专利名称：Hcv抗原检测板及用该板检测hcv抗原的方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒抗原的检测方法，尤其是丙型肝炎病毒HCV抗原的检测方 法，属于生物技术领域。
背景技术：
目前，丙型肝炎的检测方法主要有三类第一类是丙型肝炎抗体检测其缺点是感染丙型肝炎病毒HCV后，有2 沈周的 潜伏期，一般到抗HCV抗体出现(转阳)有一个较长的窗口期，平均为70d，有的患者窗口 期可延长至6-9个月或更长，约1-3%的患者抗HCV可持续阴性，在丙氨酸氨基转移酶升高 后，抗HCV抗体才上升。由于窗口期的存在，对潜伏期和隐形感染者容易造成漏检，机体感 染HCV后，在抗HCV抗体出现之前约2周左右，血循环中即可出现病毒颗粒，此时丙型肝炎 病毒HCV的RNA经PCR方法检测可为阳性，血液具有感染性，而用抗体检测方法根本无法测 出。另外该方法无法区分携带感染是急性期还是慢性期，或是既往感染痊愈后HCV抗体在 体内的长期存在。此外，少数因免疫缺陷或免疫系统发育未成熟患者的HCV抗体检测表现 为阴性，导致丙型肝炎病毒HCV感染者的漏检；由于厂家之间使用HCV基因重组抗原质量及 各抗原片段包被比例的不同，各厂家试剂间的灵敏度和特异性存在着一定差异，从而导致 抗HCV抗体检测结果不一致，易产生假阳性或漏检等情况。第二类是丙型肝炎病毒HCV核酸检测感染丙型肝炎病毒HCV后1-2周，血清中即 可检测到HCV-RNA。因此，HCV核酸检测(HCV RT-PCR检测)可用于丙型肝炎的早期诊断，并 且通过对病毒拷贝数的定量检测可对其临床疗效进行监测。HCV-RNA的存在是病毒复制的 直接标志，提示血液中有HCV存在，可以缩短感染后血清阳转前的检测窗口期，以实现HCV 感染的早期诊断，是诊断丙型肝炎病毒HCV的金标准。但是HCV-RNA在达到峰值或重新出 现前数天或数周内偶尔也可能检测不到。在向慢性转化的大多数感染者中，HCV-RNA含量 逐渐降低，最后趋于稳定，晚期肝病患者的HCV-RNA水平很低，甚至无法测出。HCV-RNA易 被血细胞中的RNA酶降解，因此如果被检标本保存不当(例如反复冻融)将影响检测结果； HCV-RNA还受进食的影响，因食物中的某些成分易与血中脂质及脂蛋白结合，从而降低检出 率。因此在一定程度上影响了核酸扩增检测方法的进一步完善。因为PCR法检测HCV-RNA 影响因素较多，在样本收集、储存和检测方面都有严格的要求，并且PCR的检测操作过程复 杂、费时，需要经过认证的PCR实验室和用特殊的检测仪器才能完成，且试剂盒价格昂贵， 因此在一些基层实验室难以推广应用，在大量筛查献血者血液质量方面受到相当的局限。第三类是丙型肝炎抗原检测丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最为 保守的部分编码而来，在HCV-RNA出现后的1 2d内即出现丙型肝炎病毒HCV抗原，且与 HCV-RNA的水平相平行，可以作为HCV复制的标志。血清中HCV抗原的检测有利于HCV感染 患者的早期发现，特别是某些免疫功能紊乱、免疫功能低下的患者和某些不产生抗体的携 带者。有研究表明，HCV抗原检测与抗HCV抗体检测相比，HCV抗原的检测可使检测的窗口 期平均提前49天，缩短窗口期HCV感染者的献血的风险。与RT-PCR方法相比具有操作简便、时间短、对环境要求低的特点，在临床上可用于早期急性丙型肝炎诊断、抗HCV阳性感 染者的病毒血症分析以及HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析。根据文献检索，目前报道的丙型肝炎病毒HCV抗原检测法主要是使用单克隆抗体 的双抗体夹心法，主要检测HCV核心抗原。该方法是以抗HCV核心抗原单克隆抗体作为固 相包被物，用与固相包被物有不同抗原决定簇的抗HCV核心抗原单克隆抗体作为辣根过氧 化物酶标记物这一系统。但由于HCV核心抗原是HCV结构区抗原的一部分，而血清中可存 在游离的保守性相对较高非结构蛋白NS3，这可能是造成目前HCV抗原检出率低的原因之 一。有文献报道，现有的HCV核心抗原检测试剂盒由于检出率较低尚不适合作临床丙型肝 炎的筛选，但可作为HCV抗体检测的进一步验证，可部分替代HCV-RNA检测。针对目前丙型肝炎病毒核心抗原检出率较低的现状，如果能对非结构区抗原进行 联合检测，就有可能提高HCV抗原的检出率。
发明内容
