专利名称：一种检测人工抗原制备成功与否的方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定人工抗原的方法，尤其是采用超高效液相色谱与四级杆电喷 雾质谱联用法检测人工抗原制备是否成功的方法。
背景技术：
方便、简洁、快速和灵敏的分析技术和检测手段是保障食品安全和环境监测的重 要保障。农药和兽药的不合理使用甚至滥用导致食用农产品药物残留超标，已成为食品安 全的突出问题之一，开发可靠、灵敏、快速和实用的快速分析检测技术无疑是监测和控制残 留、保障人民身体健康和避免国际间贸易争端的重要技术手段。免疫分析技术(IA)特别是 酶联免疫吸附分析技术(ELISA)作为一项快速检测技术，以其抗原抗体反应的高专属性， 测定方法简单、快速、灵敏度高、费用低和适于现场大批量样品筛选等优点，在农药兽药残 留分析和环境检测中展示了广泛的应用前景。免疫分析法是利用抗原和抗体的结合反应的检测方法，而大多数农药和兽药都是 小分子物质(也叫半抗原，hapten)，相对分子质量在IOOODa以下，它缺乏T细胞表位而无 法直接诱导动物机体产生特异性的抗体，但把它以共价键方式偶联到大分子蛋白载体上制 备成人工抗原(也称偶联物)后，可借助其T细胞来间接诱导B细胞的增殖与分化，产生 特异性的抗体，这也是小分子免疫分析的基本模式。在这项技术中，鉴定人工抗原(半抗 原_载体蛋白偶联物)是否偶联制备成功是建立免疫分析方法的前提和关键。目前人工抗原主要的鉴定方法有紫外分光光度法(UV)、红外分光光度法(IR)、 SDS-page电泳法和基质辅助激光解吸飞行时间质谱法(MALDI-T0F)等。但这些方法的通用 性不强，限制性条件较多。例如UV通过区别半抗原-载体蛋白偶联物(人工抗原)与载体蛋 白的紫外吸收谱以鉴定人工抗原的合成，只有当半抗原与载体蛋白具有不同的发色团才可 使用；如果人工抗原的纯化不完全，未反应的半抗原或其他小分子杂质势必会影响人工抗 原的检测鉴定结果的可靠性；这种方法对不含紫外吸收基团的半抗原更是无能为力。IR的 方法也存在类似的缺点。电泳技术是利用溶液中的离子在一定的电场作用下迁移从而达到 分离的技术，电泳法在生物大分子的的鉴别中应用非常广泛；在人工抗原的鉴定中，目前主 要应用的电泳法是SDS-聚丙烯酰胺电泳法、SDS-page电泳法，是通过比较人工抗原和其载 体蛋白在凝胶上出现的条带位置的不同来判定人工抗原的合成是否成功；更确切的说就是 根据人工抗原与载体蛋白的分子量的差异来判定；缺点在于如果载体偶联半抗原较少，使 人工抗原的分子量增加不明显，使用SDS-page法表现在凝较上的条带位置差异就不明显； 文献报道只有当分子量较大的半抗原(> 800Da)与分子量较小的载体蛋白(< 20000Da) 偶联制备的人工抗原，运用此法鉴定才具有较好的鉴别效果；基质辅助激光解吸飞行时间 质谱法(齐小花等.生物质谱法对人工抗原偶联比的快速测定.检验检疫科学，2007增刊) 是目前最有效的人工抗原的鉴定方法，缺点是在待测样品的制备时需要选用适合离子化的 基质，如果选择不当，会造成检测结果的重复性差；同时激光解吸飞行时间质谱仪器价格昂 贵，操作条件较苛刻，不适合大规模推广应用。
由于人工抗原结构复杂，它是由小分子上的特定基团如氨基、羧基等通过特定的 反应连接到载体蛋白如牛血清白蛋白、人血清白蛋白，卵清蛋白等特定的氨基酸残基上而 制备成的，小分子与蛋白质蛋白的结合位点多，分析难度大，目前还缺乏一套通用性强的分 析检测方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种新的、快速、有效及可靠的方法 以鉴定人工抗原的制备是否成功。
