(c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。C．(a)比较从已知浓度的颗粒和荧光素分子得到的光信号。实施例6-荧光素、聚苯乙烯、聚苯乙烯-荧光物质化合物及金颗粒的测量得的相对信号产生能力结果给出于表12。这些结果没有作入射光不同强度方面的修正。
所有样品均用单色入射光照明。直径为100nm的金颗粒用单色入射光照明，所用波长在使颗粒发生最大光散射的波长附近。聚苯乙烯-荧光物质化合物用能发生最大荧光激发的波长(490nm)的单色入射光照明。此荧光物质化合物的最大荧光发射发生于515nm。此490nm处的入射光强度为555nm处光强的80％。光电倍增管的量子效率在555nm时约为515nm的60％。
除入射光波长外，相同的探测光的方法用于在6mm×50mm的玻璃管中的所有样品。在金颗粒或荧光颗粒的光信号的测量中均没有使用光学滤波片。所有测量均在水中进行。仅包含水的管子的光信号值需要从金颗粒或荧光物质颗粒光信号值中减去以得到仅仅起因于荧光物质或金颗粒的光信号。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施A．(a)确定包含水但不包含颗粒的对照管发射的光信号。(b)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。(c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。来自荧光颗粒的光信号的测量按下面步骤实施B．(a)确定从对照管发射的光信号。(b)确定从已知浓度的管中颗粒发射的光信号。(c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。C．(a)比较从已知浓度的颗粒得到的光信号。实施例7-高血清浓度下直径为59.6nm的金颗粒和荧光素的探测结果给出于表17。血清购买于Biowhittaker Inc.,Walkerville,MD。血清在出售前已经用一1微米过滤器过滤，并且是透明的、显现出稻草色彩。对于荧光素测量，血清的pH值被调节到约9到9.5。包含金颗粒的溶液用波长为543nm的单色入射光照明，这波长接近使颗粒发生最大光散射的波长。包含荧光素的溶液用波长为490nm的光照明，此波长能使之发生最大的荧光激发。
除入射光波长外，相同的探测光的方法用于在6mm×50mm的玻璃管中的所有样品。在金颗粒或荧光素的光信号的测量中均没有使用光学滤波片。
测量在规定浓度的血清中进行。仅包含原有浓度的血清的管子的光信号值需要从金颗粒或荧光素光信号值中减去以得到仅仅起因于荧光素或金颗粒的光信号。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施A．(a)确定包含原有浓度的血清但不包含颗粒的对照管发射的光信号。(b)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。(c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。来自荧光物质溶液的光信号的测量B．(a)确定从对照管发射的光信号。(b)确定从已知浓度的荧光素的管发射的光信号。(c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。C．(a)比较从已知浓度的颗粒得到的光信号。实施例8-在92.8％血清浓度下荧光素、金颗粒和聚苯乙烯颗粒的探测下限结果给出于表18。对于荧光素测量，发射于包含荧光素的样品的光信号在碰到光电倍增管前通过一个kodak No.16 Wratten过滤器。荧光素溶液的最大光强在波长为498nm的单色入射光下观测到，而金颗粒的最大光散射在554nm处观测到。在金颗粒或聚苯乙烯颗粒的光信号的测量中没有使用光学滤波片。对荧光物质测量时，血清的pH值调节到约为9。
除入射光波长外，相同的探测光的方法用于在6mm×50mm的玻璃管中的所有样品。
测量在规定浓度的血清中进行。仅包含原有浓度的血清的管子的光信号值需要从金颗粒或荧光素的光信号值中减去以得到仅仅起因于荧光素或金颗粒的光信号。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施A．(a)确定包含原有浓度的血清但不包含颗粒的对照管发射的光信号。(b)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。(c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。来自荧光物质溶液的光信号的测量按下面步骤实施B．(a)确定从对照管发射的光信号。(b)确定从已知浓度的荧光素的管发射的光信号。(c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。C．(a)比较从已知浓度的颗粒得到的光信号。实施例9-聚苯乙烯、聚苯乙烯-荧光物质混合物和金颗粒在高血清浓度下的探测极限结果给出于表19。测量在规定浓度的血清中进行。仅包含原有浓度的血清管子的光信号值需要从金颗粒或荧光素颗粒的光信号值中减去，以得到仅仅起因于荧光素或金颗粒的光信号。没有进行光学滤波。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施A．(a)确定包含原有浓度的血清但不包含颗粒的对照管发射的光信号。(b)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。(c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。(d)比较从已知浓度的颗粒得到的光信号。
除入射光波长外，相同的探测光的方法用在6mm×50mm的玻璃管中的所有样品。血清描述于实施例7。实施例10-在金颗粒浓度低的情况下，血清对金颗粒的光散射性质没有影响结果显示于表20。浓度为95.7％的血清是透明的，呈稻草色彩，并且每一厘米路径长度上对波长为543nm的入射光有0.14的吸收率。光散射测量在内径约为5mm的6mm×50mm的玻璃管中进行。根据对波长为543nm的入射和散射光吸收的差异，来自血清样品中金颗粒的光散射信号应粗略地是来自水中相同浓度的金颗粒的信号的80％。本例中没有用光学滤波片。
