一种可视化检测抗原-抗体反应的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种可视化检测抗原-抗体反应的方法及其应用，所述方法利用酶催化底物反应产生具有还原性的产物，其将二价铜离子还原成一价铜离子，通过表面功能化的金纳米粒子和一价铜催化的点击化学反应来可视化地分析酶的含量；结合酶标记抗体技术，将酶标记的抗体用于抗原-抗体相互作用的免疫分析中，利用所述可视化分析酶含量的方法达到可视化分析抗原-抗体相互作用的目的；将所述方法用于临床样本中相关抗原抗体的可视化检测。本发明仅靠肉眼即可完成对抗原-抗体反应的检测，具有灵敏度高，操作简单，成本低，稳定性好等优点。
【专利说明】一种可视化检测抗原-抗体反应的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫检测分析【技术领域】。具体涉及一种检测抗原-抗体反应的方法及 其应用，尤其涉及一种可视化检测抗原-抗体反应的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 免疫标记分析方法是将免疫反应的高特异性和生物标记的高灵敏性结合在一起 而发展出来的生物分析方法。这一分析方法不仅灵敏度高、特异性强、重复性好、准确性高， 而且操作简单，易于商品化和自动化。
[0003] 免疫标记分析方法的应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、核酸、细 胞表面抗原、肿瘤标志物等各种具有生物活性的物质，对基础医学研究和临床医学发展起 到了促进作用。按照不同标记物可以分为放射性免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析、化 学发光免疫分析、胶体金免疫分析等。
[0004] 其中，酶免疫标记操作简便，使用成本低廉，目前在临床医学诊断中应用最为广 泛。虽然被广泛应用于实验研究和临床诊断，但是现有的酶联免疫分析方法需要使用酶标 仪来进行检测信号的读出，对仪器的依赖性限制了其在条件落后及不发达地区的开展和应 用。
[0005] 因此，发展一种简单有效、便于开展和无需仪器读出的免疫分析方法有着重大的 需求，这对改善条件落后和不发达地区的医疗诊断状况具有十分重要的意义。
[0006] 纳米技术是当前的热门研究领域，纳米材料在生物医学研究中扮演着越来越重要 的角色。由于其独特的光学性质，不同聚集状态的金纳米粒子在可见光范围内呈现不同的 颜色，这为发展肉眼可视化的生化分析检测方法提供了良好的平台。
[0007] 目前，对于可视化检测抗原-抗体反应的方法已有诸多相关专利申请公开，例如， CN102269758A公开了一种可视化检测抗原抗体反应的方法、试剂盒及其应用，其主要是采 用氧化铜纳米颗粒标记抗体技术达到可视化检测的目的；CN101639476A公开了一种可视 化结核抗体检测蛋白芯片、制备方法及用途，其利用的主要是蛋白芯片技术和免疫金银染 色读出方法；CN103645185A和CN103713134A都披露了一种可视化检测碱性磷酸酶的方法， 均采用碱性磷酸酶可以诱导金属银单质沉积到纳米金表面形成金核银壳结构的特点实现 可视化检测；CN101504416A公开了一种金包覆磁粒原位引发高灵敏化学发光检测大肠杆 菌的新方法，该发明的重点在于表面覆盖金的磁性纳米颗粒的制备以及化学发光方法的读 出；等等。
[0008] 蒋兴宇等报道了通过合成表面功能化的金纳米粒子，利用一价铜催化的点击化学 反应来检测溶液中的二价铜离子（参考文献：Yang Zhou, Shixing Wang, Ke Zhang, Xingyu Jiang. Angew. Chem. Int. Ed. 2008,47,7454-7456)。与传统的仪器分析方法相比，利用金纳 米粒子结合点击化学反应进行铜离子检测的方法具有快速简便、选择性好、灵敏度高、成本 低廉的特点，适合现场实时检测。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种检测抗原-抗体反应的方法及其应用，特别是一种可 视化检测抗原-抗体反应的方法及其应用。
[0010] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0011] 一方面，本发明提供一种可视化检测抗原-抗体反应的方法，该方法包括以下步 骤：
[0012] (1)抗原抗体反应：将酶标记的抗体加入到包被的待检测样品中，充分反应后洗 漆去除未反应的酶标记抗体；
[0013] (2)酶催化底物反应：向步骤（1)反应体系中加入酶的底物，使酶和底物充分反 应；
[0014] (3)可视化检测：向步骤（2)反应体系中加入二价铜离子和表面功能化的金纳米 粒子，充分反应后根据反应体系颜色的变化判断样品中是否发生反应。
[0015] 作为优选技术方案，在步骤（1)之前还包括对待检测样品进行封闭的步骤，该处 理的目的在于是标记的抗体能够与待检测样品进行充分而稳定的反应。
[0016] 优选地，所述封闭试剂为动物血清，例如可以是胎牛血清、山羊血清或马血清中的 任意一种，进一步优选地，所述封闭试剂为胎牛血清。