为解决现有丙型肝炎病毒核心抗原检出率较低的问题，本发明提供一种灵敏度 高，特异性好的HCV抗原检测板。本发明的另一个目的是提供一种灵敏度高，特异性好，操作简便、快捷的用HCV抗 原检测板检测丙型肝炎病毒抗原的方法，以应用于丙型肝炎病毒的科研、临床检验及对众 多献血者的筛查。本发明的第一个目的通过下列技术方案完成一种HCV抗原检测板，其特征在于 将纯化的抗HCV多克隆抗体按常规稀释至5-40 μ 1/ml，按100 μ 1/孔的量加入到聚苯乙烯 板的孔中，2-8°C过夜，洗板；再在聚苯乙烯板的孔中，按150 μ 1/孔的量加入常规牛血清白 蛋白封闭检测板，4°C过夜，洗板，晾干，2-8°C保存，即得HCV抗原检测板。所述纯化的抗HCV多克隆抗体经过下列方法制得A、抗HCV血清的制备Al、取浓度为512-lOMEu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、 NS5、C的等量混合液ι-aiii，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价 检测，效价未达1 4000时，须进行加强免疫注射；A3、当抗HCV血清效价大于1 8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清， 得到抗HCV血清，-600C以下保存待用；B、抗HCV抗体的纯化Bi、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡 液进行平衡；B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至Bl的蛋白 A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的 磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS 透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体。本发明所述HCV抗原检测板具体经过下列方法制得A、抗HCV血清的制备
Al、取浓度为512-lOMEu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原N&、NS4、 NS5、C的等量混合液ι-aiii，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价 检测，效价未达1 4000时，须进行加强免疫注射；A3、当抗HCV血清效价大于1 8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清， 得到抗HCV血清，-600C以下保存待用；B、抗HCV抗体的纯化Bi、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡 液进行平衡；B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至Bl的蛋白 A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的 磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS 透析过夜，收集透析液，即 得纯化的抗HCV多克隆抗体；C、HCV抗原检测板包被Cl、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用常规碳酸盐缓冲液稀释至5_50 μ g/ml, 按50-300 μ 1/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，2-8°C过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3_8 次；C2、在Cl的聚苯乙烯板的孔中，按50_300μ 1/孔的量加入常规牛血清白蛋白，以 对检测板进行封闭，4°C过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3-8次，晾干，2-8°C保存备用，即得 HCV抗原检测板。本发明的第二个目的通过下列技术方案完成用HCV抗原检测板检测丙型肝炎病 毒抗原的方法，其特征在于经过下列步骤A、在所述的HCV抗原检测板的孔中，先加入样品缓冲液50-200 μ 1/孔，再加入待 检样品50-200μ 1/孔，同时加入抗原阳性、阴性对照各2-3孔，设空白调零孔1孔，之后放 入湿盒中，37°C保温0. 5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3_8次；B、在A的检测板的孔中先加入生物素标记的HCV抗体使用液100-300 μ 1/孔，放 入湿盒中，37°C保温0. 5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3 8次；再在检测板的孔中加入 常规辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液100-300 μ 1/孔，放入湿盒中，37°C保温0. 