执行下面的步骤(a)用相同组成和强度的入射光照明所有样品。
(b)确定包含水或原有浓度血清但不包含颗粒的对照管发射的光信号。
(c)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。
(d)将对照光信号值(b)从光信号值(c)中减去。
(e)比较从含有相同浓度金的血清和水来的光信号。实施例11-16nm金颗粒悬浮液的制备2.5ml的无菌水加进0.1g HAuCl4·3H2O中形成一4％的HAuCl4·3H2O溶液。此溶液经离心分离以去除颗粒状物质。在一个单独的瓶中，10ml的无菌水加进0.1g的柠檬酸钠中形成1％的柠檬酸钠溶液。此柠檬酸盐溶液经一0.4M的聚碳酸酯膜过滤器过滤以去除颗粒状物质。100ml无菌水和0.25ml 4％HAuCl4·3H2O加入一个非常干净的250ml锥形烧瓶(Erlenmeyer flask)中。此瓶放置在一个定位于4的搅拌电炉(stir hot plate)上并盖上一个100ml的烧瓶。当混合物开始沸腾时，加入2ml 1％的柠檬酸钠。溶液在加入柠檬酸盐后片刻(1分钟之内)便变成黑色。随后它又变成紫色最后是深红色。此红色是在加入柠檬酸盐溶液后约2分钟得到的。让此混合溶液再沸腾30分钟然后冷却到室温，加入无菌水使总体积达到100ml。最终的金浓度约为0.005％而颗粒浓度为1.2×1012颗粒/ml，假设所有金盐转变为金颗粒。实施例12-用聚苯乙烯化合物将金属颗粒稳定化将1克PEG化合物(20,000分子量)加进100ml无菌水中形成1％的PEG化合物溶液，并利用一50ml注射器将此溶液经一0.4μ的聚碳酸酯过滤器过滤。为稳定其给定体积的颗粒，将此体积的颗粒溶液加进某体积的1％PEG化合物溶液中并使最终的PEG浓度为0.1％。实施例13-从直径为5nm的金颗粒制备30nm的包被有银的颗粒使10ml无菌水在一30ml烧杯中沸腾。然后将2mg明胶慢慢地加入，使溶液在搅拌下继续沸腾，直到所有明胶溶解。随后将溶液冷却至室温。加入pH值为5的2ml 47％的柠檬酸盐缓冲液。将0.18ml包含5nm金颗粒的溶液(金浓度约为0.005％,3.8×1013金颗粒/ml)加入，跟着加入3ml 5.7％的对苯二酚溶液。将此混合物调好，跟着加入无菌水使最终的体积为20ml。将50μl 4％的乳酸银溶液以10μl递增方式加入，并用手迅速搅拌混合溶液。最终的银浓度约为0.005％，最终的有银包被层的颗粒浓度约为3.4×1011颗粒/ml。假定所有加进去的银平均地沉积于各个金颗粒上，则颗粒尺寸计算得为30nm。在最后的添加之后，此溶液在室内光线下显现出亮黄色。在窄束白光照明下，光被盛在6×50mm的玻璃管中大量的上述溶液的稀释液散射时是蓝色的。当此银溶液的稀释液在DLASLPD条件下用10×物镜和12.5×目镜的SpectraMetrix显微镜作显微观察时，可以容易地看到不同颜色的光亮颗粒的混合物。在数量上占主要的颗粒是紫蓝色颗粒。通过调节这里所描述的过程(procedure)中我们所使用的直径为5nm的金颗粒浓度，我们制造出直径为20～100nm的包被有银的颗粒。实施例14-形成并检定于显微镜玻璃载片上的非球形银颗粒的散射光性质将一小滴稀释的按描述于实施例13的方法制备的银颗粒溶液放置在一显微镜玻璃载片上盖以盖玻片以在此盖玻片与显微镜载片之间形成一层很薄的膜。当银溶液薄膜的一小点被极窄的光束照明并用肉眼观察时，在一个避免入射光进入眼睛的角度，被照明的小点有蓝色散色光出现。然后，在DLASLPD条件下，用一个带10×物镜和12.5×目镜的光学显微镜对此银溶液膜作显微观察。可观察到，几分钟功夫，多数颗粒便附着并固定于玻璃载片和护罩玻璃的表面。最丰富的是蓝色颗粒。然后我们发现，当用一细小探针挤压护罩玻璃上某点时，受挤压区域中的颗粒永久地由它们原始的蓝色改变颜色(散射光探测)。在受挤压区域中心，颗粒是红色的。此中心点被不同颜色的同心圆所围绕。自此中心向外，颜色从红色到绿色、黄色、蓝色变化。红色、绿色和黄色颗粒非常明亮。我们所作的理论计算表明，小的银颗粒呈蓝色。挤压的效果好象是改变了颗粒的形状。我们的结果因之表明，小的银颗粒通过改变其形状，其原始的蓝散射光颜色能转换为其它的散射光颜色。通过移动护罩玻璃，我们发现，我们能将受挤压区域中的带不同颜色的颗粒分散到液相中去。在此相中，颗粒作布朗运动，被绿色及红色颗粒散射的光是闪烁的，这对非球形颗粒是在预料之中。实施例15将24mg的盐酸羟胺加到1ml无菌水中，搅拌，然后经连接于一10ml的注射器的4μ聚碳酸酯膜过滤器过滤，制得盐酸羟胺溶液。将2.5ml无菌水加到在一试管中的0.1g HAuCl4·3H2O里，搅拌，然后用离心分离方法去除颗粒状物质。制得4％的HAuCl4·3H2O溶液。将25ml无菌水加进一250ml的锥形烧瓶中，跟着，根据所希望得到的颗粒尺寸，按表1显示的量加入16nm金颗粒。下一步我们按表1给定的量加入4％HAuCl4·3H2O溶液。最后，我们加入无菌水使总体积为100ml。然后，按表1所给定的量加入盐酸羟胺溶液同时用手快速搅拌，并使混合剂静置(sit)30分钟。在加进盐酸羟胺后片刻，溶液便从透明、稍微粉红色变成最终的透明红色或暗褐色，这依赖于颗粒尺寸。较小的尺寸给出红色溶液。
表1
更大直径的颗粒可按上述相同的过程制备，但是使用溶液的规定量描述于表2，并且采用直径为100nm的金颗粒溶液而不16nm金溶液。
表2
实施例16-由16nm金颗粒制备包被有银层的颗粒将25ml无菌水加到一250ml锥形烧瓶中，跟着加入6.4ml 0.005％的16nm金颗粒溶液并将最后得到的溶液搅拌。然后加入0.234ml40mg/ml L(+)乳酸银盐溶液。立刻便能看见深紫色。加入足够的无菌水使总体积为100ml。用手快速搅拌的同时，加入1.25ml 24mg/ml的盐酸羟胺溶液，最后得到的溶液呈现淡紫银色。将一小滴此溶液置于玻璃载片上，用盖玻片盖住，并在DLASLPD条件下用光显微镜观察。能看到红色的、绿色的、紫色的和黄色的颗粒。这些颗粒的稀释溶液在一试管中用白光照明时，其散射光为冰蓝色。实施例17-包被有BSA玻璃载片的制备建立一个模型系统以研究信号和颗粒各种组合的探测参数以及探测固相上颗粒的照明及探测方法，正如固相分析中一样。
这系统包括，首先用牛血清白蛋白(BSA)包被于玻璃载片，然后沉积不同量的金颗粒于特定区域以研究各参数。这里我们讨论我们用来将BSA包被于载片的方法。
