专利名称：一种基于orf2抗原功能区的检测猪圆环病的方法
技术领域：
本发明涉及畜牧兽医科学技术，特别是一种基于0RF2 (基于开方阅读框2)抗原功 能区的检测猪圆环病的方法。
背景技术：
II型猪圆环病(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，该 病主要引起断奶仔猪发育不良、渐进性消瘦、皮肤苍白或黄疸，呼吸困难，腹泻等多种症状， 临床上由于继发细菌和病毒感染使该病的临床症状复杂且多样。因此，猪感染PCV-2后，可 于5 12周龄时发生PMWS，发病率为5% 30%，死亡率可达10% 30%。世界多个国家 和地区都有对该病的报道，该病毒在我国畜群中也广泛存在。该病已经被世界公认为是猪 的重要传染病且会对全球的猪肉制品进出口业造成严重的经济损失。迄今还没有控制和消灭PMWS的有效措施，也缺乏有效的疫苗来预防PMWS，因此在 加紧开展基础研究工作的同时，尽快建立快速有效的诊断检测方法是防控该病流行最必须 的措施。目前诊断猪圆环病最常用的方法是免疫过氧化物酶单层实验(IPMA)和间接免疫 荧光实验(IFA)。但这些方法的实验操作费时费力，而且在准备感染细胞过程中有散毒的危 险，特别是这些诊断方法为保证做出正确判断需要有经验的研究人员。与这些方法相比，酶 联免疫吸附实验(ELISA)除省时省力自动化程度高，适合进行大批量样品检测外，它还能 最大限度的减少IPMA和IFA造成的人为误差。
发明内容
及时、准确的诊断对疫病的防治是至关重要的，本发明所要解决的技术问题就是 提供一种以大肠杆菌表达的PCV2 0RF2特异抗原片段作为抗原，建立能够从猪群中检测阳 性感染猪的快速、敏感的且能将PCVl和PCV2两种血清型病毒感染区分开的一种基于0RF2 抗原功能区的检测猪圆环病的方法。本发明的技术问题通过下述技术手段解决一种基于0RF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，包括如下步骤(1)设计特异引物，扩增获得0RF2上的氨基酸区段113_147aa的基因片段；(2)将目的基因片段克隆进pGEX-4T-l中，获得重组质粒pGEX-GST-0RF2_E ；(3)在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中诱导表达GST-0RF2-E融合蛋白，并纯化；(4)以纯化蛋白作为抗原包被ELISA 96孔板；(5)加入待检血清；(6)加入HRP标记的二抗，即HRP标记抗猪IgG ；(7)加入盐酸邻苯二胺(OPD)底物溶液进行显色；(8)测定490nm的光密度(OD49tl)并判读结果。所述特异引物的核苷酸序列为0RF2-EF :5’ -GC |GGA TCC| CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC T_3’ ；
0RF2-ER 5' ~GC [CTC GAGj TTAA GCG GGA GGA GTA GTT TAAC A-3’如方框所示，引物中分别引入BamHI和Xho I酶切位点。所述目的基因片段的序列为CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC TCC AGT GCT GTT ATT CTA GAT GAT AAC TTTGTA ACA AAG GCC ACA GCC CTC ACC TAT GAC CCC TAT GTA AAC TAC TCC TCC CGCTAA0所述诱导表达的条件为在含100μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C，250rpm 培养携带重组质粒PGEX-GST-0RF2-E的大肠杆菌BL21 (DE3)，直至菌液的0D_值介于 0. 6-0. 8，加入IPTG至终浓度0. ImM，继续培养3小时，离心收集细菌沉淀。所述纯化GST-0RF2-E的方法为谷胱甘肽亲和层析柱层析法，具体步骤为用 IXPBS悬浮细菌沉淀并超声处理IOmin (power3，on 30sec ；off 30sec)，离心取上清，与经 IXPBS平衡的Glutathione Sepharosw 4B在室温振荡混合30min，将混合物转移至层析柱 中，用1XPBS清洗柱子，用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。所述抗原的浓度为0. 5 μ g/mL。所述HRP标记抗猪IgG的稀释度为1 3000;所述实验血清的稀释度为1 100，用含0. 1% Tween20和5% (w/v)脱脂奶粉的 PBS作为封闭液，用含0. 1% Tween20和(w/v)脱脂奶粉的PBS作为稀释液。所述判断标准为，OD490大于或等于0. 