专利名称：一种新型抗原检测方法及利用该方法制成的检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型抗原检测方法，具体涉及一种利用抗体Fc片段特异寡核苷酸配基建立的抗原检测方法。本发明还涉及利用该方法制成的检测装置。
背景技术：
抗原检测是通过抗体对抗原分子上特异决定簇的有效识别来实现的。抗原检测，特别是蛋白质的高灵敏度检测对医学研究、后基因组计划的完成及临床检验具有非常重要的作用。目前，特异识别抗原的常用技术是ELISA(酶联免疫吸附试验)，它是通过特异抗体识别抗原决定簇，并通过连接于抗体上的酶、荧光物质、放射性同位素来完成抗原信息的识别、放大，从而实现检测目的。近年来，虽然ELISA检测方法有了很大的发展，但是，当检测样品量有限、抗原浓度极低或抗体效价不高时，就无法用传统的ELISA技术进行检测。
随着PCR扩增技术的出现，Santo等在1992年建立了免疫PCR技术(Santo，T.，et al.Science.258120-122)。免疫PCR技术和ELISA的基本过程相似，只是用连接蛋白将一段可扩增的生物素标记的DNA分子连接在抗体Fc片段上，并通过PCR技术将抗原信号放大、检出。连接蛋白是链霉亲和素-蛋白A复合物，它具有两个专一结合位点一个是由链霉亲和素衍生而来的生物素位点，另一个是由蛋白A衍生而来的Fc片段结合位点。DNA片段是生物素化的线性质粒DNA(pUC19)。抗体是正常抗体。检测过程是将连接蛋白和生物素化的DNA pUC19以1∶1的摩尔比混合，产生嵌合蛋白-DNApUC19聚合物，再通过连接蛋白上蛋白A位点与抗体Fc段结合，形成抗体-连接蛋白-DNA片段的复合体。检测时，通过抗原和抗体结合实现抗原-DNA信号转换，再通过PCR扩增将抗原信号放大。免疫PCR技术能够检测出580个抗原分子，灵敏度比用碱性磷酸酶作为标记物的传统ELISA技术提高了105倍。但是免疫PCR技术存在以下问题由于连接蛋白的存在，检测时产生较强的本底信号(因为蛋白A基团可与样品中的任何抗体IgG的Fc片段进行结合)；连接蛋白未商品化；不能同时进行多分子检测。
1995年Hendrickson等(Hendrickson，ER，et al.Nucleic Acids Res.1995，23522-529)改进了免疫PCR技术。它是用双功能化学交联分子取代了连接蛋白，将寡核苷酸与抗体的Fc片段进行共价结合，使检测背景减少，灵敏度进一步提高。Schweitzer等2000年建立的免疫RCA技术(Rolling circleamplification)(Schweitzer，B，et al.PNAS 2000，9710113-10119)，基本原理与Hendrickson等在1995年改进的免疫PCR技术基本相同，所不同的是连接的寡核苷酸最后以滚环复制的方式扩增，使检测灵敏度进一步提高。以上两种改进的免疫PCR技术都必须使用交联分子，而且交联前需活化抗体的Fc片段及寡核苷酸结合位点，因此在检测过程中操作难度大、易使抗体活性丧失；操作还只能在高纯度抗体的条件下进行，且针对每一种抗体都须与DNA分子进行连接，费时、成本高，普及应用都比较困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用抗体Fc片段特异寡核苷酸配基建立的抗原检测方法。
本发明的另一目的是提供一种利用该方法制成的检测装置。
本发明的方法不需要任何连接蛋白或交联分子，而是利用抗体Fc片段特异寡核苷酸配基与抗体的直接结合，将抗原信号转换成核酸信号，然后经PCR扩增放大，检测出新型抗原。
本发明所称的特异寡核苷酸配基包括能与抗体Fc片段特异结合的任何形式的寡核苷酸，常用的有单链DNA和单链RNA。
为增加其稳定性，本发明所称的特异寡核苷酸配基序列中的碱基可经化学修饰。也可以如在不改变与Fc片段结合特性的前提下，在配基序列两端增加一些碱基，使通用序列变为携带大量人为信息的多样性配基，以满足同时检测多种抗原的需要。
本发明所称的特异寡核苷酸配基序列可经SELEX技术筛选获得或通过其他的方法如分子生物学、生物信息学的方法获得。
本发明所称的抗体可以是任何种属(如人、兔、小鼠、鸡、羊等)、任何种类(如IgG、IgM、IgE等)、任何来源(如动物产生、基因工程制备等)的单克隆抗体或多克隆抗体或基因工程单链抗体。