将1.5g BSA加到15ml无菌超纯水中搅拌然后将此溶液用一0.44mm的聚碳酸酯膜过滤，制得10％的BSA水溶液。将20μl的此10％BSA溶液加到10ml无菌水中并将此BSA溶液经一0.4mm的聚碳酸酯膜过滤，制得0.02％的BSA(200μg BSA/ml)溶液。
用蘸有甲醇的刷子擦洗，将普通的显微镜玻璃载片弄干净。擦洗后，利用塑料喷射瓶用无菌水喷射载片以清洁载片。将此载片浸没于一盛有0.02％BSA无菌水溶液的烧杯中并培养一小时，玻璃载片便包被上BSA。然后，将载片从烧杯中取出并用喷射器中的无菌水喷射漂洗。载片两面均漂洗。然后将此载片浸没于盛满无菌水的150ml烧杯中约10分钟。再次喷水漂洗。将游离BSA从载片上去除是很重要的，因为游离BSA阻碍金属颗粒结合于有包被层的载片。然后将包被有BSA的玻璃载片弄干并干燥保存于一干净的塑料盒中。实施例18-沉积金颗粒于BSA载片上用金刚石划线器在包被有BSA的玻璃载片上划些小圆圈(直径约8mm)以对沉积金颗粒的区域作标志。3μl未加保护层的含所需金颗粒浓度的金颗粒溶液沉积于载片上已作标志的其中一块区域上。金颗粒溶液沉积于实际的刻划标志的反面以避免金颗粒溶液与刻划标志相互作用。
为在玻璃载片上制备一系列的金颗粒斑点，并且此处金颗粒密度有次序地降低，这需要使这系列斑点在载片中心成一直线。为达到这种排列，我们将载片固定在我们制作的一个支架上，这使得我们能沉积金斑点成正确的排列。应该指出，这些斑点在室内光线下看不见(即是，颗粒密度太低以致它们在室内光线下没有颜色)。我们就因此原因需要在载片的那面作标志以鉴别斑点的位置。制作标志是因为我们要沉积颗粒。为形成一颗粒斑点，我们沉积3μl未加保护层的已稀释到所需浓度的金溶液。然后载片在一封闭的塑料盒里培养一段规定的时间。盒内壁和盒底用湿纸巾包被以防止载片上金溶液蒸发。然后取出载片并用一巴斯德吸管喷射无菌水漂洗。我们已发现，为使金颗粒以最大效率结合于载片上的BSA，金颗粒溶液的pH值应调节到BSA的PI值(PI=4.58～5.45)。实施例19-微阵列分析性分析-结合包被有BSA-生物素的60nm金颗粒于塑料基片上分立个体的直径80微米的链霉抗生物素蛋白斑点制备下面的溶液，将2mg的BSA-生物素加到2ml无菌水中制成1mg/ml的BSA-生物素溶液并在室温下一个500ml锥形烧瓶中以蒸馏水为背景透析。水需更换4次。最后那次更换用无菌水。20mM的Tris-盐水，0.1％的PEG化合物，0.02％的叠氮化钠pH值为7.4的缓冲溶液也已制备。所有溶液均经0.4μ的聚碳酸酯膜过滤器过滤。聚苯乙烯试管利用喷射器用无菌水清洗好，倒入4ml直径为60nm的金颗粒溶液并在分析离心器中离心分离半小时。
然后，如别处描述的那样清洗颗粒。柔软的球粒在10ml无菌水中重悬浮。
金溶液的pH值调节如下。将100μl 1％的PEG化合物溶液加进一千净的聚碳酸酯试管中。再加入lml 60nm金溶液并培养2分钟。0.02M的K2CO3以2μl递增形式加到金溶液中直到pH值为6.6。然后计算出调节剩下的金溶液pH值所需0.02M K2CO3的数量并加进金溶液中。在本例中其数量为80μl。将9.5ml pH值为6.6的金溶液加到聚碳酸酯管中的1.15ml 1mg/ml的BSA-生物素溶液中，并在室温下培养5分钟。随后将此溶液在分析离心器中作离心分离半小时，于是浮在表面的东西被倒出。剩下的柔软球粒在3ml无菌水中重悬浮并如前述一样作离心分离，倒出浮在表面的东西，并重悬浮于0.1％的PEG化合物溶液中，再作离心分析。倒出浮在表面的东西，球粒重悬浮于20mM的Tris-盐溶液，1％PEG化合物溶液中并作离心分离，于是倒出了浮在表面的东西，留下约200μl的柔软球粒。将50μl的此溶液加进包含有直径为80μ的链霉抗生物素蛋白斑点的塑料孔中，并使孔在一潮湿的盒(chamber)中培养一个晚上。然后利用巴斯德吸液管用无菌水喷射清洗数遍并去除孔中的水。为使用显微镜探测，孔中装有60μl无菌水。实施例20-探测结合在包被有直径为80微米的链霉抗生物素蛋白结合位置的微阵列上的包被有BSA-生物素的60nm直径金颗粒将BSA-生物素-金结合剂的悬胶液(60nm金颗粒)加到塑料孔中，此孔底表面含有直径为80μ的链霉抗生物素蛋白点的微阵列。经合适的培养时间后，清洗此孔并在DLASLPD条件下用我们所发展的光显微系统观察。我们观察到标记有BSA-生物素-金的颗粒结合于个体的80μ点上。80μ的链霉抗生物素蛋白点在加入颗粒前是看不见的，现在呈现为明亮的、相当圆的点。培养不同时间或使用不同的BSA-生物素-金浓度，可以得到包含不同密度BSA-生物素-金颗粒的个体点。利用我们的放大倍数约为200×的显微镜，我们能很容易用眼探测到，结合于链霉抗生物素蛋白点的低结合密度的个体颗粒。为了计数和从个体的80μ点来的总光强度自动化，我们试验视频图像处理软件，这是我们从圣地亚哥(San Diego)这里的一个公司24小时借助的。我们使用以下器材获取视频图像，一个昂贵的黑白视频摄像机，一个视频帧捕获器，和一台简易的台式计算机成像器(imager)，后者包被在阵列装置孔中的25个个体点。此软件能测量各个点的总光强度，也可测量各个体点的颗粒数目。例如，一标记有低密度BSA-生物素-金结合剂的链霉抗生物素蛋白点可以用此视频成像系统的颗粒计数模式分析。为得到信号相对于本底的一些概念，一块80μ直径的固相区域点不要用链霉抗生物素蛋白包被上，用来分析以确定本底。在此初步的模型系统中，在非最佳照明和探测条件下，当点上标记密度约为0.06颗粒/μ2时，其信号/本底为317/25～13。基于此非最佳初步数据，这些数据暗示当信号/本底为3/1时，颗粒密度为0.015颗粒/μ2是可探测的。在更佳的条件下，灵敏度的较低等级会更低。实施例21-薄膜上金颗粒的探测灵敏度60nm金溶液以倍数10稀释，将20μl各稀释液沉积于包被有BSA的载片上形成点。载片不加盖玻片，置于油浸的Porro棱镜上。各个金溶液点直径约为4mm。下表给出各点上的相应信息。
*用眼探测下面用临床分析应用中更为有意义的单位表达出上面的数据。点上液体的高度可用此表达式算出h=V/A此处V为点上液体的体积(20ml=0.02cm3)而A为点的面积(以cm2作单位)。取A=1.2cm2，我们得h=0.016cm=160μm。此高度远小于眼或我们的电子的和光学的探测方法的景深，因此各个点表现得(从几何观点看)好象所有颗粒均在载片表面上，表中报告的灵敏度与所期望的颗粒沉积于表面的灵敏度相似。