5-3 小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3 8次；或者Bi、在A的检测板的孔中加入辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液100-300 μ 1/ 孔，放入湿盒中，37°C保温0. 5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3 8次；C、在B或Bl的检测板的孔中加入TMB显色液A、B液各50-200 μ 1/孔，混勻，放入 湿盒中，37°C保温5-30分钟，之后加入终止液，50-200 μ 1/孔；D、用波长为450nm的酶标仪对空白孔调零后，测吸光度㈧值；E、结果判定阳性对照平均A值-阴性对照平均A值彡0. 4时，表明检测成立，反之重试；Cutoff 值=阴性对照的平均A值X2. 1，其中，阴性对照的平均A值大于0. 05，按实际值算；阴性对 照的平均A值小于0. 05按0. 05算；样品A值彡Cutoff值，该样品判定为HCV抗原阳性样品，样品A值< Cutoff值，为阴性，该样品判定为HCV抗原阴性样品。所述生物素标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得将常规长臂生物素用注射 用水按常规溶解后，与常规HCV单克隆抗体按1 10克分子比的比例混合；室温下放置30 分钟，或2-8°C冰箱放置2小时后，用磷酸盐缓冲液PBS按常规透析过夜，加等量甘油，-20°C 以下保存备用，得生物素标记的HCV抗体；用磷酸盐缓冲液PBS+2 %体积比的牛血清白蛋白 酶结液稀释生物素标记的HCV抗体至1 500 1 5000的体积浓度，得生物素标记的 HCV抗体使用液。所述辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得按照常规方法将 常规多克隆HCV抗体与常规辣根过氧化物酶标记结合成辣根过氧化物酶标记的HCV抗体 原液；用磷酸盐缓冲液PBS+2 %体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释辣根过氧化物酶标记的 HCV抗体原液至1 1000 1 20000的体积浓度，得辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液。本发明与现有技术相比具有下列优点和效果采用上述方案，即用重组HCV抗原 免疫动物后获得的纯化的抗HCV多克隆抗体包被聚苯乙烯微孔板，获得HCV抗原检测板，再 用长臂生物素标记的单(多)克隆HCV-IgG，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，或者用辣 根过氧化物酶标记的单(多)克隆HCV-IgG作为放大系统，建立的丙型肝炎病毒抗原检测 方法，可减少免疫检测中的步骤，缩短检测时间，并可通过降低交叉反应而降低背景，提高 检测灵敏度，是一种特异性高、灵敏度高，操作简便、快捷的丙型肝炎病毒抗原检测方法，为 HCV感染的早期诊断、大规模快速筛查、定量检测等提供一条可靠的技术路径。表1给出了不同丙型肝炎检测方法的比较结果。表 1比较参 抗HCV抗体检测 数(ELISA)HCV核酸扩增检 HCV核心抗原检测 测(ELISA)本发明检测检测时 间检测原 理易行性样品情况 要求检测 灵敏度检测 窗口期全程2小时酶标板包被核心抗 原、NS3、NS4、NS5 抗原,可与血清中抗 HCV抗体结合全程6小时体外核酸扩增循 环操作简便,无需特殊操作繁琐，需特殊 仪器’检测成本低仪器,检测成本髙全程2. 5小时酶标板包被抗核心 单克隆抗体，只与 血清中游离的核心抗原结合 操作简便，无需特 殊仪器，检测成本 低全程2. 5-3小时酶标板包被多克隆 抗体,可与血清中核 心抗原、NS3等抗原Sn 口操作简便,无需特殊 仪器，检测成本低对样品要求不髙髙 70天对样品要求高(无 溶血，无脂血、无 反复冻融)高 7-14 天对样品要求不高 对样品要求不高低16-21天高16-21天检出率高髙低高
从上表中可以看出，抗HCV抗体的检测由于窗口期较长，易造成对窗口期献血员 的漏检；HCV核酸检测虽可反映病毒在体内的复制状况，且窗口期较短，仅有7-14天，但检 测成本较高，操作繁琐，在技术和设备上要求较高，难以在常规工作或基层实验室推广，限 制了普遍应用；HCV抗原检测窗口期比抗HCV抗体窗口期平均缩短49天，但现有技术中的 常规HCV抗原检测，由于只使用HCV核心抗原单克隆抗体作为固相包被物，只能与核心抗原 结合，血清中游离的核心抗原非常微量，且核心抗原被包膜蛋白包裹，影响抗原的检测，以 上是造成现有技术中的HCV抗原检测法检出率很低的因素。HCV抗原包括多种蛋白(核心 蛋白C、膜蛋白、非结构蛋白NS2、NS3、NS4及NS5)，核心蛋白及NS3在肝细胞胞浆中表达， 可游离存在于血清中，其保守性相对较高，已广泛用于血清学诊断。另外，有些血清中可能 含有一种或多种不同的抗原，有的抗原也因含量太低而不易测出，故阳性率较低。