本发明的方法的原理和技术路线是将待测抗原固定在硝酸纤维素膜等介质上，用封闭液封闭后，将膜与抗体及经SELEX技术筛选获得的同类抗体Fc片段的特异寡核苷酸配基孵育一定时间，用洗涤液充分洗涤纤维素膜，将未结合的特异寡核苷酸配基及游离抗体除去，利用PCR技术扩增与抗原结合的抗体Fc片段上的寡核苷酸配基。PCR扩增所用引物同时标记有荧光试剂或同位素，通过检测荧光或同位素的强度实现抗原信号检测。
本发明强调的是该抗原检测方法中抗体与寡核苷酸配基之间无任何连接分子。
因为某一类抗体Fc片段的寡核苷酸配基为该类抗体的通用性配基，应能识别该类所有的抗体，所以通过上述方法，以针对该通用配基的特异核酸序列为引物，可将该类抗体识别的所有抗原信号都转换成核酸信号加以放大、检测。
将某一类抗体Fc片段通用寡核苷酸配基核酸序列人为修饰后(如末端人为加上一些不影响其结合活性的核酸序列)，先与特定抗体结合并通过紫外交联等方法加以固定，即成为针对不同抗原的特定的核酸标记抗体。根据修饰序列长短不同，碱基序列不同，可使通用寡核苷酸配基成为代表不同抗原的多样性配基，可构建微阵列或生物芯片，利用上述原理完成多种抗原的同时检测。
本发明所指的寡核苷酸可以是ssDNA，也可以是RNA。通过SELEX筛选出序列后，可以直接化学合成或通过其他分子生物学的方法获得。
本发明是利用SELEX技术筛选抗体Fc片段的高亲合性寡核苷酸配基(包括单链DNA和RNA)，通过寡核苷酸配基对Fc片段的特异性识别、直接结合(中间不需要任何连接分子)及PCR扩增，实现抗原信息的有效传递和放大。
本发明的新型抗原检测方法在各种抗原检测方面有广泛的应用。例如，1.利用该技术原理可以建立一种新型抗原检测方法平台；2.利用该技术原理组装成检测试剂盒，能够快速高效的提高现有各类抗体免疫检测的灵敏度、特异性；3.利用该技术原理可以发展成一种新型实用蛋白质芯片或其他各类抗原检测生物芯片构建技术；4.利用该技术组装的检测试剂盒或构建的生物芯片可以广泛应用于基础研究与临床检测，并带来可观的经济效益与社会效益。
本发明的方法具有以下几方面的优点1)高灵敏度与抗体Fc片段特异结合的寡核苷酸是利用SELEX(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment)技术筛选出来的。SELEX技术是近些年发展起来的一种新型生物学技术(综述见孙蕾等，指数式富集法配体进化-组合化学技术的新进展，国外医学药学分册，1999，26193-197)。它是应用大容量(库容量可达1018)的随机寡核苷酸文库，并结合PCR体外扩增技术以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸配基(aptamer)。用此方法筛选出的特异寡核苷酸配基与靶分子结合的亲和力高(Kd为0.05～50nmol.L-1)、特异性强、易形成稳定的复合物。本发明利用Fc片段特异寡核苷酸配基与抗体的直接结合及PCR技术检测抗原，不但保留了免疫PCR和免疫RCA利用寡核苷酸扩增、传递、放大抗原信号的优点，而且由于抗体对Fc片段的特异性识别与结合，避免了连接分子的存在，使得抗原信号的检测背景非常低，特异性更强，灵敏度会大大提高；2)抗体的通用性识别由于抗体的Fc片段是高度保守序列，因此针对某种属的某一类抗体(如小鼠IgG、IgE、IgM等)Fc片段筛选出的特异寡核苷酸配基，应能识别该类所有的抗体，作用类似于ELISA中的酶标二抗；3)可进行多种抗原超微多样性检测通用的寡核苷酸配基经过人为序列修饰后，使寡核苷酸配基不仅具有通用性，同时也能形成识别不同抗原的多样性配基，并可构建成微阵或生物芯片用于多种抗原的同时检测；4)操作简便，易于普及由于获得的特异寡核苷酸配基与抗体及抗原孵育一定时间后，将未结合的核酸配基除去，即可通过PCR技术检测，不需要将寡核苷酸配基经过化学方法偶联到抗体蛋白分子上，因此操作简便，便于一般实验室或临床检验科室的普及应用。
图1是利用抗体Fc片段特异寡核苷酸配基建立的新型抗原检测方法原理示意图。其中PCR所用引物为针对寡核苷酸配基的互补序列。