*用眼探测#此栏由每点上颗粒数除以点面积而算得。实施例22-60nm金颗粒沉积于包被有BSA的玻璃载片表面制成一系列60nm金颗粒溶液的稀释液，并将3μl的各稀释液沉积成小点于包被有BSA的载片上。这些点在同一载片上排成一排。载片在一潮湿盒中培养6.5小时，然后用无菌水漂洗。各点上的颗粒密度可在DLASLPD条件下通过颗粒计数在一光显微镜中确定，此显微镜有一带已校准的标度线(reticle)的目镜。下面显示出我们的结果。
沉积浓度所沉积的颗#每100微米2区域号码 颗粒/ml*粒的总数目上的颗粒12.3×10102.3×10846022.1×1092.1×10741.837×1087×10613.943.5×1083.5×106751.75×1081.75×1063.4868.75×1078.75×1051.74*沉积浓度为置于一点上的未加保护层的金溶液浓度。
#每平方微米颗粒数-这给出了每100平方微米上的颗粒数目，如果沉积于某特定区域上的溶液中所有颗粒变得附着于载片上的话。溶液包被的区域其直径约为8mm。其面积为A=3.1416*(·4)2cm2=0.5cm2=0.5×108μm2。
6.5小时后，轻轻地喷射无菌水于载片上各个包含金的区域以清洗载片。和冷档的热枪(heat gun on cold setting)使载片干燥。在DLASLPD条件下用一光显微镜观察已干燥的载片，各区域上的颗粒密度用显微镜目镜上已校准的标度线计数颗粒/标度线方格(reticle square)而确定。下表显示了结果。
沉积的颗粒 用标度线计数的颗 每100μm2上样品目测(Eye)*/100μm2粒(面积，μm2)#计数的颗粒1 非常强黄绿色460 20**(39) 51.22 强黄绿色 41.87(39) 183 相当强黄绿色 13.9 13(100)134 没有探测到强度7 0 05 没有探测到强度3.48 0 06 没有探测到强度1.74 0 0*目测-这是在DLASLPD条件下用显微镜照明器激发并从载片特定区域上的金用眼观察的光强。**此区域中的颗粒数目太多以致很难计数，列出于此处的计数其误差可能有2×那么大。# 列出于括弧中的面积是用于颗粒计数的物镜和其它光学装置中1个标度线方格的面积。
实施例23-60nm金颗粒的小液体点强度的目视探测灵敏度制备3.4×10-12M(0.005％金)60nm金溶液的两个稀释液，2ml的各个稀释液沉积于玻璃载片上分立的点上。各点直径约为4mm(面积=6.28×106m2)。不同的点在同一载片中间成一排。各点中颗粒浓度和密度显示于下表。
金溶胶M 颗粒/ml 颗粒/μl颗粒/μ23.4×10-12M 2.1×1092.1×1060.311.05×10-12M 1.05×1091.05×1060.1550.5×10-12M 0.5×1090.5×1060.0770.25×10-12M 0.25×1090.25×1060.0385为了从用肉眼探测到的散射光强度中确定最低的颗粒密度，我们通过浸没油将载片置于一个Porro棱镜上。各点仍是液态，用在光纤末端带有×10物镜的Baush-Lomb照明器来的光顺次照明。照明器产生的点直径约为4mm。在暗室中，夜里，我们能看到小至0.0385，尽管后者刚好仅仅能看到。实施例24-光电二极管探测Immulon Plastic microtitier孔中不同浓度的60nm金颗粒(在悬胶液状态下)的灵敏度60nm金溶液的不同稀释液置于不同的Immulen孔中(每孔200μl)。为探测散射光强度，孔的底部用从安装有×10物镜的Leica显微镜照明器来的白光照明。孔的底部离物镜几毫米。光经过物镜后形成一光束聚焦于孔中心。焦点上光束直径约为5mm。散射光用一光电二极管探测，此光电二极管安置以探测从孔的侧壁探测光(直角探测)。散射光通过安置于光电二极管前的一个小孔(直径约1mm)探测以限制本底光探测。盛有不同金溶液稀释液的孔相互连接，并且各个孔可以顺次安放在照明和探测路径中。光电二极管的输出用一工作于电流模式的运算放大器测量。运算放大器的反馈电阻决定了此放大器的灵敏度。光电二极管工作于光伏模式(photovoltaic mode)。制备两份60nm金稀释液，用光电二极管测量强度。a．第一份稀释液母液(3.8×10-11M)以倍数2稀释。可以得到下面的读数。读数用运算放大器的反馈环中的一个5兆欧的电阻实现。
金颗粒浓度 强度(伏特数)1.9×10-11M3.270.95×10-11M 1.64.75×10-12M 0.892.38×10-12M 0.441.2×10-12M0.240 0.075b．第二份稀释液-×11的稀释溶液(3.4×10-12M)以倍数×2稀释。结果如下金颗粒浓度强度(伏特数)3.4×10-12M 0.6141.7×10-12M 0.3788.5×10-13M 0.1984.25×10-13M0.1472.13×10-13M0.1001.06×10-13M0.08600.075
上述结果表明，在孔中，我们能探测1.9×10-11M～1×10-13M的直径为60nm的金颗粒。此范围的上限可以拓宽。实施例25-沉积和目视探测(积分散射光强度)沉积于一包被有BSA的玻璃载片的60nm金颗粒的重复性(reproducibility将3μl 0.005％金(60nm)溶液的2×稀释液沉积于包被有BSA的载片上5个点的各点上。载片培养5分钟，然后放入一盛有150ml蒸馏水的烧杯中。这些水将未结合的金从载片上清洗掉。然后这些点用我们的照明器(白光Spectra Metrix照明器)照明。各点上的金颗粒以一个环的形式存在(即颗粒在这些点上分布不均匀但受限于一个环)，这种存在形式散射绿光，在暗室中用肉眼便能清楚地看到。
此实验用一新的包被有BSA的载片重复做，不同的是在培养金斑点的过程中，用手指轻敲载片边搅拌金颗粒点中的液体。5分钟后，将载片放到烧杯里的150ml无菌水中，各点的散射光利用白光SpectraMetrix照明器交替地观察。照明器在载片上产生一直径约5mm的光点。在金溶液沉积的地方，金颗粒通过散射光能清楚地看见。这些点通过将载片浸没在水中进行观察，这减少了载片上的不完整性的光散射。所有点均散射绿光并且用目视探测估计它们具有大致相同的强度。一个小的、非光散射的点(暗点)出现在各个点的中心。实施例26-不同金颗粒浓度下60nm金溶胶散射光的颜色用喷射瓶中无菌水漂洗六支8×50mm(1.6mL)的聚苯乙烯管。剩余的水通过抖动从各支管中去除，但不要把管干燥。然后将一金颗粒溶液(60nm,0.005％)顺次以倍数1、2、4、8、16和32稀释。各支管盛500mL金颗粒溶液。稀释了的金溶液在聚苯乙烯管中是稳定的(散射光长期不改变颜色)。没有凝聚作用的迹象。不同稀释液的散射光具有下面的颜色。用于此观察的金溶液用无菌水清洗数遍以去除盐(它们用于形成金溶液)，这些盐似乎使金颗粒不稳定。
