一种肿瘤标志物的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种肿瘤标志物的检测方法，是基于SERS(表面增强拉曼散射)技术的免疫检测，首先在基底上固定抗体；然后加入抗原和偶联有抗体的拉曼探针，这样就在基底上形成了“固相抗体-待测抗原-标记抗体”三明治结构的免疫复合体；最后，对该免疫复合体进行SERS检测，即可高特异性的识别待测物的SERS信号。本发明被认为是一种具有良好发展前景的检测方法，该方法运用偶联有抗体的金属纳米粒作为SERS基底，可以实现高速、高敏感的检测。
【专利说明】一种肿瘤标志物的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种肿瘤标志物的检测方法。
【背景技术】
[0002]免疫检测是一种成熟的检测方法，可以应用于生化研究、临床诊断、食品安全和环境检测等领域。ELISA作为一种有效的筛查工具已经广泛应用于患者体内多种蛋白标记物的证实，这一技术允许对小体积样品中的多种标记物进行同时检测。和传统的检测方法相t匕，该技术具有高效、低成本和易于临床应用等显著地优点。但是该技术也有许多技术局限，比如在免疫测定中，为了鉴别一组特定的抗原-抗体，通常会用到分子标签的荧光检测方法，而该技术具有检测限高、光致褪色和不能重复检测等缺点。
[0003]本发明被认为是一种具有良好发展前景的检测方法，该方法运用偶联有抗体的金属纳米粒作为SERS基底，可以实现高速、高敏感的检测。本发明是基于SERS(表面增强拉曼散射)技术的免疫检测，首先在基底上固定抗体；然后加入抗原和偶联有抗体的拉曼探针，这样就在基底上形成了“固相抗体-待测抗原-标记抗体”三明治结构的免疫复合体；最后，对该免疫复合体进行SERS检测，即可高特异性的识别待测物的SERS信号。
【发明内容】
[0004]本发明的检测是在位于微流控芯片的微通道内的一个典型的三明治免疫复合结构上进行的。首先，用微量注射泵分别把通道内注射充满PBS (磷酸盐缓冲液)缓冲液。使用THF溶液(羧酸)对金表面进行了修饰，为了在该表面上固定抗体还需对其进行活化，即对其上的羧基进行活化。活化的实现，是将0.008mol/L的EDC (1-乙基_3_ (3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐)和0.012mol/L的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)混合溶液(V:V = 1:1)从进液口以3.lmL/min的流速经30min注射进入微通道进行的。活化完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除残余的EDC/NHS溶液。
[0005]然后，将10 μ g/mL的anti_XX抗体从进液口经15min注射入微通道，以使它们固定在微通道中经EDC/NHS溶液活化的金基底上。等ant1-XX抗体在金基底上固定好之后，经进液口向微通道注入1%的BSA(牛血清白蛋白)溶液，以封闭微通道中未被特异性结合的羧基。封闭完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除残余的BSA溶液。
[0006]第三步，将50 μ g/mL的anti_XX抗原经进液口以1.0mL/min的速度注射入微通道，随后将整个芯片培养30min。之后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除没有进行特异性结合的ant1-XX抗原。
[0007]最后，将0.008 μ mol/L 的 ant1-XX PcAb-4-MBA-HGNs 经进液口以 3.lmL/min 的流速用15min注射进入微通道，以形成三明治结构的免疫复合物。这一步操作完成以后即可选取SERS微流控芯片的微通道的任意位置进行SERS检测，而后借助软件或人工对所得SERS信号光谱进行分析以实现对待测物的定性、定量分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1是SERS微流控芯片示意图
[0009]图2是8条微通道的SERS信号图
【具体实施方式】
[0010]1、检测方法和步骤
[0011]首先需要制备具有ant1-XX PcAb_4_MBA (4_巯基苯甲酸)-HGNs (中空金纳米球)结构的SERS探针。在加入多克隆抗体ant1-XX这一步，分别加入CA153和CA125抗体制成ant1-CA153PcAb-4-MBA-HGNs 和 ant1-CA125PcAb-4-MBA_HGNs 两种 SERS 探针。
[0012]实验开始之前，需事先准备若干SERS微流控芯片，其中F、G、H三条微通道底面上溅射有金纳米颗粒，其结构示意图如图1所示。
[0013]对照品的准备。首先，关闭除A阀门以外的所有阀门，用微量注射泵将A通道注满双蒸水后关闭A阀门。然后，打开B阀门，用微量注射泵将B通道注满I %的BSA溶液后关闭B阀门。打开C阀门，用微量注射泵将C通道注满PBS溶液后关闭C阀门。最后，依次打开D、E两个阀门，用微量注射泵将与它们对应的通道依次注满ant1-CA153PcAb-4-MBA-HGNs和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs探针溶液后依次关闭D、E两个阀门。