所以，多 种抗原联合检测，可大大提高阳性检出率，这对减少输血后肝炎的发生有一定的价值。本 发明采用多个高度保守区基因表达的重组抗原免疫家兔，获得了特异性的多克隆抗体，经 I^intA/G亲和层析纯化后，其效价没有明显改变，其与HQVg的结合位点多。实验证明，使 用抗多表位抗原的抗体作为固相包被物，不仅能与核心抗原结合，还可以识别HCV-C抗原、 HCV-NS3抗原及HCV-NS5抗原表位，通过与生物素-亲和素酶(或辣根过氧化物酶)放大系 统的有机结合，大大提高了检测的灵敏度和检出率。由于丙型肝炎病毒抗原检测法操作简 便，并且可缩短血清学转换前的窗口期，对于提高窗口期感染者的检出率、提高输血和血制 品的安全性都具有重要意义。丙型肝炎是严重危害人类健康的传染病之一，其中有20% -30%的病人会发展为 肝硬化，有将近一半的人会变为慢性肝炎，导致肝癌的比例远远超过其它型肝炎。目前全世 界HCV感染者超过1亿人，其中我国占4000万，并且呈逐年升高之势。另外丙型肝炎病毒 (HCV)感染人体后，至今还没有有效的疫苗问世，也没有特效的药物治疗，因此早期诊断仍 是防止HCV传播的有效手段。本发明提供的丙型肝炎病毒抗原检测法与目前商售的“丙型 肝炎病毒核心抗原检测法”相比，检测灵敏度明显提高，可提高窗口期的检出率。目前，市场 上没有除HCV核心抗原检测试剂盒外的其他HCV抗原检测试剂盒(多表检测)。本发明在 临床上有很好的应用前景，可利用此方法开发出1-2种多用途诊断试剂产品。
具体实施例方式实施例1HCV抗原检测板的获得A、抗HCV血清的制备Al、取浓度为512Eu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、NS5、 C的等量混合液ani，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价 检测，效价未达1 4000时，须进行加强免疫注射；A3、当抗HCV血清效价大于1 8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清， 得到抗HCV血清，-600C以下保存待用；B、抗HCV抗体的纯化Bi、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡8液进行平衡；B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至Bl的蛋白 A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的 磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS 透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体；B3、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度检测，同 时用HCV分片段抗体试剂盒进行特异性检测，结果表明该纯化的抗HCV多克隆抗体能与 HCV-NS3、HCV-NS5及HCV-C抗原特异性结合；B4、用Iowrry法测定纯化的抗HCV多克隆抗体蛋白含量为6. 15mg/ml，能够满足酶 联免疫(ELISA)检测试剂盒包被及酶标记的需要，将纯化的抗HCV多克隆抗体于-20°C以下 保存备用；B5、经纯化的IgG，效价为1 8 000-1 16 000，与纯化前基本一致，表明所选择 的纯化方法对抗体活性损伤较小；B6、条件试验筛选使用浓度在5-50 μ g/ml间；C、HCV抗原检测板包被Cl、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用常规碳酸盐缓冲液稀释至5 μ g/ml，按 οομ 1/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，2-8°C过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；C2、在Cl的聚苯乙烯板的孔中，按150μ 1/孔的量加入常规牛血清白蛋白，以对检 测板进行封闭，2-8°C过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次，晾干，2-8°C保存备用，即得HCV 抗原检测板。