4ml 60nm金溶液(0.005％,3×1010颗粒/ml)在离心器中以最大速度作离心分离，直到所有金颗粒沉积于管底(约30分钟)。去掉浮在表面的东西并以倍数1、2和4稀释柔软球粒。我们估计，柔软球粒的颗粒浓度约为3×1011颗粒/ml。4ml的各个稀释液沉积于包被有BSA的玻璃载片上分立的点上，并让各个点的液体在室温下蒸发。沉积于各点的颗粒数目(假定×1的金溶液其浓度为3×1011颗粒/ml)显示于下表。应当指出，采用60nm金颗粒(饱和单层颗粒)所能达到的最大颗粒密度为354颗粒/μ2。
稀释液 沉积的颗粒#颗粒/μ2*11.2×10910026×1085043×10825*用颗粒/μ2作单位的颗粒密度是针对直径为4mm(4×103μ)及面积为12.6×106μ2的点计算的。
#针对4μl 3×1011颗粒/ml的60nm金溶液的沉积层计算。
溶剂蒸发后，在室内光线和DLASLPD照明(当用肉眼观察时)下观察各点的表现。DLASLPD照明含有一个Leica显微镜照明器。此照明器有一×10的物方聚焦透镜，它产生一窄束光聚焦于离物镜约10mm远的地方形成一个小点。点也用DLASLPD方法通过显微镜观察，此显微镜带有×2.5、×10、×25和×40物镜并附加×1.25、×1.6和×2的放大倍数。用×10和×20物镜时，各点在一个时刻仅能看见一小区域。然而，用×2.5物镜则能看见整个点。为确定各点上的颗粒数目，我们数出经显微镜看见的在某给定面积上的颗粒数目，并将此数目除以面积。面积用安置于显微镜目镜的已用滑动千分尺校准的标度线确定。作为一个实施例，当颗粒计数用×40物镜和1.25及2的附加放大倍数(在目镜前)实现时，在目镜标度线上用于颗粒计数的单位方格分别为6.25μ×6.25μ(方格面积=39.1μ2)和10μ×10lμ(面积=100μ2)。这些是物平面上的面积。实施例29-在空气中观察高表面密度金颗粒点在本例中，按描述于实施例29制备的金颗粒点用DLASLPD照明作目视和显微观察。点是干燥的，金颗粒暴露于空气中。a．×1稀释液点在室内光线下，点呈现出暗紫色，其中心有个直径小于1mm的较淡的点。在DLASLPD照明下，这些点呈现相当均匀的稍带白的橙色。点的强度很高。在DLASLPD条件下，点在显微镜(×10物镜，额外放大倍数×2、12.5目镜)中通过目镜观察，有一很强的橙色。个体点很容易看得见。可以看到，有些颗粒相互之间靠得非常近甚至相互重迭。大多数颗粒是橙色的但有些是绿色的。两个或更多个点相互之间分开的距离小于或约等于显微镜的空间分辨率则看起来象单个颗粒。如果颗粒之间的距离近到足以干扰它们的光散射性质，则看起来象单个颗粒的颗粒群其颜色不同于单个颗粒的颜色。在高颗粒密度下，可从理论计算预期，许多颗粒分开的距离将小于显微镜的分辨率。当用×10或×20物镜观察时，点的表现无多大变化。载片上点之外的区域(本底)比起强度大的点来是非常暗的。采用×2.5物镜，能看到整个点。它呈现很强的橙色，在边缘有一个小绿环。在橙色区域，颜色看起来相当均匀，尽管相同的斑点似乎比其它要淡。颗粒的表面密度在绿环上比橙色区域低得多。b．×2稀释液点在室内光线下，点有一中度紫色的外环，其中心是一个约2mm的暗紫色点。在DLASLPD照明下，这些点呈现相当均匀的稍带白的黄色。点的强度很高。在DLASLPD条件下，点在显微镜(×10和×20物镜，×2额外放大倍数，12.5目镜)中通过目镜观察，有一很强的橙色，但此颜色没有×1稀释液那么均匀。有些斑点呈现淡绿色。距离靠得很近的颗粒能看得见。大多数颗粒是橙色的，但有些是绿色的，它们大量存在于绿色斑点中。当用×10或×20物镜时，点的表现并不多。比起强度大的点，点之外的区域非常暗。采用2.5物镜，能看到整个点。它呈现很强的橙色，在边缘有一小绿环。在橙色区域，颜色看起来相当均匀，尽管相同的斑点似乎比其它要淡。一些不均匀性起因于未作优化的照明系统的不均匀性。c．×4稀释液点在室内光线下，点有一很淡的紫色，带有一个已偏移(displaced)到圆环一边上的小暗点(直径约1mm)。在DLASLPD照明下，这些点呈现相当均匀的稍带白的绿色。点的强度很高。在DLASLPD条件下，点在光显微镜(×10物镜，×2额外放大倍数，12.5目镜)中显得极不均匀，这很可能是溶剂蒸发不均匀所致。点的中心有很强的橙色或淡紫色。在此中心区域，颗粒之间靠得非常近甚至相互重迭，其中大多数颗粒呈橙色，一些呈绿色。远离中心之处，点呈现淡绿色，绿色颗粒占优势，还有一些橙色颗粒。从点的中心到边缘，交替出现绿色和黄色的环。比起强度大的点来，点之外的区域(本底)非常暗。采用×2.5物镜可以看见整个点。点呈现椭圆形，靠近中心有一个橙色或淡紫色的点(直径约1.5mm)。这围绕有交替出现黄绿色和绿色区域的强度高的环。边缘有一强度较低(但仍算强)的小环，呈明显的绿色。在此边缘区域，几乎所有颗粒都是绿色颗粒并能用×40物镜，额外放大倍数×2来计数。绿色颗粒区域中颗粒表面密度约为20颗粒/39.1μ2或0.5颗粒/μ2。当正好在边缘时，颗粒计数迅速降低，我们计数得约7颗粒/100μ2或0.07颗粒/μ2。此区域上颗粒的梯度使得我们能够作的颗粒计数高至约1颗粒/μ2的计数极限。对于空气中固定颗粒的结论a．上面所描述的步骤使我们以高表面密度喷镀金颗粒从而形成小斑点(4mm)。在室内光线下观察时，喷镀结果并非象对于我们用来形成斑点的蒸镀方法所期待的那样完全均匀。
b．用光学显微镜在DLASLPD条件下观察，1倍和2倍稀释斑点相当均匀。对于4倍稀释，斑点显示非均一性较高。