[0014]待测样品的准备。对上述几种待测样品，严格按照上述步骤进行实验操作。首先，开启微流控芯片上的F、G、H三个阀门，用微量注射泵从进液口向对应的3条通道内注射PBS缓冲液至充满，而后将0.008mol/L的EDC和0.012mol/L的NHS混合溶液(V:V = I:1)从进液口以3.lmL/min的流速注射进入微通道对金基底活化30min。活化完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除残余的EDC/NHS溶液。
[0015]然后，依次打开F、G、H三个阀门，分别将10μ g/mL的anti_CA153、anti_CA125和ant1-Ab抗体从进液口经15min分别注射入微通道，以使它们固定在微通道中经EDC/NHS溶液活化的金基底上。等ant1-XX McAbs抗体在金基底上固定好之后，经进液口向微通道注入1%的BSA溶液，以封闭F、G、H三个通道中未被特异性结合的羧基。封闭完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对F、G、H三个微通道进行清洗，以清除残余的EDC/NHS溶液。
[0016]第三步，依次打开F、G、H三个阀门，分别将50 μ g/mL的anti_CA153、anti_CA125和ant1-Ab抗原经进液口以1.0mL/min的速度分别注射入对应的微通道，随后将整个芯片培养30min。之后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除没有进行特异性结合的ant1-XX抗原。
[0017]最后，打开F、G、H 三个阀门，将 0.008 μ mol/L 的 ant1-CA153PcAb-4-MBA_HGNs 和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs的混合液经进液口以3.lmL/min的流速注射进入微通道，以形成三明治结构的免疫复合物。这一步操作完成以后即可选取SERS微流控芯片微通道上的任意位置进行SERS检测，而后借助软件或人工对所得SERS信号光谱进行分析以实现对待测物质的定性、定量分析。
[0018]2、实验结果及分析
[0019]通过移动激光光斑到每一微通道上，在静态条件下检测SERS信号。每条通道上检测点应选取在离进液口或出液口相同距离的位置处。在试验中，使用了一个具有两个狭缝的光学结构来减弱未聚焦激光束的背景拉曼散射。在拉曼系统中，用入射狭缝和CCD(电荷耦合探测器)检测器上的像素配合从而取代了小孔的功能。设置第一聚焦狭缝的宽度为15mm。微通道中的三明治结构的免疫复合物的拉曼光谱用50倍物镜在共聚焦模式下检测。积分时间5000ms。
[0020]实验中分别设定SERS探针在微通道内的停留时间为2min、5min、lOmin、15min、20min,对选定点进行SERS检测，发现在2min时基本检测不到SERS信号，时间为5min及更长时可以检测SERS信号，且随着时间的延长SERS信号呈逐步增加趋势。这一结果说明，SERS强度受SERS探针的停留时间影响较为明显，即提供足够的接触时间以增加免疫复合体的装载密度。图2为对8条微通道进行SERS检测得到的谱图，其中F、G、H三个通道中SERS探针溶液停留时间为5min。图2上为原始图谱，截取有效部分并放大得到下图。
[0021]图中(a)图为测得的双蒸水的SERS信号图，图中无任何信号峰，这就验证了水不会产生拉曼散射的结论，同时也说明了 PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)也不会产生拉曼散射，这就排除了这两种物质对下述实验结果的干扰。
[0022](c)图为测得的PBS溶液的SERS信号图，图中无任何信号峰，说明PBS溶液也无拉曼散射产生。
[0023](d)图和(f)图比较发现，两者在1040—1200cm-l处和1525—1675cm-l处都分布有两组强度大且峰形基本相似的峰。1040—1200cm-l之间主要在1081cm_l、1142cm_l和1184cm-1处分布有三个较易识别的独立峰，1525—1675cm-l之间只有1591cm_l处的峰强度大、易于识别。此外，(f)图在450--600cm-l之间还分布有一组信号峰，该组信号峰强度相对较弱，主要由483cm-l、524cm-l、和566cm_l处的三个易于识别的独立峰组成，而(d)图在对应波数处无明显信号峰。
[0024]比较(e)图和(g)图发现，其结果和(C)图与(f)图比较结果基本一致，即两者也在1040—1200cm-l处和1525—1675cm-l处都分布有两组强度大且峰形基本相似的峰，。1040—1200cm-l和1525—1675cm-l之间的独立峰位置也与(d)图基本一致。且(g)图在450—600cm-l之间也分布有一组信号峰，其强度和(f)相近，而(e)图在对应波数处无明显信号峰。
[0025]比较(d)(e)图和(h)图发现，(e)图在 1040—1200cm-1 处和 1525—1675cm-1 处分布有两组强度较大的峰，而(h)图在这两处无明显信号峰。(e)图中1040—1200cm-l和1525--1675cm-l之间的独立峰与(d)图基本一致。但是(h)图在450—600cm-l之间也分布有一组信号峰，其峰形和强度与(f)图、(g)图一致，而(d)、(e)两图在对应波数处无明显信号峰。