实施例2HCV抗原检测板的获得A、抗HCV血清的制备Al、取浓度为lOMEu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原N&、N、、NS5、 C的等量混合液1ml，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价 检测，效价未达1 4000时，须进行加强免疫注射；A3、当抗HCV血清效价大于1 8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清， 得到抗HCV血清，-600C以下保存待用；B、抗HCV抗体的纯化Bi、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡 液进行平衡；B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至Bl的蛋白 A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的 磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS 透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体；B3、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度检测，同 时用HCV分片段抗体试剂盒进行特异性检测，结果表明该纯化的抗HCV多克隆抗体能与 HCV-NS3、HCV-NS5及HCV-C抗原特异性结合；
B4、用Iowrry法测定纯化的抗HCV多克隆抗体蛋白含量为6. 15mg/ml，能够满足酶 联免疫(ELISA)检测试剂盒包被及酶标记的需要，将纯化的抗HCV多克隆抗体于-20°C以下 保存备用；B5、经纯化的IgG，效价为1 8 000-1 16 000，与纯化前基本一致，表明所选择 的纯化方法对抗体活性损伤较小；B6、条件试验筛选使用浓度在5-50 μ g/ml间；C、HCV抗原检测板包被Cl、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用常规碳酸盐缓冲液稀释至20 μ g/ml，按 100 μ 1/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，4°C过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；C2、在Cl的聚苯乙烯板的孔中，按150μ 1/孔的量加入常规牛血清白蛋白，以对检 测板进行封闭，2-8°C过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次，晾干，2-8°C保存备用，即得HCV 抗原检测板。本发明提供的HCV检测板能与大肠杆菌表达的HCV-NS3、HCV_NS5及哺乳类动物细 胞表达的HCV-C抗原特异性结合，表明有较好的免疫原性(见表2)。表2 HCV多表位抗体与HCV-NS3、HCV-NS5及HCV-C抗原的免疫反应性
权利要求
1.一种HCV抗原检测板，其特征在于将纯化的抗多表位HCV多克隆抗体按常规稀释 至5-50 μ g/ml，按50-200 μ 1/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，2_8°C过夜，洗板；再在聚 苯乙烯板的孔中，按100-300μ1/孔的量加入常规牛血清白蛋白封闭检测板，2-8°C过夜， 洗板，晾干，2-8°C保存，即得HCV抗原检测板。
2.如权利要求1所述的HCV抗原检测板，其特征在于所述纯化的抗HCV多克隆抗体经 过下列方法制得A、抗HCV血清的制备Al、取浓度为512-10MEu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、NS5、 C的等量混合液1-lOml，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价检 测，效价未达1 4000时，须进行加强免疫注射；A3、当抗HCV血清效价大于1 4000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清，得到 抗HCV血清，-20 0C以下保存待用；B、抗HCV抗体的纯化Bi、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡10-60分钟，用2_10个柱体积的常规平 衡液进行平衡；B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至Bl的蛋白A或 蛋白A/G亲和层析柱上，用5-20个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用5-20个柱体积的 磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS 透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体。