22为阳性，OD490小于0. 22为阴性。PCV2的0RF2作为其主要结构蛋白，常被用于建立不同诊断方法和疫苗的抗原蛋 白。本发明以PCV20RF2上的特定氨基酸区段(113-147aa)为目标，将其与GST融合表达得 到GST-0RF2-E融合蛋白，利用亲和层析柱将融合蛋白纯化后作为抗原包被ELISA 96孔板， 建立间接ELISA方法，本方法中选择的特定氨基酸区段是PCV2 0RF2上抗原性较高的区段， 将其作为ELISA包被抗原，提高了传统PCV2ELISA方法的灵敏度和特异性，与常规应用的免 疫荧光检测方法相比，该法的特异性和敏感性分别为87. 7%和93. 57%。由于0RF2在PCVl 和PCV2间无抗原交叉，能够用于鉴别诊断PCVl和PCV2的感染，高免疫原性氨基酸区段的 应用，进一步提高了这一特异性。用该方法检测了 46份血清，包括实验感染PCVl和PCV2 的动物血清和健康动物血清。结果99%的的PCV2感染动物血清为阳性，97%的PCVl感染 动物血清为阴性，100%的健康动物血清为阴性。说明本发明可以鉴别PCVl和PCV2感染的 动物。
具体实施例方式实施例1.弓丨物的设计和目的基因的PCR扩增资料 艮道(MaheD, Blanchard P, Truong C, Arnauld C, Le Cann P, CarioletR, Madec F, Albina E, Jestin Α. 2000. Differential recognition of 0RF2protein from type land type 2porcine circoviruses and identificationof immunorelevant epitopes. J Gen Virol. 81 (Pt 7) :1815_1824.)，在PCV2编码的蛋白上有五个主要免疫反 应区，其中一个在ORFl蛋白编码区上，其他四个在0RF2上。由于只有在0RF2上的抗原功 能区(113-147)是最有效的，并可能成为主要抗原用于研制检测畜群PCV2感染的ELISA试 剂盒。在本发明中选择0RF2上的该氨基酸区段(113-147)作为目的抗原进行克隆表达，其基因片段全长102bp。以PCV2 0RF2全基因为模板，设计两条特异引物，通过PCR扩增 技术获得位于0RF2蛋白序列上113-147aa特异抗原区段的基因片段。PCR反应体系为 10XPCR buffer 5 μ 1, pfu DNA Pol ymerase 0· 25 μ 1 (5U/μ 1)，dNTPl μ 1 (10mmol/L)，模 板0. 5μ 1，上下游引物个0. 5μ αομπιο /υ，双蒸水补足50μ 1。扩增条件为94°C预变 性 2min，然后 94°C 20s, 60°C 20s, 72°C 30s, 30 个循环，最后 72°C延伸 8min。引物序列如下，如方框所示，在引物中分别引入BamH I和Xho I酶切位点0RF2-EF :5’ ~GC |GGA TCC CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC T-3’ ；0RF2-ER :5，-GC CTC GAG TTA GCG GGA GGA GTA GTT TAC A-3，目的基因序列为CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC TCC AGT GCT GTT ATT CTAGAT GAT AAC TTT GTA ACA AAG GCC ACA GCC CTC ACC TAT GAC CCC TAT GTA AACTAC TCC TCC CGC TAA02.重组载体的构建和目的基因的诱导表达及纯化凝胶回收纯化所扩增的基因片段，用BamH I和Xho I双酶切所纯化的基因片段和 PGEX-4T-1载体，再次凝胶纯化经双酶切的基因片段和载体，然后用T4DNA快速连接酶连接，连接体系为10X Ii gase buffer Ιμ ，酶切纯化的目的基 因片段5μ 1，载体pGEX-4T-lll·! 1，T4 DNA快速连接酶1 μ 1，双蒸水补足10 μ 1，室温连接 15min。将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，铺LB平板于37°C培养过夜，挑取单克 隆菌落进行PCR鉴定，并测序确证，阳性重组质粒命名为PGEX/0RF2-E。将重组质粒pGEX/ 0RF2-E转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达。所述诱导表达的条件为在含IOOyg/ mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C，250rpm培养携带重组质粒pGEX/0RF2_E的大肠杆菌 BL21 (DE3)，直至菌液的OD600值介于0. 