c．斑点的颗粒密度似乎太高，致使颗粒计数没有意义(颗粒相距太近，不能将其分辨为单个颗粒)。然而，在4倍稀释斑点的周边能够对颗粒进行计数，并且此处的颗粒密度大约为0.5颗粒/μ2。这样的颗粒密度接近在我们所用显微镜分辨率下所能计数的最大颗粒密度。实施例30-利用水中高表面密度金颗粒进行观察在实施例30中所用的载玻片浸入一烧杯内150ml的无菌水中。颗粒似乎未从载玻片上脱落，使用10倍物镜作为显微镜照明器，可以使一束细光对浸入水中载玻片上的每一个金斑点分别进行照明。斑点的颜色(用裸眼观察)似乎在从空气到水的过程中未见改变。将玻璃载玻片从烧杯内的水中取出，并用盖玻片包被。一薄水膜围绕着金颗粒。显微镜观察如下述。a.1倍稀释斑点使用一光学显微镜，其物镜为2.5倍，附加放大倍数为1.25倍，目镜为12.5倍，在DLASLPD条件下观察时，斑点呈现相当均匀的橙淡紫色。斑点的周边含有明亮的、黄绿色颗粒。使用10至40倍物镜可以容易地在周边看见颗粒。斑点上各处甚至在周边上的颗粒表面密度很高，而在周边外沿一很窄的环处，可以容易地看到明亮物体般的单一颗粒。b.2倍稀释斑点使用2.5倍物镜，1.25倍附加放大倍数，及12.5倍目镜，可以观察到完整颗粒。总体上来说，斑点呈现很强的黄色并且似乎是相当均匀的。斑点的大部分为黄色，但朝向周边处斑点呈黄绿色。使用40倍物镜和1.25倍附加放大倍数，可以看到具有极高表面密度的颗粒。大多数颗粒呈黄绿。一些颗粒呈绿色或红色。除了在周边处，斑点具有十分相当均一的密度，而在周边处的颗粒密度十分迅速地下降为零(暗背景)。在周边处由于颗粒表面密度很低，单一颗粒之间存在暗区，所以可以容易地看到单一颗粒且计数。c.4倍稀释斑点使用2.5倍物镜和1.25倍附加放大倍数，可以看到完整斑点。斑点呈极强的黄绿色且该颜色十分均匀，与此形成对照，当在空气中观察时，斑点上具有很多绿块。使用40倍物镜和1.25倍附加放大倍数可以容易地观察到单一颗粒。与在空气中相比，处于水中的颗粒其颜色强得多或亮得多。周边的颗粒绿色不显著，但在水中大多数颗粒呈黄绿色，还有一些红色和橙色的颗粒。大多数斑点呈极强的黄色。使用40倍物镜可以看到单个颗粒，但是颗粒很密且有重叠。在斑点的最强区内，使用40倍物镜和2倍附加放大倍数所观察到的颗粒，其密度约为25颗粒/39.1μ2或约为0.6颗粒/μ2。这样的数值可能并不代表真正的颗粒表面密度，这是由于显微镜分辨率局限所致。对于由水包被的固定化颗粒的结论将金斑点置入水中似乎使其均匀性提高。调整光学显微镜的照明，使之处于DLASLPD条件下(载玻片置于棱镜之上且两者之间由浸没油耦联)，当用裸眼观察时，2倍和4倍稀释的斑点似乎均呈黄色。对于裸眼而言，1倍稀释的斑点似乎为橙色。实施例31-60nm金-牛血清白蛋白(BSA)-生物素反应剂与磁珠结合本实施例显示了我们通过对悬液光散射强度的测量从而探测金颗粒与磁珠的特异性结合且定量化的能力，以及利用光学显微术在DLASLPD条件下探测与磁珠结合的单个金颗粒。
60nm金颗粒由BSA包被且BSA被生物素共价标记(BSA-生物素-Au)。含0.1％BSA pH7.4的磷酸盐缓冲液500ml加入5支微离心管内。5支离心管分别标记为0、1、2、3、4。BSA-生物素-Au溶液加入每一管内，使金颗粒浓度为3.8×10-11M/L且振摇每管。再次加入BSA-生物素-Au溶液，使每管内金-BSA-生物素颗粒的浓度达到8×10-13M/L。μl量的磁珠浓度为6.7×108Dyna磁珠/ml(10mg/ml)或约1×10-12M/L的Dyna磁珠M280链霉抗生物素蛋白(表面与链霉抗生物素蛋白共价连结的直径为2.8μ的磁珠)悬液溶于含0.1％BSA和0.02％NaN3的pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入每管。
管号 μl磁珠浓度 生物素浓度 金-BSA-生物素浓度00 0015 1×10-14M 3×10-8M8×10-13M210 2×10-14M 6×10-8M8×10-13M315 3×10-14M 9×10-8M8×10-13M420 4×10-14M 12×10-8M8×10-13M每支管在室温下温育30分钟，然后从0号管开始一次一管，分别将每管放入MPC-E/E-1磁颗粒浓缩器内从溶液中分离磁珠。2分钟以后，小心取出上清液；管子仍留在磁分离器内。将上清液置入一只1ml的微培养管内。第5号管留在磁浓缩器内5分钟，其它管2分钟。利用SpectraMetrix光度计测量上清液的散射光强度，测量条件为电阻器PM输出0.1MΩ；激发边滤波器橙色滤片CS3-67；10倍中性密度衰减器未用。
散射光强度测量结果如下管号 强度0 1.21V1 1.042 0.6443 0.494 0.362将上清液分别倒回对应的，含磁珠的管内，然后再次温育2个小时。2小时后按上述步骤处理各管，得到上清液的下列散射光强度管号强度(V) 归一化强度金颗粒结合比值0 0.8551.2101 0.6040.850.32 0.3820.540.553 0.3260.460.614 0.2060.290.76
再次温育2个小时并未引起金BSA-生物素与磁珠之间的更大结合。
将一滴结合金颗粒的磁珠悬液滴在显微镜玻璃载片上并且用盖玻片盖住。用一光学显微镜在DLASLPD条件下，检验该载片。作为强散射物体，磁珠可被容易地看到；但是由于较大磁珠的强散射，要看到磁珠上的金颗粒是比较困难的。然而，如果将水介质换成折射率约为1.4至1.5的油性介质，就可以比较清楚地看到金颗粒。此外，如果将照明光束相对垂直于载片的方向倾斜较高的角度，也可以比较清楚地观察到金颗粒。实施例32-核酸与40nm直径金(Au)颗粒标记核酸杂交的探测1．化学活化聚乙二醇胺包被金颗粒的制备用于核酸与金颗粒结合的反应氨基按以下方法制备。利用实施例12中所述步骤，将40nm金颗粒用双(聚氧乙烯双〔3-氨基-2-羟基丙基〕)聚乙烯化合物包被。这导致产生聚乙烯化合物薄层包被的40nm直径金颗粒。该薄层含有化学活性的氨基，用于核酸和颗粒的结合。2．制备与40nm直径金颗粒结合的核酸对多聚胞苷酸(Poly(C))和多聚次黄苷酸(Poly(I))的均一高聚物进行以下化学修饰。0.8mg和1.3mg的Poly(I)和Poly(C)分别置入两支试管内。在每支管内加入1.0ml用pH 8.5咪唑缓冲液配制的0.1M/L1-乙基-3,3-双甲氨基丙基碳化二亚胺(CDI)溶液且温育1小时。然后利用乙醇沉淀法将核酸沉淀并在杂交缓冲液中(20mM Tris-HCl,100mM NaCl,1mM EDTA pH7.6)重悬。3．活化核酸与活化金颗粒偶联应用同样方法制备Poly(I)和Poly(C)。对于50μl的核酸溶液加入20μl的40nm-Au-PEG活化的颗粒溶液以及100μl的Hepes0.2M pH8.0并且在50℃下温育1小时。