一种检测α-1,3Gal抗原的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种检测α-1,3Gal抗原的试剂盒。本发明采用Gal1,3Gal-BSA抗原预先制备固相抗原包被板，组合α-1,3Gal抗原的特异性抗体M86，制备成抗体竞争性ELISA抑制法检测试剂盒。本发明的试剂盒可用于各种生物材料的α-Gal抗原的定性和定量检测；尤其适用于动物源性生物材料的残留α-Gal检测。本发明试剂盒的特异性达100％，灵敏度为可以检测3.9x104个/ml的兔血细胞、6.25μg/ml的Gal抗原阳性参考品中的Gal抗原。
【专利说明】—种检测a-1,3Gal抗原的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种检测a -1, 3Gal抗原的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被广泛用于外科的创伤修复、组织重建和组织工程的支架材料等。异种器官也早已成为解决器官移植中供器官严重缺乏的潜在途径之一。然而，动物源性生物材料或异种器官组织应用于人体所带来的免疫学问题直接影响着这类材料使用的安全性和有效性。异种器官移植的最大障碍是供器官异种抗原与受者体内天然抗体结合后激活补体系统，攻击供器官而产生的超急性免疫排斥反应(Hyperacute rejection,HAR),其发生时间在异种移植后的几分钟至数小时，供器官在短时间内发生功能衰竭使移植失败。动物源性生物材料虽经各种去除抗原的处理，却难以彻底去除所有的异种抗原，残留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反应和免疫毒性而影响损伤愈合的重要因素。
[0003]已有研究显示异种抗原α -半乳糖基抗原(a -1, 3-galactosyle, a -Gal)是动物源性生物材料或异种器官移植超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原。a -Gal是含有聚乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，广泛存在于猪和其它低等动物体内。由于人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基错位变异而不表达Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗α-Gal抗体(占总血清球蛋白的1% )，因此当人体接受含有Gal抗原的生物材料或异种器官移植时会导致超急性免疫排斥反应及慢性的免疫毒性反应。动物源性生物材料或异种器官移植中Gal抗原的去除成为降低免疫排斥和慢性免疫毒性反应的关键。目前，如何评价Gal抗原的去除和残留Gal抗原诱导的免疫毒性尚存在着瓶颈。由于野生型低等动物都表达a-Gal抗原，因此无法利用野生型低等动物去评价a -Gal抗原相关的免疫毒性反应，只能用狒狒作为受体来考察a -Gal抗原阳性或者异体器官的免疫毒性反应，而这种动物稀少很难普及使用。因此，如何评价动物源性生物材料或异种器官组织的免疫毒性成为困惑检测与监管机构因没有方法和标准可依据而无法进行有效的安全性和质量监控，同时也限制了该类产品的研发和产业化发展。
[0004]为了填补检测a -Gal抗原试剂盒的空白，特提出本发明。
【发明内容】
[0005]本发明的首要发明目的在于提出了一种检测a -1, 3Gal抗原的试剂盒。
[0006]为了实现本发明的目的，采用的技术方案为:
[0007]本发明涉及一种检测a-l，3Gal抗原的试剂盒，所述的试剂盒中含有:固相a -1, 3Gal抗原包被的孔板、封闭液、鼠Μ86抗体、二次抗体酶结合物、TMB显色液、显色终止液、组织裂解液、浓缩洗液、样品稀释液、阳性参考品和阴性参考品。