6-0. 8，加入IPTG至终浓度0. ImM,继续培养3小时， 离心收集细菌沉淀。GST-0RF2-E融合蛋白应用谷胱甘肽亲和层析柱进行纯化。具体步骤为用IXPBS悬浮细菌沉淀并超声处理IOmin(超声10s，间歇10s)，离心取上清， 与经IXPBS平衡的谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione Sepharosw 4B)在室温振荡混合 30min，将混合物转移至层析柱中，用IXPBS清洗柱子，用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱融合蛋 白。SDS-PAGE和Western-blotting结果显示，融合蛋白的大小约29KDa。在超声并离心之 后的菌液上清和沉淀中都有融合蛋白存在，在上清液中融合蛋白GST-0RF2-E的量要比在 沉淀中的多，这说明表达的融合蛋白GST-0RF2-E大部分是可溶的，这有利于蛋白纯化并最 大可能的保证了蛋白的自然活性。用GST单抗做的Western-blotting也进一步证实融合 蛋白GST-0RF2-E在细菌中正确表达。为了证实融合蛋白GST-0RF2-E的抗原性，用抗PCV2 猪血清作为一抗进行western-blotting。结果显示阳性血清有显著的特异条带而阴性血清 无条带出现。同样，纯化后的蛋白在western-blotting中，可以用抗GST的单抗和猪血清 检测到。3. ELISA 操作步骤(1)包被用包被液(0. 05M碳酸钠缓冲液，pH9. 6)稀释GST_0RF2_E融合蛋白至工 作浓度，加入96孔酶标板(Nunc Maxisorp)，每孔100 μ 1，4°C包被过夜。PBST清洗两遍，拍干。(2)封闭每孔加入100 μ 1封闭液(含0. 1 % Tween20和5% (w/v)脱脂奶粉的 PBS)，37°C封闭lh。PBST洗两遍，拍干。(3)与一抗(待检血清)结合将待检血清、阳性血清和阴性猪血清分别用稀释液 (含0. Tween20和(w/v)脱脂奶粉的PBS)稀释后加于已封闭的孔板中，每孔加入 100μ 1，于37°C孵育lh，PBST清洗三遍，拍干。(4)与二抗(HRP-IgG)结合用含1 %脱脂牛奶的PBST将HRP标记的二抗(Dako) 稀释至工作浓度，每孔100 μ 1加于96孔酶标板中，于37°C孵育lh。PBST洗三遍，拍干。(5)显色每孔加入50 μ 1盐酸邻苯二胺快速显色液(FASTo-phenylenediamine dihydrochloride, 0PD, Sigma)，于 37°C孵育 15min。(6)终止每孔加入50 μ 1终止液(2Μ H2S04)，检测490nm光密度(0D490)。抗原的工作浓度用棋盘滴定法进行确定。具体方法为取96孔酶标板2块，将纯 化的重组抗原用0. 05M碳酸钠缓冲液(pH9. 6)做1 10、1 20、1 140至1 1280的 稀释，从左向右依次加入第1-8列，每个稀释度8个重复，每孔100 μ 1，4°C包被过夜。PBST 洗两遍，拍干。每孔加入100μ 1含5%脱脂奶奶的PBST，37°C封闭lh。PBST洗两遍，拍干。 将标准阳性血清、标准阴性血清用含(w/v)脱脂奶粉的PBS做1 10、1 20,1 140 至1 1280的稀释，从上至下分别加入到A-H的微孔中，每个稀释度8个重复，每孔100μ1， 于37°C孵育lh，PBST清洗三遍，拍干。每孔加入50 μ 1盐酸邻苯二胺快速显色液(FAST o-phenylenediaminedihydrochloride，OPD，Sigma)，于 37°C孵育 15min，最后每孔加入 50 μ 1 终止液(2Μ H2S04)，检测490nm光密度(0D490)。最终确定的抗原最佳浓度为0. 5 μ g/ml, 实验血清的稀释度确定为1 100。以这一抗原浓度用同样的棋盘滴定法确定HRP标记抗 猪IgG的稀释度为1 3000。为了确定GST标签是否影响GST-0RF2-E ELISA的结果，本 发明分别用纯化的GST和GST-0RF2-E包被96孔板，并对已知的10份阳性和10份阴性血 清检测其OD49tlt5统计学分析(两样品配对T检验)显示以GST-0RF2-E为抗原检测的阳性 血清的平均OD49tl值显著大于用GST作为抗原的检测结果(P < 0. 01)，而以GST-0RF2-E为 抗原检测的阳性血清和阴性血清的平均OD49tl值之间也有显著差异(0. 01 < P < 0. 05)。同 时，用GST作为抗原检测的阳性血清和阴性血清的平均OD49tl没有显著差异(P > 0. 05).4.间接免疫荧光(IFA)在感染前一天，将100 μ 1浓度为5X104cells/ml的PK-15细胞以加入96孔板， 24小时后，将MOI为0. 