miRNA和Cyfra21-1联合在检测非小细胞肺癌中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种miRNA和Cyfra21-1联合在检测非小细胞肺癌中的应用，属于生 物医疗领域。
【背景技术】
[0002] 肺癌是全世界发病率、死亡率最高的恶性肿瘤，大约80%的肺癌为非小细胞肺癌 (NSCLC)，主要分为两种亚型：肺腺癌（ADC)和肺鳞癌（SCC)。到目前为止，治疗非小细胞肺 癌最有效的方法是手术治疗，然而，患者通常在早期时没有明显的症状，这就使得部分患者 丧失了最佳的治疗时机。目前常用的肺癌诊断方法有胸部X片、CT和其它影像学方法。但 是，低剂量螺旋CT和胸部X片都有较高的假阳性率。此外，低剂量螺旋CT还存在过度诊断 和射线诱导癌变这两个潜在的危险。因此，我们希望能够找到一个具有较高的诊断敏感度 和特异度的方法来辅助肺癌的诊断。
[0003] 近年来，循环miRNA能够作为疾病标志物这一发现引起了众多科学工作者的兴 趣，尤其是作为肿瘤诊断标志物方面更是备受关注。miRNA是一类内源性、高度保守的非 编码小分子RNA，长度约为18-23个喊基。已有报道证明miRNA在癌症的发病机理和发生 发展过程中起到了一定的作用，并且它能够起到类似癌基因或抑癌基因一样的功能。自从 Mitchell等和Chen等对循环miRNA进行了一个较为系统的报道之后，循环miRNA立即受 到了众多科研人员的关注。早先的研宄发现miRNA可以在血清或者血浆中稳定存在，不受 反复冻融或者pH变化的影响，并且能够被分离出来进行进一步的研宄。更重要的是，通过 抽血检测其中物质的变化就能指示患者的健康状况是一种微创的方法，能够减轻病人的痛 苦，因此可以作为一种较好的筛查或者辅助诊断的方式。近几年来，有研宄显示血清中的 miRNA可以作为非小细胞肺癌的标志物，而且一些循环miRNA已被证实有助于那些需要进 一步进行CT筛查患者的早期诊断。
[0004] 尽管miRNA对于癌症诊断来说是一个很有前景的标志物，某些miRNA的诊断价值 在不同的研宄中变化比较大。McDonald等人发现一些数据分析前和数据分析方法上的差异 对循环miRNA的诊断效率影响颇大。他们发现不同的RNA的提取方法是导致实验内部不精 确性的主要原因。因为miRNA较短并且在血液中的含量较低，通过柱子吸附来提取miRNA 方法的稳定性还有待商榷。此外，尽管传统的Trizol提取方法的精确度要优于柱子吸附的 方法，但其操作流程相对比较繁复。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是检测非小细胞肺癌。
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供检测miR-652、miR-660和Cyfra21-1表达水 平的物质在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用；
[0007] 所述Cyfra21_l的表达水平为Cyfra21_l蛋白的表达水平。
[0008] 为了解决以上技术问题，本发明还提供miR-652、miR-660和Cyfra21-1作为标志 物在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用。
[0009] 为了解决以上技术问题，本发明还提供检测miR-652和miR-660表达水平的物质 在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用；
[0010] 或，
[0011] 为了解决以上技术问题，本发明还提供miR-652和miR-660作为标志物在制备筛 查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用。
[0012] 为了解决以上技术问题，本发明还提供检测miR-652表达水平的物质在制备筛查 和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用；
[0013]或，
[0014] 为了解决以上技术问题，本发明还提供miR-652作为标志物在制备筛查和/或辅 助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用。
[0015] 上述任一所述的应用中，所述非小细胞肺癌为肺腺癌和/或肺鳞癌。
[0016] 上述任一所述的应用中，所述miR-652的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示；
[0017] 所述miR-660的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；
[0018] 所述Cyfra21_l的氨基酸序列如更新日为2015年3月15日Genbank登录号为 NP_002267. 2的序列所示。
[0019] 上述应用中，所述检测miR-652、miR-660和Cyfra21-1表达水平的物质包含实时 荧光定量PCR检测miR-652和miR-660表达水平所用的引物和/或探针以及检测Cyfra21-1 表达水平所用的抗体。
[0020] 上述任一所述的应用中，所述检测miR-652、miR-660和Cyfra21-1表达水平的物 质还包含提取miRNA所需的试剂和/或仪器，和/或，实时荧光定量PCR检测miRNA表达水 平所需的试剂和/或仪器；
[0021] 所述实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需的试剂包括外参athmiR-159a 和/或内参miR-484;