[0008]本发明的第一优选技术方案为:固相a -1, 3Gal抗原包被的孔板预先采用a -Gal抗原进行包被，包被缓冲液为PH9.5,0.2M的碳酸盐缓冲液，包被量优选为50?100 μ I ;抗原浓度为10?100ng/ml,优选为50?100ng/ml。
[0009]本发明的第二优选技术方案为:所述的封闭液为人血清白蛋白；所述的样品稀释液为PBS ;所述的显色终止液为浓硫酸；所述的浓缩洗液为吐温-20 ;所述的二次抗体酶结合物为辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgM酶结合物。
[0010]本发明的第三优选技术方案为:所述的阳性参考品为动物组织的冻干品，即为猪肝脏组织的冻干粉；阴性参考品为人源组织的冻干品，即为人胎盘组织的冻干粉。所述的阳性参考品和阴性参考品的制备方法为首先将新鲜组织经O?4°C生理盐水漂洗后去除多余水分，再在O?4°C条件下进行匀浆；最后将匀浆组织进行冻干，分装保存在_20°C。
[0011]本发明还涉及该检测a -1, 3Gal抗原的试剂盒的制备方法:配制50ng?200ng/ml 的 Gall, 3Gal_BSA 溶液，缓冲液为 0.2Μ、ρΗ9.5 碳酸盐缓冲液；取 100 μ L Gall, 3Gal_BSA溶液加入到孔板，4°C孵育过夜；次日用1%的人血清白蛋白进行封闭，封闭的条件优选4°C、I?2小时，然后用0.05 %的吐温-20/PBS洗液进行洗板三次，加洗液250 μ I/孔，浸泡30s，清洗三次；去除洗液后干燥,密封包装，4°C保存。
[0012]本发明还涉及该检测a -1, 3Gal抗原的试剂盒的使用方法，包括以下步骤:
[0013](I)试验样品制备:将待测试验样品放进裂解液中进行低温匀浆；a -Gal抗原阳性参考品和a-Gal抗原阴性参考品各加入裂解液中进行组织裂解；离心，取上清液备用；
[0014](2)标准曲线对照品制备:取兔血1.25Χ106个/mL细胞数或者SP2/0细胞2.5 X IO6个/mL，进行倍比稀释，共5?7个浓度梯度；
[0015](3)样品抗原-抗体反应:取试验样品的上清液和对照样品的稀释液各100 μ I放入离心管中，分别加入稀释后的Μ86抗体溶液(稀释比例为1:50?1:100) 100 μ I,混匀后4°C孵育过夜，或者37°C孵育I?3小时伴随轻度摇动；离心后取上清备用；
[0016](4)竞争性剩余抗体-固相抗原反应:取上述反应上清液各100 μ I加入到a -Gal抗原包被酶标板内，使反应上清液中的剩余Μ86抗体与孔板内的固相抗原充分反应，4°C孵育过夜，或者37°C孵育I?3小时；用洗液洗板3次；
[0017](5) 二次抗体反应和显色:每孔加入1:1000稀释的酶标抗体ΙΟΟμ 1，置37°C孵育
0.5?2小时；洗液洗板3次，甩干；加入酶底物显色剂TMB，避光显色后加入终止液，利用酶标仪在450nm测定光吸收值A450nm ；
[0018](6)判定实验结果。
[0019]本发明还涉及该检测a-1，3Gal抗原的试剂盒在动物源性生物材料中a-Gal抗原的定性或定量检测中的应用，所述的动物源性生物材料包括动物来源的组织、器官、细胞及其动物组织或器官的衍生物、纯化物。所述的应用为在动物源性生物材料的残留a-Gal的定性或定量检测。
[0020]下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。
[0021]本发明的目的为提供一种直接检测和评价动物源性生物材料或异种器官组织及其衍生物中alpha-Gal抗原的定量检测试剂盒。本发明采用Gall，3Gal_BSA抗原预先制备固相抗原包被板，进而组合a -1, 3Gal抗原的特异性抗体M86，制备成抗体竞争性ELISA抑制法检测试剂盒。