1的PCV2接种于96孔板的第1、3、5和第7排，第2、4、6和8排分 别设为阴性对照。细胞在感染后4-6小时期间用溶于Hank，s液的300mM D-glucosamine 37°C处理20-30min，随后继续于37°C 5% C02培养箱中孵育72h.细胞用4% PFA(多聚甲 醛)室温固定 30min 并用 PBST (PBSpH 7. 4containing 0. 1 % Tween-20)清洗两遍.细胞随 后用0. Triton X-100于室温处理lOmin。PBST清洗后加入1 50倍稀释(包含5% FBS的PBST)的猪血清37°C孵育lh. PBST清洗三次后.加入用包含5% FBS的PBST倍稀释 的FITC标记的兔抗猪免疫球蛋白(1 100，Dako)，37°C孵育lh，PBST清洗两遍后直接于 荧光显微镜下观察染色结果。5.阴阳性临界值的确定阴阳性临界值由GST-0RF2-E ELISA的25个阴性血清的OD值平均值和25个阳性血清的OD值平均值决定。每一次实验的阴阳性极限用Microsoft Excel软件计算得到。确 定实验的临界值是为了实验的敏感性(DSn)和实验的特异性(DSp)最大化，假阴性和假阳 性的总数最小化。阴性血清的OD490值从0. 068到0. 209，其平均OD值为0. 12466。以此获 得了合适的临界OD值为0. 224313 (mean士3SD)并说明99%的阴性血清的OD值低于0. 22， 以此设定阳性的最低限为0. 22.6.实验重复性的确定选择10份阳性血清和10份阴性血清用于重复性实验的确定。对于批内重复 性(板内重复)每一血清样品的三次重复加于同一多孔板中。对于批间重复性(不同实 验板)，每一血清样品的三次重复在不同次加于不同板。计算出每次实验中三次重复的 平均OD值、标准差(SD)和变异系数(CV)。试验结果显示实验是可重复的。10份阳性血 清样品的批内CV范围为0. 12-14. 87 %，中间值为2. 34 %，阴性血清样品的批内CV范围 为0.46-6. 45%，其中间值为2. 17% .阳性血清的批间CV从11. 26-37. 04%，中间值为 19. 03%，而阴性血清的CV从10. 16到38. 26%，中间值为31. 74%。7.实验特异性和敏感性的确定实验敏感性(DSn)特异性(DSp)用以下公式计算DSn = TP/(TP+FN) X 100 (TP 是真阳性、FN是假阴性)；DSp = TN/(TP+TN) X 100 (TN是真阴性、FP假阳性)。精确性是 (TP+TN) /被检血清总数X 100。PCV2GST-0RF2-E ELISA的结果由288份血清样品获得。通过比较ELISA与IFA的 结果，说明ELISA的准确性和敏感性比IFA的高。在IFA的结果中阴性血清和阳性血清分 别为8和280 ；而ELISA的结果中阴性血清和阳性血清分别为25和263。特异性=100X(ELISA 阴性数)/(IFA 总阴性数)=100X7/8 = 87. 7%敏感性=100X(ELISA 阳性数)/(IFA 总阳性数)=100X262/280 = 93. 57% ·符合率为2. 43% +90. 97%= 93. 4% .8. ELISA 和 IFA 的相关性16份PCV2感染猪血清的ELISA结果(0D值)与用PCV2感染细胞检测的IFA结 果进行比较。相应的血清在IFA中从1 50到1 51，200进行系列稀释。IFA中的血清 滴度和ELISA OD值之间的相关性由Spearman’ s相关系数表示。结果显示，IFA滴度的对 数值与 GST-0RF2-E ELISA 的 OD 值之间存在线性关系(spearman’ s rank correlation = 0. 9665 ；P < 0. 0001) [IFA 滴度的回归方程式=1. 21339*A490+3. 41189 (r2 = 0. 7897，P < 0. 001)]。这说明GST-0RF2-E ELISA的OD值可用于估计IFA滴度。9.用所建立的ELISA方法鉴别PCVl和PCV2感染的动物用该方法检测了 46份血清，包括实验感染PCVl和PCV2的动物血清和健康动物血 清。结果99%的的PCV2感染动物血清为阳性，97%的PCVl感染动物血清为阴性，100%的 健康动物血清为阴性。说明本发明可以鉴别PCVl和PCV2感染的动物。
权利要求
一种基于ORF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，其特征在于包括如下步骤设计特异性引物，扩增获得ORF2上的氨基酸区段113 147aa的基因片段；将目的基因片段克隆进pGEX 4T 1中，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达GST ORF2 E融合蛋白，并纯化；以纯化蛋白作为抗原包被96孔ELISA板；加入待检血清；加入HRP标记的二抗，即HRP标记抗猪IgG；加入盐酸邻苯二胺(OPD)快速显色液进行显色；测定490nm的光密度(OD490)并判读结果。