[0026]比较(d)(e)两图发现两者的SERS光谱图基本一致，综合上述分析可知在1040—1200cm-l处和1525—1675cm-l处的两组峰是由SERS探针产生的，且(h)图中的这两组峰消失可以说明:(f) (g)反映的是阳性反应，即SERS探针和对应的标记物发生了特异性结合形成了三明治结构的免疫复合物，而(h)图则反映的是阴性反应，即两种SERS探针都没有和标记物兔抗人抗原Ig发生特异性结合，而直接流出了 SERS微流控芯片。此外，(d)(e)两图中1040—1200cm-l处和1525—1675cm-l处的两组峰其峰强度和峰位完全相同，就进一步说明SERS探针上的SERS信号是由4-MBA染料这种拉曼标签引起的，而不是标记物本身引起的，所以把信号峰解析归属给标记物是不合理的。
[0027](b)图是测得的1%的BSA溶液的SERS光谱图，这一光谱图总体来说峰形较差，但其在450—600cm-l之间强度相对较强，对比(f)、(g)、(h)三图中450—600cm-l之间的信号即可肯定该信号峰来自于BSA溶液中某种成分，该物质本身具有SERS活性，其吸附在SERS微流控芯片内的金纳米层上形成了(f) (g) (h)图中增强的SERS信号。
[0028]但是，在整个实验过程中，因为金纳米粒子的聚集程度不同、HGNs的粒度不同、免疫复合体在金属表面的分布不均匀等原因，SERS技术在定量分析中的应用较难实施，所以，我们仅依据1040—1200cm-l和1525—1675cm-l处的SERS信号峰的存在与否进行定性分析。总之，该实验方法有效的实现了对乳腺癌标记物CA15-3和卵巢癌标记物CA12-5的检测，具有特异性强、灵敏度高、样品消耗量小等优点。
【权利要求】
1.一种肿瘤标记物的检测方法，其特征是，包括以下步骤: (1)首先需要制备具有ant1-xxPcAb-4-MBA-HGNs结构的SERS探针。在加入多克隆抗体 ant1-XX 这一步，分别加入 CA153 和 CA125 抗体制成 ant1-CA153PcAb-4-MBA_HGNs 和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs 两种 SERS 探针。 实验开始之前，需事先准备若干SERS微流控芯片，其中F、G、H三条微通道底面上溅射有金纳米颗粒。 对照品的准备。首先，关闭除A阀门以外的所有阀门，用微量注射泵将A通道注满双蒸水后关闭A阀门。然后，打开B阀门，用微量注射泵将B通道注满I %的BSA溶液后关闭B阀门。打开C阀门，用微量注射泵将C通道注满PBS溶液后关闭C阀门。最后，依次打开D、E两个阀门，用微量注射泵将与它们对应的通道依次注满ant1-CA153PcAb-4-MBA-HGNs和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs探针溶液后依次关闭D、E两个阀门。 待测样品的准备。对上述几种待测样品，严格按照上述步骤进行实验操作。首先，开启微流控芯片上的F、G、H三个阀门，用微量注射泵从进液口向对应的3条通道内注射PBS缓冲液至充满，而后将0.008mol/L的EDC和0.012mol/L的NHS混合溶液(V:V = I:1)从进液口以3.lmL/min的流速注射进入微通道对金基底活化30min。活化完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除残余的EDC/NHS溶液。 (2)然后，依次打开F、G、H三个阀门，分别将10μ g/mL的anti_CA153、anti_CA125和ant1-Ab抗体从进液口经15min分别注射入微通道，以使它们固定在微通道中经EDC/NHS溶液活化的金基底上。等ant1-XX McAbs抗体在金基底上固定好之后，经进液口向微通道注入1%的BSA溶液，以封闭F、G、H三个通道中未被特异性结合的羧基。封闭完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对F、G、H三个微通道进行清洗，以清除残余的EDC/NHS溶液。 (3)第三步，依次打开F、G、H三个阀门，分别将50μ g/mL的anti_CA153、anti_CA125和ant1-Ab抗原经进液口以1.0mL/min的速度分别注射入对应的微通道，随后将整个芯片培养30min。之后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除没有进行特异性结合的ant1-XX抗原。 (4)最后，打开F、G、H 三个阀门，将 0.008ymol/L 的 ant1-CA153PcAb-4-MBA_HGNs 和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs的混合液经进液口以3.lmL/min的流速注射进入微通道，以形成三明治结构的免疫复合物。这一步操作完成以后即可选取SERS微流控芯片微通道上的任意位置进行SERS检测，而后借助软件或人工对所得SERS信号光谱进行分析以实现对待测物质的定性、定量分析。
【文档编号】G01N33/574GK104422769SQ201310403561
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】王倩, 鲍军波, 姚波, 刘佩莉 申请人:天津市医药科学研究所