[0022]本发明的试剂盒提供了 一种直接检测和评价动物源性生物材料或异种器官组织及其衍生物中Gal抗原的定量检测方法。本发明使用a_l，3Gal抗原的特异性M86抗体，检测动物源性生物材料中a -1, 3Gal抗原。本试剂盒包括:固相a -Gal抗原包被的孔板(优选96-孔板)、封闭液、鼠Μ86抗体、二次抗体酶结合物、TMB显色液、显色终止液、浓缩洗液、样品稀释液、组织裂解液、阳性参考品和阴性参考品。其中，酶标板预先包被Gall, 3Gal-BSA,包被缓冲液为ρΗ9.5碳酸盐缓冲液(0.2Μ)，包被量为100 μ I (50ng/ml抗原浓度);封闭液为质量浓度1%的人血清白蛋白；样品稀释液为PBS ;显色液为TMB ;显色终止液为10倍稀释(lmol/L)的浓硫酸(H2S04);浓缩洗液为5%的吐温-20 (使用时稀释100倍)；二次抗体酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠IgM酶结合物；组织裂解液；阳性参考品和阴性参考品放置在盒内。
[0023]本发明的试剂盒可以定量性地检测样品中的抗原数，可以检测待测样品中微量的残留a-Gal抗原，具有很高的灵敏度和特异性。本发明的试剂盒中还组合了其他样品制备及后续ELISA检测的所有试剂，从而可使反应系统化和一体化。
[0024]同时，本试剂盒包含了阳性参考品和阴性参考品，可直接确认试验体系是否成立，能够判断与排除假阳性和假阴性，确保检测的可靠性。
[0025]本试剂盒可用于各种生物材料、动物器官、组织、细胞及其衍生物、纯化物，对其进行a -Gal抗原的定性和定量检测；尤其适用于动物源性生物材料的残留a -Gal抗原的检测。本发明试剂盒的特异性达100% ;灵敏度为可以检测3.9x104个/ml的兔血细胞、6.25 μ g/ml的Gal抗原阳性参考品中的Gal抗原。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明试剂盒的工艺流程图；
[0027]图2为以兔血为对照品制备的标准曲线图；
[0028]图3为阳性参考品的M86结合抑制率曲线。
[0029]本发明的【具体实施方式】仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。
【具体实施方式】
[0030]实施例1: α -1，3Gal抗原检测试剂盒[0031 ]本发明的试剂盒包含有:
[0032]L固相a -Gal抗原包被的96-孔板:包被Gall, 3Gal_BSA抗原(DextraLaboratories, UK)，包被缓冲液为(λ 2Μ、ρΗ9.5碳酸盐缓冲液，包被量为100 μ I (50ng/ml)；
[0033]2.封闭液:质量浓度I %的人血清白蛋白；
[0034]3.鼠 M86 抗体:市售产品(Enzo, ALX-801-090-1，a -Gal Epitope, mAb)
[0035]4.二次抗体酶结合物:辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体；
[0036]5.TMB 显色液:I % TMB
[0037]6.显色终止液:lmol/L浓硫酸(使用时稀释10倍)；
[0038]7.组织裂解液:直接使用市售产品，碧云天“P0013B RIPA裂解液(强)”；
[0039]8.浓缩洗液:5%的吐温_20(使用时稀释100倍)；
[0040]9.样品稀释液:PBS ；[0041]10.阳性参考品:猪肝脏组织的冻干粉；
[0042]11.阴性参考品:人胎盘组织的冻干粉。
[0043]实施例2试剂盒的制备
[0044]1.a -Gal抗原包被酶标板的制备:配制Gal 1，3Gal_BSA (DextraLaboratories, UK)溶液，50ng/ml,缓冲液为pH9.5碳酸盐缓冲液(0.2M);取100 μ I加入到96-孔板(Nunc.Rochester，NY)，4°C孵育过夜；用I %的人血清白蛋白进行封闭(4°C、2小时)，之后用0.05%的吐温-20/PBS洗液进行洗板三次，加洗液250 μ I/孔，浸泡30s，用微孔板振荡器震摇清洗三次，第一次5min，后两次3min ;去除洗液后将包被板放置在生物安全柜内通风暴露2分钟使其风干，与干燥剂一起密封包装，4°C保存(一周内使用)。