本发明的目的是这样实现的一种检测人工抗原制备成功与否的方法，该方法包括以下具体步骤a、分别称取相同重量的人工抗原及载体蛋白，加1 10重量倍溶剂溶解，超声 lmin，12000rpm离心后，取上清液，分别得到人工抗原测试样品及载体蛋白测试样品；b、用超高效液相色谱四极杆电喷雾质谱联用仪分别对测试样品检测，分别得到超 高效液相色谱图及四极杆电喷雾质谱图；C、比较所得人工抗原及载体蛋白的超高效液相色谱图及其相对应的质谱图的差 异，确定人工抗原制备成功与否；其中用超高效液相色谱四极杆电喷雾质谱联用仪对测试样品检测时，其超高效 液相色谱条件为流动相A相乙腈B相体积比0. 01 100 0. 1 100的三氟乙酸水溶液线性梯度在0 IOmin A相由10% 30%线性增加到70% 90%，相应的B相 由70% 90%线性减少到30% 10%液相色谱柱为ACQUITYUPLC C4, 2. ImmX 150mm, 1，7um。其四极杆电喷雾质谱条件为离子源电喷雾离子源离子化方式正离子离子化检测方式全扫描；毛细管电压2. 5 3KV锥孔电压；20 35V扫描质量范围m/z 1000 1600amu离子源温度100 150°C去溶剂温度250 300°C脱溶剂气氮气脱溶剂气流速400 700L/hr。所述溶剂为水或有机溶剂与水的混合物；有机溶剂为乙醇、甲醇、乙腈或丙酮。所述载体蛋白为牛血清白蛋白。所述有机溶剂与水的体积比为1 1。本发明中测试用人工抗原样品的制备方法包括重氮化法(含芳香胺的半抗原化合物与亚硝酸反应形成重氮盐，然后直接连接到载体蛋白质分子中含酚羟基的氨基酸残基 的邻位，即得到以偶氮键相连的人工抗原)、混合酸酐法(半抗原小分子中的羧基在三级 胺存在下与氯甲酸异丁酯反应生成活泼中间体混合酸酐，然后与蛋白质载体上的伯氨基反 应，形成酰胺键而制备人工抗原)和碳二亚胺法(半抗原上的氨基或羧酸与碳二亚胺反应 生成一中间体，再与载体蛋白上的氨基或羧基形成酰胺键而制备人工抗原)等。本发明的优点是样品前处理简单，方法通用性强，对半抗原的物理化学特性无特 别的要求，仪器操作条件简单，适合大规模的推广应用。
图1为本发明实施例1的超高效液相色谱2为本发明实施例1的电喷雾质谱3为本发明实施例2的超高效液相色谱4为本发明实施例2的电喷雾质谱5为本发明实施例3的超高效液相色谱6为本发明实施例3的电喷雾质谱7为本发明实施例4的超高效液相色谱8为本发明实施例4的电喷雾质谱图
具体实施例方式实施例1按以下工艺路线制备苯胺人工抗原(苯胺牛血清白蛋白偶联物)<formula>formula see original document page 5</formula>将Img苯胺、IOmL lmol/L盐酸加至25mL三口瓶中，搅拌，冰浴降温；于0 5°C滴 加预冷的1 % NaNO2水溶液至KI-淀粉试纸变蓝，继续避光、保温搅拌30min，制得重氮盐溶液。另取IOOmg牛血清白蛋白(BSA)、IOmL硼砂-硼酸缓冲液(0. 2mol/L, pH 8. 7)放 置另一 50mL三口瓶中，冰浴、搅拌下滴加上述重氮盐溶液，滴加过程中用5%氢氧化钠溶液 调节反应液PH值维持在8左右。滴加完毕，避光、保温反应24h。停止反应，将反应液装入 预处理好的透析袋中，4°C下用蒸馏水透析三天，每天换液四次。真空冷冻干燥制得褐色絮 状人工抗原，此人工抗原记作AN-BSA，-20°C保存备用。分别称取此人工抗原及牛血清白蛋白5mg，加水5mg，超声lmin，12000rpm离心后， 取上清液为人工抗原待测试样及牛血清白蛋白待测试样。待测试样用超高效液相色谱四极杆电喷雾质谱联用仪检测超高效液相色谱条件超高效液相色谱柱ACQUITYUPLC C4, 2. ImmX 150mm, 1，7um流动相A相乙腈；B相体积比0.01 100的三氟乙酸水溶液
线性梯度在0 lOmin A相由10%线性增加到90%，相应的B相由90%线性减 少到10%流速0. 2mL/min柱温30°C四极杆电喷雾质谱条件离子源电喷雾离子源离子化模式正离子化毛细管电压3KV锥孔电压；30V检测方式全扫描扫描质量范围m/z 1000 1600amu离子源温度100°C去溶剂温度300°C脱溶剂气氮气脱溶剂气流速700L/hr分别得到苯胺人工抗原、牛血清白蛋白的超高效液相色谱图(图1中上图为苯胺 人工抗原、下图为牛血清白蛋白)和相对应的四极杆电喷雾质谱图(图2中上图为苯胺人 工抗原、下图为牛血清白蛋白)。根据苯胺人工抗原与牛血清白蛋白的超高效液相色谱图中色谱峰的保留时间的 差别(图1)和相对应的质谱图(图2)的差别，确定此人工抗原制备成功。实施例2按以下工艺路线制备磺胺喹噁啉人工抗原<formula>formula see original document page 6</formula>