[0017] 优选地，所述封闭时间为30-120分钟，封闭温度为25_40°C ;进一步优选地，所述 封闭时间为60分钟；封闭温度为37°C。
[0018] 作为优选技术方案，在步骤（1)中，所述酶为辣根过氧化物酶（HRP)或碱性磷酸酶 (ALP)，优选为碱性磷酸酶（ALP)。
[0019] 优选地，所述酶标记的抗体为一抗或二抗。
[0020] 优选地，所述抗原-抗体反应的孵育时间为30-120分钟，孵育温度为25-40°C ;进 一步优选地，所述孵育时间为60分钟，孵育温度为37°C。
[0021] 作为优选技术方案，在步骤（2)中，所述酶的底物为磷酸化抗坏血酸、磷酸化柠檬 酸、磷酸化抗坏血酸钠或磷酸化柠檬酸钠中的任意一种；优选为磷酸化抗坏血酸钠。
[0022] 优选地，所述酶的底物浓度为l_500mM，优选为20mM。
[0023] 优选地，所述酶与底物反应的时间为5-180分钟，优选为60分钟。
[0024] 作为优选技术方案，在步骤（3)中，所述二价铜离子为硫酸铜、硝酸铜或氯化铜中 的任意一种，优选为硫酸铜。
[0025] 优选地，所述二价铜离子的浓度为0. Ol-lOmM，优选为0. 5mM。
[0026] 作为优选技术方案，在步骤（3)中，所述加入的表面功能化的金纳米粒子为表面 炔基功能化的金纳米粒子和表面叠氮基功能化的金纳米粒子的组合。
[0027] 优选地，所述表面炔基功能化的金纳米粒子的炔基为包含化学式I的化合物：
[0028]
【权利要求】
1. 一种可视化检测抗原-抗体反应的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 抗原抗体反应：将酶标记的抗体加入到包被的待检测样品中，充分反应后洗涤去 除未反应的酶标记抗体； (2) 酶催化底物反应：向步骤（1)反应体系中加入酶的底物，使酶和底物充分反应； (3) 可视化检测：向步骤（2)反应体系中加入二价铜离子和表面功能化的金纳米粒子， 充分反应后根据反应体系颜色的变化判断样品中是否发生反应。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1)之前还包括对待检测样品进行 封闭的步骤； 优选地，所述封闭试剂为动物血清；进一步优选地，所述封闭试剂为胎牛血清； 优选地，所述封闭时间为30-120分钟，封闭温度为25-40°C ;进一步优选地，所述封闭 时间为60分钟；封闭温度为37°C。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤（1)中，所述酶为辣根过氧化 物酶（HRP)或碱性磷酸酶（ALP)，优选为碱性磷酸酶（ALP); 优选地，所述酶标记的抗体为一抗或二抗； 优选地，所述抗原-抗体反应的孵育时间为30-120分钟，孵育温度为25-40°C ;进一步 优选地，所述孵育时间为60分钟，孵育温度为37°C。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在步骤（2)中，所述酶的底物为 磷酸化抗坏血酸、磷酸化柠檬酸、磷酸化抗坏血酸钠或磷酸化柠檬酸钠中的任意一种；优选 为磷酸化抗坏血酸钠； 优选地，所述酶的底物浓度为l_500mM，优选为20mM ; 优选地，所述酶与底物反应的时间为5-180分钟，优选为60分钟。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，在步骤（3)中，所述二价铜离子 为硫酸铜、硝酸铜或氯化铜中的任意一种，优选为硫酸铜； 优选地，所述二价铜离子的浓度为0. Ol-lOmM，优选为0. 5mM。
6. 根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，在步骤（3)中，所述加入的表面 功能化的金纳米粒子为表面炔基功能化的金纳米粒子和表面叠氮基功能化的金纳米粒子 的组合； 优选地，所述表面炔基功能化的金纳米粒子的炔基为包含化学式I的化合物：
优选地，所述表面叠氮基功能化的金纳米粒子的叠氮基为包含化学式II的化合物：
优选地，所述表面叠氮基功能化的金纳米粒子和表面炔基功能化的金纳米粒子的摩尔 比为1 :(〇. 5-2)，优选为1 :1。
7. 根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，在步骤（3)中，所述反应体系的 颜色变化在5-30分钟内出现，优选为10-15分钟。
8. 根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述待检测样品包括临床检测 样品；优选地，所述待检测样品为人抗肺炎支原体IgG。
9. 根据权利要求1-8任一项所述的方法在生物医学和/或医学检验中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述方法用于人抗肺炎支原体IgG的 可视化检测。
【文档编号】G01N21/76GK104089950SQ201410338965
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】蒋兴宇, 鲜于运雷, 王卓 申请人:国家纳米科学中心