[0045]2、其他溶液配制:
[0046]2.1样品稀释液:pH7.2~7.5的磷酸盐缓冲液；
[0047]2.2浓缩洗液:用PBS配制5%的吐温-20浓缩洗液(使用时稀释100倍);
[0048]2.3封闭液:用PBS配制I %的人血清白蛋白；
[0049]2.4显色液TMB的配制:精确称取TMBlOOmg,加入IOml 二甲基亚砜(DMSO)中，使之完全溶解后得到100倍的TMB浓缩液；
[0050]2.5显色终止液:取54.3ml浓度为95%的浓硫酸，加蒸馏水至1000ml即可得到IOmoI/L的浓硫酸；使用时再稀释10倍使用；
[0051]2.6配制组织裂解液:可直接使用市售品，碧云天“P0013B RIPA裂解液(强)”；
[0052]2.7M86抗体:用PBS稀释，稀释比例为:1:50 ;
[0053]2.8 二次抗体酶结合物:用PBS稀释，稀释比例为:1:1000 ；
[0054]2.9其他试剂配备:a -Gal抗原阳性动物源性生物材料参考品和a -Gal抗原阴性生物材料参考品的制备:首先将新鲜组织经4°C生理盐水漂洗后去除多余水分，再4°C进行匀浆；最后将匀浆组织进行冻干，分装保存在_20°C。
[0055]采用上述方法制备得到实施例1中公开的试剂盒。
[0056]实施例3:试剂盒质量检测
[0057]1、检查包被效果:将M86抗体(1: 100作为初始浓度)进行梯度稀释，与固相抗原包被板固相抗原反应后检测0D，作图获得回归曲线方程，分析包被效果。推荐合格判定标准为=R2≥ 0.95。
[0058]2.特异性检测:用实施例1的试剂盒分别检测a -Gal抗原阳性和a -Gal抗原阴性参考品
[0059]2.1 a -Gal抗原阳性参考品和a -Gal抗原阴性参考品(冻干粉)各2mg加入1ml裂解液中进行组织裂解5~IOmin ；14000rpm, 4°C，离心30min，阳性参考品取上清液进行系列倍比稀释5个浓度备用；阴性参考品取上清液直接使用。
[0060]2.2、标准曲线对照品准备:取兔血1.25 X IO6个/mL细胞数或者SP2/0细胞
2.5 X IO6个/mL，进行倍比稀释，共5~7个浓度梯度；
[0061]2.3、样品抗原-抗体反应:取阳性参考品及阴性参考品的上清液各100 μ L分别放入1.5ml离心管中，分别加入100 μ I稀释比例为1:50的Μ86抗体溶液(终浓度为1:100倍稀释)，混匀后4°C孵育过夜，HOOOrpm离心5分钟后取上清备用；
[0062] 2.4、竞争性剩余抗体-固相抗原反应:取上述反应上清液各100 μ I加入到a -Gal抗原包被酶标板内，使反应上清液中的剩余Μ86抗体与包被酶标板内的固相抗原充分反应，37°C伴随轻轻摇动，反应I~2小时；洗液洗板3次，甩干；
[0063]2.5、二次抗体反应和显色:每孔加酶标抗体100 μ 1，稀释比例为1:1000，置371:孵育I小时；洗液洗板3次，甩干；加入酶底物显色剂ΤΜΒ，每孔100 μ 1，避光显色5~lOmin，加入终止液，每孔50 μ I。利用酶标仪在450nm测定光吸收值A450nm。
[0064]实验结果如表1、图2和图3所示，其中图2为兔血细胞标准曲线图，图3为阳性参考品M86结合抑制率曲线图。
[0065]表1.阴性参考品的M86结合抑制率
【权利要求】
1.一种检测a-l，3Gal抗原的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有:固相a -1, 3Gal抗原包被的孔板、封闭液、鼠M86抗体、二次抗体酶结合物、TMB显色液、显色终止液、组织裂解液、浓缩洗液、样品稀释液、阳性参考品和阴性参考品。