反应后，Poly(C)和Poly(I)与40nm Au-核酸结合物通过离心收集，洗涤，且在杂交缓冲液中重悬。4．杂交实验按下述方法研究核酸-40nm金颗粒结合物(40nm直径金颗粒表面高聚物包被与核酸共价结合)的杂交性质。利用光学显微镜DLASLPD方法。使用图9所示的玻璃载片-液体-盖片实验装置。在载片上滴一滴Poly(C)-Au颗粒结合制备液并且用盖片盖住。一滴浸没油滴在显微镜聚光器上，然后将载片置于聚光器上。使用10倍物镜。溶液看来相当均匀，并且可以观察到Poly(C)-Au颗粒结合物在视野中浮动。与我们对未用核酸标记的40nm金颗粒进行观察所得的结果相比，Poly(C)-Au颗粒结合物的布朗运动看来较小。一些Poly(C)-Au颗粒看来附着于玻璃载片表面上。存在一些Poly(C)-Au颗粒的聚集物，大多数为2至4个Poly(C)-Au颗粒。当在视野中浮动时，这些聚集物以一整体运动。在我们观察载片几分钟内，我们注意到附着于载片表面的Poly(C)-Au颗粒密度在增加。来自Poly(C)-Au颗粒的散射光颜色为绿色。取下盖片，在载片上含Poly(C)-Au液滴的区域附近滴一滴Poly(I)-Au制备液。使用一金属探针从Poly(I)-Au液滴拉出一液体形成的线条至载片上含Poly(C)-Au的区域以连接两个斑点。然后盖上盖片，将载片放回显微镜上并观察。我们观察到随着时间多Poly(I)-Au-Poly(C)-Au颗粒聚集物的数目在增加。大约20分钟后，我们扫描载片并且观察到单个颗粒的数目很少，大多数颗粒形成由几个颗粒组成的聚集物，很多聚集物附着于载片上。这些聚集物看来具有确定的形状，即似乎这些颗粒聚集物的装配遵循一特定方式一些看起来象随机缠绕线形成的管子，其它的象带分枝的链网络。观察对照Poly(C)-Au载片显示聚集物数目很少，与之相比，上述这些多聚集物的外形非常不同。我们切换到40倍物镜。对于一些聚集物，有些颗粒的颜色看起来黄色比绿色强。然后我们取下含Poly(Au)-Poly(I)-Au反应的载片的盖片，在载片上加一滴10-5M/L的溴化乙锭且盖上盖片。我们观察到来自载片上颗粒聚集物的微弱橙色，即颗粒的绿色和黄绿色看起来象是位于微弱橙色背景之上。在聚集物之外的区域未观察到橙色。这微弱的橙色向我们表明接近或在颗粒聚集物内部存在核酸的双链结构。我们将此解释为Poly(C)-Au结合物与Poly(I)-Au结合物的杂交。取出载片，在镜下观察含一滴Poly(I)-Au的对照载片。与对照Poly(C)-Au载片类似，我们对该载片进行了观察。与Poly(C)-Au对照载片相比，Poly(I)-Au载片上小聚集物的数量约为前者上的2倍。散射光的颜色为绿色，而一些聚集物呈黄绿色。
在这特定的方式中，两条互补链均用金颗粒标记。由于互补链杂交，更多的颗粒聚集物产生。探测来自金颗粒或类似颗粒的散射光可以检测核酸的结合。当2个或2个以上的金颗粒相互很接近时，散射光的颜色亦可能变化。散射光颜色的变化亦可用来作为检测结合事件的一种方式。应该指出的是可以利用光散射能力强的金颗粒或者任何其它颗粒以许多不同方式检测核酸的结合，或者以单一或多步骤分析方式检测任何其它配体受体对。实施例33-金颗粒与大聚苯乙烯珠结合的探测我们在一玻璃显微镜载片上滴一滴生物素包被的，直径约为2微米的球形聚苯乙烯溶液并在DLASLPD条件下用光镜观察。可以容易地看到聚苯乙烯颗粒如同明亮的白光点源。然后我们在聚苯乙烯颗粒液滴上滴一滴由链霉抗生物素蛋白包被的，直径为60nm的金颗粒制备液并在电镜下观察。可见明亮白色的聚苯乙烯颗粒且可观察到在聚苯乙烯颗粒周围微弱的黄绿色光晕。我们对载片上的溶液进行蒸发，然后在此制备物上滴一滴显微镜浸没油且在显微镜下观察。可以容易地看到单个金颗粒和黄绿金颗粒的大圆环区。聚苯乙烯颗粒看起来几乎象是一个暗或黑的点，其周围由一黄绿色的光晕或环围绕。本方法可用来检测金颗粒或其它金属样颗粒与固体颗粒物质，小固相物，如玻璃珠或其它珠，以及生物细胞等的结合。实施例34-聚乙烯化合物包被的金颗粒光散射性质使用直径约为100nm的金颗粒。该金颗粒由柠檬酸盐方法制备。此溶液的一部分放置在另一容器内，并且利用其它地方所述的步骤，用聚乙烯乙二醇复合物(MW=20,000)包被金颗粒。
为了比较包被和未包被颗粒的散射光，将样品放入水中稀释直至溶液出现微弱的粉红色。利用SpectraMetrix光度计获得样品的散射光强度与入射波长关系曲线。
为了进行这些测量，光源和样品之间放置一单色仪。调整单色仪设定，从400nm至700nm，每隔10nm收集散射光数据。利用校正曲线对数据进行波长依赖单色仪和作为波长函数的光探测器变化方面的修正。通过使用12nm二氧化硅颗粒来得到校正曲线。利用校正曲线对数据进行分析。该数据如图16所示。
此数据表明包被和未包被的100nm金颗粒具有非常相似的散射光强度随入射波长变化曲线。因此，许多不同类型的大分子物质，如抗体、核酸、受体或类似物质，可以被包被在颗粒表面，且对散射光性质不产生明显改变。
其它实施方案在下列权利要求内。
权利要求
1．特异性检测样品中的一种或多种分析物的方法，包括如下步骤将所述样品中的任何一种或多种分析物与一种散射光可探测颗粒特异性地连接起来，在一定条件下用光照射与所述分析物连接的任何所述颗粒，在该条件下可从所述颗粒产生散射光并且可在小于500倍放大并无电子放大的情况下肉眼检测到所述一种或多种颗粒的散射光，以及作为对所述一种或多种分析物存在的量度而在所述条件下检测任何所述颗粒的散射光。
2．权利要求1的方法，其中当用所述人眼观察和白光照射时，所述颗粒的大小适于产生特定颜色的光。
3．权利要求2的方法，其中所述特定颜色光的颜色提供了作为对所述一种或多种分析物的存在或多少的一种测量。
4．权利要求1的方法，其中所述检测包括作为对所述一种或多种分析物浓度的测量而进行的对散射光强度的测量。
5．权利要求1的方法，其中所述检测包括作为对所述一种或多种分析物浓度的测量而进行的对散射光颜色的测量。
6．权利要求1的方法，其中当用人眼观察并用白光照明时，所述颗粒的组成适于产生特定颜色的光。
7．权利要求1的方法，其中所述颗粒与固相结合分析物相连接。
8．权利要求1的方法，其中在所述检测步骤中，所述颗粒在一种液相中。
9．权利要求1的方法，其中所述分析物结合于固相。
10．权利要求1的方法，其中所述分析物在液体溶液中是游离的。
11．权利要求1的方法，其中所述样品为微阵列或阵列芯片，包含有分立的区域，每一区域包含所述一种或多种分析物。