图2是某一类抗体Fc片段通用特异寡核苷酸配基序列经人为增加一些碱基后，变成多样性配基序列用于多种抗原同时检测示意图。为了增加配基的多样性，人为序列可以加在5’端、3’端、或5’端和3’端同时加上，长度可以多样。其中PCR所用引物只针对寡核苷酸配基两端人为添加序列。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1.单一抗原的免疫检测利用小鼠IgG Fc片段特异寡核苷酸配基制备小鼠IgG类单抗核酸标记试剂，并以此为传感器检测该类抗体识别的抗原。具体方法如下将抗原固定在硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，将膜与小鼠IgG类单抗及小鼠IgG Fc片段特异寡核苷酸配基在37口下共同孵育30分钟，用洗涤液洗涤滤膜数次后，将滤膜重新置于含有PCR反应液(包括引物及标准PCR反应体系)的薄壁PCR管中，进行PCR扩增。利用引物上标记的荧光试剂检测荧光信号，同时设立相应未进行PCR扩增(相应试剂都存在)的对照。扣除对照荧光信号即为待测抗原的信号。
实施例2.用于原发性肝癌早期诊断新型免疫微阵列的制备及其应用具体步骤如下1.制备AFP(甲胎蛋白)、Ft(铁蛋白)、GGT(γ-谷氨酰转肽酶)及GGT同功酶的特异核酸标记抗体由于目前临床所用上述4种抗体皆为小鼠IgG类单抗，所以将小鼠IgG抗体Fc片段通用寡核苷酸配基的核酸序列进行人为修饰，如在5’末端分别人为加上4种不影响其结合活性的核酸序列A、B、C、D，长度40-80bp，即成为4种特定的标记核酸。将这4种不同的标记核酸分别与上述4种抗体一一对应结合，通过紫外交联加以固定，即成为针对4种不同抗原的特定的核酸标记抗体。
2.按目前常规方法制备针对上述A、B、C、D序列的微阵列。
3.将抗原(如患者血清)固定在硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后与上述4种不同核酸标记抗体在37口下共同孵育30分钟，用洗涤液冲洗滤膜数次后，将滤膜重新置于含有PCR反应液(包括引物及标准PCR反应体系)的薄壁PCR管中，进行PCR扩增。所用引物分别为针对上述A、B、C、D4种人为序列(即同时存在8种引物)，引物上同时标记有荧光试剂。用微阵列技术对PCR产物进行定性定量分析，即可检测4种抗原，从而对原发性肝癌进行早期诊断。
权利要求
1.一种新型抗原检测方法，其特征是利用抗体Fc片段特异寡核苷酸配基与抗体直接结合，将抗原信号转换成核酸信号，然后经PCR扩增放大，检测出抗原。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所说的特异寡核苷酸配基是能与抗体Fc片段特异结合的单链DNA。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于所说的特异寡核苷酸配基是能与抗体Fc片段特异结合的单链RNA。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于所说的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程单链抗体。
5.权利要求2至3所述的方法，其特征在于在不改变与Fc片段结合特性的前提下，配基序列两端可人为地增加一些碱基，使通用序列变为携带大量人为信息的多样性配基，以满足同时检测多种抗原的需要。
6.利用权利要求1所述方法制成的检测试剂盒及装置。
全文摘要
本发明涉及一种新型抗原检测方法。该方法利用抗体Fc片段特异寡核苷酸配基与抗体直接结合，将抗体信号转换成核酸信号，然后经PCR扩增放大，检测出抗原。利用该方法可以组装成检测试剂盒或开发成为实用蛋白质芯片或其他检测各类抗原的生物芯片。该方法检测抗原具有快速、高灵敏度、特异性强等特点。
文档编号G01N33/53GK1428606SQ0114492
公开日2003年7月9日 申请日期2001年12月24日 优先权日2001年12月24日
发明者邵宁生, 廖世奇, 柳川, 薛沿宁, 沈倍奋, 杨光, 何晓东, 刘元强, 仇杰, 董信春 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所, 甘肃省医学科学研究院