2.根据权利要求1所述的检测a-l，3Gal抗原的试剂盒，其特征在于，固相α-1，3Gal抗原包被的孔板预先采用a -Gal抗原进行包被，包被缓冲液为pH9.5,0.2Μ的碳酸盐缓冲液，包被量为10~100 μ 1，优选为50~100 μ I ;抗原浓度为10~100ng/ml，优选为50~100ng/ml。
3.根据权利要求1所述的检测a_l，3Gal抗原的试剂盒，其特征在于，所述的封闭液为人血清白蛋白；所述的样品稀释液为PBS ;所述的显色终止液为浓硫酸；所述的浓缩洗液为吐温-20 ;所述的二次抗体酶结合物为辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgM酶结合物。
4.根据权利要求1所述的检测a_l，3Gal抗原的试剂盒，其特征在于，所述的阳性参考品为动物组织的冻干品，优选猪肝脏组织的冻干粉；阴性参考品为人源组织的冻干品，优选人胎盘组织的冻干粉。
5.根据权利要求4所述的检测a_l，3Gal抗原的试剂盒，其特征在于，所述的阳性参考品和阴性参考品的制备方法为:首先将新鲜组织经O~4°C生理盐水漂洗后去除多余水分，再在O~4°C条件下进行匀浆；最后将匀浆组织进行冻干，分装保存在_20°C。
6.一种如权利要求1所述的检测a_l，3Gal抗原的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的ct -Gal抗原包被孔板的制备方法为:配制50ng~200ng/ml的Gall, 3Gal_BSA溶液,缓冲液为0.2M、pH9.5碳酸盐缓冲液；取100 μ L Gall, 3Gal_BSA溶液加入到孔板，4°C孵育过夜；次日用1%的人血清白蛋白进行封闭，封闭的条件优选4°C、1~2小时，然后用0.05%的吐温-20/PBS洗液进行 洗板三次，加洗液250 μ L/孔，浸泡30s，清洗三次；去除洗液后干燥，密封包装，4 °C保存。
7.—种如权利要求1所述的检测a_l，3Gal抗原的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)试验样品制备:将待测试验样品放进裂解液中进行低温匀浆；a-Gal抗原阳性参考品和a -Gal抗原阴性参考品各加入裂解液中进行组织裂解；离心，取上清液备用； (2)标准曲线对照品制备:取兔血1.25 X IO6个/mL细胞数或者SP2/0细胞2.5 X IO6个/mL，进行倍比稀释，共5~7个浓度梯度； (3)样品抗原-抗体反应:取试验样品的上清液和对照样品的稀释液各100μ I放入离心管中，分别加入稀释后的Μ86抗体溶液100 μ 1，稀释比例为1:50~1:100 ;混匀后4°C孵育过夜，或者37°C孵育I~3小时伴随轻度摇动；离心后取上清备用； (4)竞争性剩余抗体-固相抗原反应:取上述反应上清液各100μ I加入到a -Gal抗原包被酶标板内，使反应上清液中的剩余Μ86抗体与孔板内的固相抗原充分反应，4°C孵育过夜，或者37°C孵育I~3小时；用洗液洗板3次； (5)二次抗体反应和显色:每孔加1:1000稀释的酶标抗体100 μ 1，置37 °C孵育0.5~2小时；洗液洗板3次，甩干；加入酶底物显色剂TMB，避光显色后加入终止液，利用酶标仪在450nm测定光吸收值A450nm ； (6)判定实验结果。
8.—种如权利要求1所述的检测a -1, 3Gal抗原的试剂盒在动物源性生物材料中a -Gal抗原的定性或定量检测中的应用，所述的动物源性生物材料包括动物来源的组织、器官、细胞及其动物组织或器官的衍生物、纯化物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用为在动物源性生物材料的残留α-Gal的定性或定量检测。
【文档编号】G01N33/53GK103983767SQ201410187336
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】徐丽明, 邵安良, 柯林楠, 单永强, 陆艳, 杨昭鹏 申请人:中国食品药品检定研究院