将15mg磺胺喹噁啉、10mL lmol/L盐酸加至50mL三口瓶中，搅拌，冰浴降温。于 0 5°C范围内滴加预冷的亚硝酸钠水溶液，直至碘化钾-淀粉试纸变蓝，避光、保温反 应30min，制得重氮盐溶液。将300mg BSA、20mL 硼砂-硼酸缓冲溶液(0. 2mol/L, pH 8. 7)放置另一 50mL 三 口
瓶中，搅拌，冰浴降温。于4°C下滴加上述重氮盐溶液，滴加过程中用5%氢氧化钠溶液调节 反应液PH值维持在8左右，滴加完毕避光、保温反应24h。然后，将反应液装入预处理好的 透析袋中，用蒸馏水透析3天，每天换液4次，真空冷冻干燥制得褐色絮状人工抗原，此人工 抗原记作SQ-BSA，-20°C保存备用。分别称取此人工抗原及牛血清白蛋白5mg，加体积比为1 1的乙腈水溶液50mg， 超声lmin，12000rpm离心后，取上清液为人工抗原待测试样及牛血清白蛋白待测试样。待测试样用超高效液相色谱四极杆电喷雾质谱联用仪检测超高效液相色谱条件超高效液相色谱柱ACQUITYUPLC C4, 2. ImmX 150mm, 1，7um
流动相A相乙腈；B相体积比0.05 100的三氟乙酸水溶液线性梯度在0 lOmin A相由20%线性增加到80%，相应的B相由80%线性减 少到20%流速0. 2mL/min柱温30°C四极杆电喷雾质谱条件离子源电喷雾离子源离子化模式正离子化毛细管电压3KV锥孔电压；30V检测方式全扫描扫描质量范围m/z 1000 1600amu离子源温度100°C去溶剂温度300°C脱溶剂气氮气脱溶剂气流速700L/hr分别得到磺胺喹噁啉人工抗原、牛血清白蛋白的超高效液相色谱图(图3中上图 为磺胺喹噁啉人工抗原、下图为牛血清白蛋白)和相对应的四极杆电喷雾质谱图(图4中 上图为磺胺喹噁啉人工抗原、下图为牛血清白蛋白)。根据磺胺喹噁啉人工抗原与牛血清白蛋白的超高效液相色谱图中色谱峰的保留 时间的差别(图3)和相对应的质谱图(图4)的差别，确定此人工抗原制备成功。实施例3按以下工艺路线制备克伦特罗人工抗原<formula>formula see original document page 7</formula>以实施例2中磺胺喹噁啉人工抗原的制备方法制得克伦特罗人工抗原，记作 CL-BSA, -20°C保存备用。分别称取此人工抗原及牛血清白蛋白5mg，加体积比为1 1的乙醇水溶液10mg， 超声lmin，12000rpm离心后，取上清液为人工抗原待测试样及牛血清白蛋白待测试样。待测试样用超高效液相色谱四极杆电喷雾质谱联用仪检测超高效液相色谱条件超高效液相色谱柱ACQUITYUPLC C4, 2. ImmX 150mm, 1，7um流动相A相乙腈；B相体积比0. 1 100的三氟乙酸水溶液线性梯度在0 lOmin A相由30%线性增加到70%，相应的B相由70%线性 减少到30%流速0. 2mL/min
柱温30°C四极杆电喷雾质谱条件离子源电喷雾离子源离子化模式正离子化毛细管电压3KV锥孔电压；30V检测方式全扫描扫描质量范围m/z 1000 1600amu离子源温度100°C去溶剂温度300°C脱溶剂气氮气脱溶剂气流速700L/hr分别得到克伦特罗人工抗原、牛血清白蛋白的超高效液相色谱图(图5中上图为 克伦特罗人工抗原、下图为牛血清白蛋白)和相对应的四极杆电喷雾质谱图(图6中上图 为克伦特罗人工抗原、下图为牛血清白蛋白)。根据克伦特罗人工抗原与牛血清白蛋白的超高效液相色谱图中色谱峰的保留时 间的差别(图5)和相对应的质谱图(图6)的差别，确定此人工抗原制备成功。实施例4按以下工艺路线制备苯甲酸人工抗原<formula>formula see original document page 8</formula>称取0. 12g苯甲酸，溶于3mL 1，4_ 二氧六环中，于4°C下加入0. 19克三丁胺和 0. 14g氯甲酸异丁酯并搅拌30min，此为A液；称取0. 3g牛血清白蛋白溶于50mL碳酸盐缓 冲液中(PH9. 6,0. 