12．权利要求1的方法，其中所述的光是多色白光。
13．权利要求1的方法，其中单色光源可用于提供所述的光。
14．权利要求1的方法，其中所述方法包含提供许多不同颗粒，用人眼观测时，每一种颗粒有不同的视觉表现。
15．权利要求1的方法，其中所述颗粒被用于均一分析，其中两种或两种以上的颗粒相距足够近，使得任何一个颗粒的光散射特性发生变化，其中所述的变化就是检测所述一种或多种分析物存在的测量。
16．权利要求1的方法，其中所述颗粒被用于检测，以及两种或两种以上的颗粒相距足够近，使得两个或两个以上颗粒的光散射特性能从单颗粒中分辨出来，所述光散射就是对所述一种或多种分析物存在的测量。
17．权利要求1的方法，其中所述颗粒被用于均一检测，以及两种或两种以上颗粒相距足够近，使得两种或两种以上的颗粒的光散射特性能从单独颗粒中分辨出来，所述光散射就是对所述一种或多种分析物存在的测量。
18．权利要求1的方法，其中所述颗粒被用于均一检测，其中彼此相邻的两个或两个以上颗粒分离，会导致任何一个颗粒的光散射特性发生变化，其中所述变化是所述一种或多种分析物存在的测量。
19．权利要求1的方法，其中所述颗粒被用于均一检测，其中两个或两个以上颗粒通过一种或多种分子互作用联系在一起，其中保持颗粒结合在一起的分子相互作用遭受破坏，会使一个颗粒或多个颗粒从分子的相互作用中分离出来，其中所述的分离就是对所述一种或多种分析物存在的测量。
20．权利要求1的方法，其中所述颗粒是金颗粒或银颗粒。
21．权利要求1的方法，其中所述颗粒大小为1纳米～500纳米。
22．权利要求1的方法，其中所述光经棱镜或其它光导系统照射到所述颗粒上。
23．由至少一种光散射材料构成的可特异性检测的金属样光散射颗粒群，所述颗粒在其表面上包括至少一种其它材料以提供化学稳定性和赋予所述颗粒结合分析物的能力，其中所述颗粒群颗粒大小足够均匀，这使得在所述颗粒群中的单个颗粒的一种或多种特异性散射相似。
24．权利要求23的颗粒，其中所述颗粒是由选自金属、金属化合物、金属氧化物、半导体及超导体的材料构成。
25．权利要求23的颗粒群，其中所述颗粒为混合组分，包括作为所述组分一部分的金属样材料。
26．一种特异性可检测光散射颗粒制剂，其由选自金属、金属化合物、金属氧化物、半导体及超导体直径为1纳米～500纳米的至少一种光散射材料构成，其中该颗粒制剂含有一种适合于结合颗粒表面和结合结合剂的基本分子，该颗粒制剂能结合分析物。
27．权利要求23和26的颗粒群或颗粒，其中所述颗粒有一包被层，该包被选自聚合物、无机材料、有机材料、蛋白质样材料、基本分子材料及结合剂。
28．权利要求23或26的颗粒群或颗粒，其中所述颗粒为球形。
29．权利要求28的颗粒群或颗粒，其中所述颗粒是椭圆形或椭球形。
30．权利要求29的颗粒群或颗粒，其中所述颗粒是非对称性的。
31．权利要求23或26的颗粒群或颗粒，其中所述颗粒有一个变化系数小于5％的粒度大小分布。
32．权利要求23或26的颗粒群或颗粒，其中所述颗粒有一个变化系数小于10％的粒度大小分布。
33．权利要求23或26的颗粒群或颗粒，其中所述颗粒有一个变化系数小于15％的粒度大小分布。
34．权利要求23的颗粒群，其中所述颗粒含有金。
35．权利要求23的颗粒群，其中所述颗粒含有金和银的混合组合。
36．权利要求23的颗粒群，其中所述颗粒由银和磁性物质或铁电材料组成。
37．权利要求23的颗粒群，其中所述颗粒由金和磁性物质或铁电材料组成。
38．权利要求23的颗粒群，其中所述颗粒由金属样材料和磁性或铁电材料的混合物组成。
39．权利要求23的颗粒群，其中所述颗粒是由有表面包被的金组成，该包被选自聚合物、蛋白、核酸，无机化合物和有机化合物、基本材料分子、结合剂、并且其中所述颗粒直径为10纳米～50纳米，当用白光照射时产生绿色散射光。
40．权利要求23的颗粒群，其中所述颗粒是由有表面包被的金组成，该包被选自聚合物、蛋白、无机化合物和有机化合物、基本材料分子、结合剂并且其中所述颗粒的直径为50纳米～70纳米，用白光照射时产生黄绿色至黄色散射光颜色。
41．权利要求23的颗粒群，其中所述颗粒是由有表面包被的金组成，该包被选自聚合物、蛋白、无机化合物、有机化合物、基本材料分子、结合剂，所述颗粒的直径为70纳米～120纳米，用白光照射时产生桔黄色到桔红色散射光颜色。
42．权利要求23的颗粒群，其中所述颗粒是由有表面包被的金组成，该包被选自聚合物、蛋白、无机化合物、有机化合物、基底材料分子、结合剂、所述颗粒的直径大于120纳米小于1微米，用白光照射时产生桔黄色到桔红色的散射光颜色。
43．权利要求23的颗粒群，其中所述颗粒是由有表面包被的银组成，该包被选自聚合物、蛋白、无机化合物、有机化合物、基底材料分子、结合剂、所述颗粒的直径为5纳米～50纳米，用白光照射时产生兰色散射光颜色。
44．用于分析固相样品的装置，包括成一定角度的光源，此光源的光照射到所述样品上，使得从结合在样品上任何颗粒发出的散射光能最大限度地被探测到，其中所述设备的构建和组装能使任何与所述样品连接的任何颗粒在一定条件下被光照射到，该条件是可从所述颗粒产生散射光并且在小于500倍的放大和无电子放大的情况下可用人眼观察到所述一种或多种颗粒的散射光。
45．权利要求44的装置，其中集光透镜探测器被置于样品散射光前向包络的外部。
46．权利要求44的装置，包括一个备有必要的设置和装配起来用于检测所述散射光的计算机软件和硬件的颗粒计数器。
47．权利要求44的装置，其中一个集光透镜被安装在该装置上，且基本垂直于所述样品放置的表面。
48．权利要求44的装置，其中所述设备的构建和组装使其可以检测微阵列，其中所述微阵列分立区域的大小为10平方微米到1平方毫米。
全文摘要
特异性检测样品中一或多种分析物的方法。该方法包括特异性将样品中的任意一或多种分析物与光散射可检测颗粒相连接,用光在一定条件下照射与光相连的分析物,条件是颗粒可以产生散射光并且可以用人眼在小于500倍的放大和没有电子放大的情况下检测到一或多个颗粒的散射光。该方法还包括作为对所述分析物存在的检测而在上述条件下检测所述任意颗粒的散射光。
文档编号G01N15/14GK1223692SQ97195868
公开日1999年7月21日 申请日期1997年4月17日 优先权日1996年4月25日
发明者J·伊格拉比德, E·E·伊格拉比德, D·E·克纳, J·T·杰克森 申请人:斯佩克特拉梅特里克斯公司