2.根据权利要求1所述的一种基于0RF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，其特征在 于所述特异引物的核苷酸序列为0RF2-EF 5' -GC GGA TCC CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC T-3'； 0RF2-ER :5’ -GC CTC GAG TTA GCG GGA GGA GTA GTT TAC A-3’ 引物中分别引入BamHI和XhoI酶切位点。
3.根据权利要求1所述的一种基于0RF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，其特征在 于所述目的基因片段的序列为CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC TCC AGT GCT GTT ATT CTA GAT GAT AAC TTTGTA ACA AAG GCC ACA GCC CTC ACC TAT GAC CCC TAT GTA AAC TAC TCC TCC CGCTAA0
4.根据权利要求1所述的一种基于0RF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，其特征在 于所述诱导表达的条件为在含100yg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C，250rpm培养 携带重组质粒PGEX-GST-0RF2-E的大肠杆菌BL21 (DE3)，直至菌液的OD6tltl值介于0. 6-0. 8， 加入IPTG至终浓度0. ImM，继续培养3小时，离心收集细菌沉淀。
5.根据权利要求1所述的一种基于0RF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，其特征在 于所述纯化GST-0RF2-E的方法为谷胱甘肽亲和层析法。
6.根据权利要求1所述的一种基于0RF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，其特征 在于所述抗原的工作浓度为0. 5 μ g/mL。
7.根据权利要求1所述的一种基于0RF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，其特征在 于所述HRP标记抗猪IgG的稀释度为1 3000。
8.根据权利要求1所述的一种基于0RF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，其特征在 于所述实验血清的稀释度为1 100，用含0. 1% Tween20和(w/v)脱脂奶粉的PBS作 为稀释液。
9.根据权利要求1所述的一种基于0RF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，其特征在 于所述判断标准为，0D490大于或等于0. 22为阳性，0D490小于0. 22为阴性。
10.根据权利要求1所述的一种基于0RF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，其特征 在于该方法可用于鉴别PCVl和PCV2感染的动物。
全文摘要
一种基于ORF2抗原功能区的检测猪圆环病的方法，以PCV2 ORF2上的特定氨基酸区段(113-147aa)为目标，将其与GST融合表达得到GST-ORF2-E融合蛋白，利用亲和层析柱将融合蛋白纯化后作为抗原包被ELISA 96孔板，建立间接ELISA方法，本方法中选择的特定氨基酸区段是PCV2 ORF2上抗原性较高的区段，将其作为ELISA包被抗原，提高了传统PCV2 ELISA方法的灵敏度和特异性，与常规应用的免疫荧光检测方法相比，该法的特异性和敏感性分别为87.7％和93.57％。由于ORF2在PCV1和PCV2间无抗原交叉，能够用于鉴别诊断PCV1和PCV2的感染。用该方法可以鉴别PCV1和PCV2感染的动物。
文档编号G01N33/569GK101936993SQ20101024135
公开日2011年1月5日 申请日期2010年7月24日 优先权日2010年7月24日
发明者刘湘涛, 孙世琪, 尚佑军, 尹双辉, 才学鹏, 殷宏, 郭慧琛 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所