2mol/L)，此为B液。于4°C下将A液缓慢滴加至B液中并搅拌24h，反应 液转入透析袋中，用磷酸盐生理盐水透析4天，每天换磷酸盐生理盐水透析液两次，产物冷 冻干燥得白色粉末为苯甲酸人工抗原，记做BJS-BSA。分别称取此BJS-BSA及载体牛血清白蛋白5mg，加体积比为1 1的丙酮水溶液 5mg，超声lmin，12000rpm离心后，取上清液为人工抗原待测试样及牛血清白蛋白待测试样。待测试样用超高效液相色谱四极杆电喷雾质谱联用仪检测超高效液相色谱条件超高效液相色谱柱ACQUITYUPLC C4, 2. ImmX 150mm, 1，7um流动相A相乙腈；B相体积比0. 1 100的三氟乙酸水溶液线性剃度在0 lOmin A由30%线性增加到70%，相应的B由70%线性减少到 30%流速0. 2mL/min
柱温30°C四极杆电喷雾质谱条件离子源电喷雾离子源离子化模式正离子化毛细管电压2. 5KV锥孔电压；35V检测方式全扫描扫描质量范围m/z 1000 1600amu离子源温度150°C去溶剂温度250°C
脱溶剂气氮气脱溶剂气流速400L/hr分别得到苯甲酸人工抗原、牛血清白蛋白的超高效液相色谱图(图7中上图为苯 甲酸人工抗原、下图为牛血清白蛋白)和相对应的四极杆电喷雾质谱图(图8中上图为苯 甲酸人工抗原、下图为牛血清白蛋白)。结果显示，在整个超高效液相色谱图中没有出峰，曾一条基线，在此检测条件下说 明，苯甲酸人工抗原并没有制备成功。
权利要求
一种检测人工抗原制备成功与否的方法，其特征在于该方法包括以下具体步骤a、分别称取相同重量的人工抗原及载体蛋白，加1～10重量倍溶剂溶解，超声1min，12000rpm离心后，取上清液，分别得到人工抗原测试样品及载体蛋白测试样品；b、用超高效液相色谱四极杆电喷雾质谱联用仪分别对测试样品检测，分别得到其超高效液相色谱图及对应的四极杆电喷雾质谱图；c、比较所得人工抗原及载体蛋白的超高效液相色谱图及其相对应的质谱图的差异，确定人工抗原制备成功与否；其中用超高效液相色谱四极杆电喷雾质谱联用仪对测试样品检测时，其超高效液相色谱条件为流动相A相乙腈B相体积比0.01∶100～0.1∶100的三氟乙酸水溶液线性梯度在0～10min A相由10％～30％线性增加到70％～90％，相应的B相由70％～90％线性减少到30％～10％液相色谱柱为ACQUITY UPLC C4，2.1mm×150mm，1，7um；其四极杆电喷雾质谱条件为离子源电喷雾离子源离子化方式正离子离子化检测方式全扫描；毛细管电压2.5～3KV锥孔电压；20～35V扫描质量范围m/z 1000～1600amu离子源温度100～150℃去溶剂温度250～300℃脱溶剂气氮气脱溶剂气流速400～700L/hr。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述溶剂为水或有机溶剂与水的混合物； 有机溶剂为乙醇、甲醇、乙腈或丙酮。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述有机溶剂与水的体积比为1 1。
全文摘要
本发明公开了一种检测人工抗原制备成功与否的方法，包括步骤a)分别称取相同重量的人工抗原及载体蛋白，加1～10重量倍溶剂溶解，超声1min，12000rpm离心后，取上清液，分别得到人工抗原测试样品及载体蛋白测试样品；b)用超高效液相色谱四极杆电喷雾质谱联用仪分别对测试样品检测，分别得到超高效液相色谱图及四极杆电喷雾质谱图；c)比较所得人工抗原及载体蛋白的超高效液相色谱图及其相对应的质谱图的差异，确定人工抗原制备成功与否。本发明具有样品前处理简单，方法通用性强，对半抗原的物理化学特性无特别的要求，仪器操作条件简单，适合大规模的推广应用等优点。
文档编号G01N30/36GK101813679SQ20101014505
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者张丽芳, 李伟岭, 薛飞群, 裘敏琪 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所