3.一种用权利要求1所述HCV抗原检测板检测丙型肝炎病毒抗原的方法，其特征在于 经过下列步骤A、在权利要求1所述的HCV抗原检测板的孔中，先加入样品缓冲液50-200μ 1/孔，再 加入待检样品50-200μ 1/孔，同时加入抗原阳性、阴性对照各2-3孔，设空白调零孔1孔， 之后放入湿盒中，37°C保温0. 5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3_8次；B、在A的检测板的孔中先加入生物素标记的HCV抗体使用液100-300μ 1/孔，放入湿 盒中，37°C保温0. 5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3_8次；再在检测板的孔中加入常规 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液100-300 μ 1/孔，放入湿盒中，37°C保温0. 5-3小 时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3 8次；或者Bi、在A的检测板的孔中加入辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液100-300 μ 1/孔， 放入湿盒中，37°C保温0. 5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3 8次；C、在B或Bl的检测板的孔中加入TMB显色液A、B液各50-100μ 1/孔，混勻，放入湿盒 中，37°C保温5-30分钟，之后加入终止液，50-200 μ 1/孔；D、用波长为450nm的酶标仪对空白孔调零后，测吸光度(A)值；E、结果判定阳性对照平均A值-阴性对照平均A值彡0. 4时，表明检测成立，反之重试；Cutoff值 =阴性对照的平均A值X2. 1，其中，阴性对照的平均A值大于0. 05，按实际值算；阴性对照 的平均A值小于0. 05按0. 05算；样品A值彡Cutoff值，该样品判定为HCV抗原阳性样品，样品A值< Cutoff值，为阴性，该样品判定为HCV抗原阴性样品。
4.如权利要求3所述的检测丙型肝炎病毒抗原的方法，其特征在于所述生物素标记的 HCV抗体使用液经过下列方法获得将常规长臂生物素用注射用水按常规溶解后，与常规 HCV单(多)克隆抗体按1 10克分子比的比例混合；室温下放置30分钟，或4°C冰箱放 置2小时后，用磷酸盐缓冲液PBS按常规透析过夜，加等量甘油，-20°C以下保存备用，得生 物素标记的HCV抗体；用磷酸盐缓冲液PBS+1% -4%体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释生 物素标记的HCV抗体至1 500-1 2000的体积浓度，得生物素标记的HCV抗体使用液。
5.如权利要求3所述的检测丙型肝炎病毒抗原的方法，其特征在于所述辣根过氧 化物酶标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得按常规方法将单(多)克隆HCV抗 体与辣根过氧化物酶标记结合成辣根过氧化物酶标记HCV抗体原液；用磷酸盐缓冲液 PBS+1 % -4 %%体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释辣根过氧化物酶标记HCV抗体原液至 1 1000-1 20000的体积浓度，得辣根过氧化物酶标记HCV抗体使用液。
全文摘要
本发明提供一种HCV抗原检测板及用该板检测HCV抗原的方法，将纯化的抗HCV多克隆抗体按常规稀释至5-50μg/ml，按50-200μl/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，4℃过夜，洗板；再在聚苯乙烯板的孔中，按100-300μl/孔的量加入常规牛血清白蛋白封闭检测板，2-8℃过夜，洗板，晾干，2-8℃保存，得HCV抗原检测板；再用该HCV抗原检测板，并以长臂生物素标记的单(多)克隆HCV-IgG，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，或者用辣根过氧化物酶标记的单(多)克隆HCV-IgG作为放大系统，检测丙型肝炎病毒抗原。可减少检测步骤，缩短检测时间，并可通过降低交叉反应而降低背景，提高检测灵敏度，是一种特异性高、灵敏度高，操作简便、快捷的丙型肝炎病毒抗原检测方法，为HCV感染的早期诊断、大规模快速筛查、定量检测等提供一条可靠的技术路径。
文档编号G01N33/558GK102043048SQ201010295448
公开日2011年5月4日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者崔萍芳, 易红昆, 李华, 李琦涵, 杨蓉, 白惠珠, 董承红, 蒋蕊鞠, 谢忠平, 龙润乡 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所