[0022] 所述athmiR-159a的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所示；
[0023] 所述miR-484的核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示。
[0024] 上述应用中，所述检测miR-652和miR-660表达水平的物质包含实时荧光定量PCR 检测miR-652和miR-660表达水平所用的引物和/或探针。
[0025] 上述任一所述的应用中，所述检测miR-652和miR-660表达水平的物质还包含提 取miRNA所需的试剂和/或仪器，和/或，实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需的 试剂和/或仪器；
[0026] 所述实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需的试剂包括外参athmiR_159a 和/或内参miR-484;
[0027] 所述athmiR-159a的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所示；
[0028] 所述miR-484的核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示。
[0029] 上述应用中，所述检测miR-652表达水平的物质包含实时荧光定量PCR检测 miR-652表达水平所用的引物和/或探针。
[0030] 上述任一所述的应用中，所述检测miR-652表达水平的物质还包含提取miRNA所 需的试剂和/或仪器，和/或，实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需的试剂和/或仪 器；
[0031] 所述实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需的试剂包括外参athmiR-159a 和/或内参miR-484;
[0032] 所述athmiR-159a的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所示；
[0033] 所述miR-484的核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示。
[0034] 为了解决以上技术问题，本发明还提供一种系统，该系统包含如下（1)_(3)所示 的系统中的至少一种：
[0035] (1)检测miR-652表达水平的系统；
[0036] (2)检测miR-660表达水平的系统；
[0037] (3)检测Cyfra21_l表达水平的系统；
[0038] 所述Cyfra21_l的表达水平为Cyfra21_l蛋白的表达水平。
[0039] 上述系统中，所述检测miR-652表达水平的系统包含实时荧光定量PCR检测 miR-652表达水平所用的引物和/或探针；
[0040] 所述检测miR-660表达水平的系统包含实时荧光定量PCR检测miR-660表达水平 所用的引物和/或探针；
[0041] 所述检测Cyfra21-1表达水平的系统包含检测Cyfra21-1表达水平所用的抗体。
[0042] 所述系统还包含提取miRNA所需的试剂和/或仪器，和/或，实时荧光定量PCR检 测miRNA表达水平所需的试剂和/或仪器。
[0043] 上述任一所述的实时荧光定量PCR检测miR-652表达水平所用的引物和/或探针 的商品名称为TaqMan?MicroRNAAssays试剂盒，该试剂盒为ThermoFisher产品，产品目 录号为002352;
[0044] 上述任一所述的实时荧光定量PCR检测miR-660表达水平所用的引物和/或探针 的商品名称为TaqMan?MicroRNA Assays试剂盒，该试剂盒为Thermo Fisher产品，产品目 录号为001515 ;
[0045] 上述任一所述的检测Cyfra21_l表达水平所用的抗体来自CYFRA21-1定量测定试 剂盒，该试剂盒为罗氏诊断产品（上海）有限公司产品，产品目录号为11820966122。
[0046] 本发明通过焚光定量PCR的方法发现并验证了一些在非小细胞肺癌患者血清 中高表达的miRNA，进一步对这些异常表达的miRNA进行模型建立并对其是否能有助于 非小细胞肺癌的诊断进行评价，发现miR-652+miR-660+Cyfra21-l这种组合对非小细胞 肺癌具有最优的检测效率（训练组曲线下面积：〇. 953,95%CI:0. 907-0. 981 ;验证组曲 线下面积：〇. 943,95 %CI:0. 893-0. 974)，并且该组合对于非小细胞肺癌的检测效率要优 于miR-652+miR-660的组合和单独的Cyfra21-1(p〈0.01)，其在训练组中诊断敏感性为 86. 81 %，特异性为93. 44%，在验证组中的诊断敏感性为85. 06%，特异性为93. 44%。本发 明在非小细胞肺癌的检测中具有重要应用。
【附图说明】
[0047] 图1为实验设计图。
[0048] 图2为实时荧光定量PCR的可行性及可重复性的评估。
[0049] 图3为miR-194、miR-652和miR-660在发现组、训练组和验证组的正常血清标本、 肺腺癌血清标本和肺鳞癌血清标本中的相对表达水平。
[0050] 图4为miR-194、miR-652和miR-660在训练组和验证组整体中的正常血清标本、 非小细胞肺癌血清标本中的相对表达水平。
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