一组结核病相关的外周血淋巴细胞miRNA及其应用的制作方法

本发明属于动物生化免疫
技术领域：
，具体涉及一组结核病相关的外周血淋巴细胞mirna及其应用。本发明的外周血淋巴细胞mirna组合物可以作为早期检测人结核病的标识物。
背景技术：
：结核病是人类最古老的传染病之一，至今依然是单一感染因素引起死亡人数最多的疾病，我国是全球22个结核高负担国家之一。因此提高对结核病的诊断水平对结核病的预防和治疗意义重大。通常疑似结核患者要细菌学检测，抗酸检测，结核菌素试验(ppd试验)，胸部ct，血结核抗原抗体检测等，但这些方法耗时长，对样本保存条件要求高会检出率不高等缺陷，一直困扰结核病的诊断和治疗。所以结核病的分子生物学研究日益受到国内外的重视，希望从分子水平揭示结核病发生，发展，转移及转归，从而提高结核病的诊治水平。microrna(或称mirna)，mirna是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源于内源性染色体的非编码单链调节rna，长度约为22(18～25)个核苷酸，是由一段具有发夹环结构的长度为70～80核苷酸的单链rna前体剪切后生成的短序列。mirna以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区，其转录独立于其他基因，并不翻译成蛋白质，而是通过阻遏或降解相应的mrna使蛋白质的表达水平发生变化，从而在体内代谢过程中起到多种调控作用。例如，有些mirnas直接与靶基因碱基互补配对或不完全配对发挥作用，有些则需要和蛋白质结合后再发挥作用，但是它们的共性是不编码蛋白质，它们作为rna分子直接发挥着调控作用。对这些mirna进行深入的研究，将对深入理解生命本质以及人类疾病的防治具有重要的意义。在感染性疾病中，人们发现感染的病毒或细菌能够通过基因沉默机制躲避宿主免疫系统的监视，并且可以依靠mirna对抗宿主细胞的免疫反应。作为基因表达的调控因子，每个mirna可以调节数百个靶基因，其在细胞增殖、分化、凋亡，发育、器官形成等一系列生命过程中发挥着重要作用。在结核病的发生发展机制中，mirna不仅可以通过标记到基因上进行靶向调控，也可以通过高甲基化抑制免疫系统调控。如mirna可以调控凋亡调节蛋白bcl2基因的编码，在结核分枝杆菌无毒菌株侵染的情况下，刺激巨噬细胞凋亡，可避免细菌逃离免疫系统识别。近年来大量研究证明mirna在外周血淋巴细胞中稳定表达，且组织细胞内外的mirna的表达谱是不一样的，mirna选择性的释放到外周血中，这种选择性机制对体液mirna作 为疾病诊断的潜在性无创生物标识物起着重要的作用。mirna在血液中可长期稳定存在，rna酶降解煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等各种处理方法均不会造成外周血mirna的损失，正是外周血淋巴细胞mirna良好的稳定性，为循环mirna的检测，及其在科学研究和临床上的应用打下了良好的基础。在众多mirna中，has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p在胃癌，食道癌，乳腺癌，非小细胞癌和直肠癌中表达异常并可能参与癌症的进程，且有报道显示has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p在免疫应答中起重要作用，然而本领域仍不知道其在结核病发生中的具体情况，还没有报道对其在结核患者外周血中的作用进行研究和开发。技术实现要素：本发明目的在于克服现有技术的不足，所要解决的技术问题是提供一组用于结核病早期诊断的外周血淋巴细胞mirna标识物，利用该外周血淋巴细胞mirna标识物早期诊断受试者是否罹患结核病。具体地，本发明建立了结核患者早期外周血淋巴细胞mirna检测方法。其中的mirna包括：循环has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p组合物，优选是联合使用，其序列如下：标志蛋白has-mir-374b-5p的mirna序列：gacuauagaacuuucccccuca；标志蛋白has-mir-625-3p的mirna序列：gacuauagaacuuucccccuca；标志蛋白has-mir-362-5p的mirna序列：aauccuuggaaccuaggugugagu。本发明还同时提供了一种结核病检测的标志蛋白的引物用于结核病检测的荧光定量检测引物组合，该引物组合包括如表1所述的外周血mirna标志蛋白中各mirna的检测引物。表1本发明中各组标志蛋白mirna对应的引物序列对应的mirna引物序列has-mir-374b-5pgactatagaactttccccctcahas-mir-625-3pgactatagaactttccccctcahas-mir-362-5paatccttggaacctaggtgtgagt本发明还提供了一组用于结核病检测的荧光定量检测引物组合,该荧光定量检测引物包括标志蛋白has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p三种mirna的检测引物。本发明还同时提供了外周血mirna标志蛋白在制备结核病早期诊断试剂或诊断工具(如试剂盒)中的应用。本发明还同时提供了外周血mirna检测引物在制备结核病早期诊断试剂或工具(如试剂盒)中的应用。本发明还提供了mirna表达量的检测方法及其应用。本发明提供了mirna生物标志蛋白的基于加尾的反转录-荧光定量pcr技术(sybrgreen染料法)。具体包括以下步骤：用常用的细胞总rna提取法从早期结核患者和健康人对照的外周血淋巴细胞中提取总rna，通过常用的all-in-onetmqrt-pcr方法，扩大样本量对候选mirna进行验证，建立早期结核患者外周血has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p的标志蛋白。采用roc和多元逻辑回归分析方法评价外周血淋巴细胞has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p的组合物的表达在结核患者早期诊断中的应用，以及所述的结核病早期外周血淋巴细胞mirna生物标识物在制备早期结核病检测试剂盒中的应用。本发明首次发现外周血淋巴细has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p的表达的组合物作为一个重要的生物学检测标识物，在结核病的早期诊断中的作用，为今后结核病外周血mirna的研究提供了依据，并为从分子水平进行结核病血液学诊断提供了新方向，具有重要的理论价值和潜在实用意义。附图说明序列表seqidno:1是标志蛋白has-mir-374b-5p的mirna序列。序列表seqidno:2是标志蛋白has-mir-625-3p的mirna序列。序列表seqidno:3是标志蛋白has-mir-362-5p的mirna序列。序列表seqidno:4是检测标志蛋白has-mir-374b-5p的引物序列。序列表seqidno:5是检测标志蛋白has-mir-625-3p的引物序列。序列表seqidno:6是检测标志蛋白has-mir-362-5p的引物序列。图1：外周血has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5pmirna序列在早期结核患者和健康对照者中的差异表达。附图标记说明：图1中的a图是mir-625-3p在两组人中的相对表达量比较图；图1中的b图是mir-362-5p在两实验组中的相对表达量比较图：图1中c图是mir-374-5p在两组中的相对表达量比较图。图2：外周血has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p的roc曲线分析图。附图标记说明：图2中的a图是mir-625-3p的roc曲线分析图；图2中的b图是mir-362-5p的roc曲线分析图：图2中c图是mir-374-5p的roc曲线分析图。图3：多元逻辑分析外周血has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p组合物的roc曲线分析图。具体实施方式以下通过mirna生物标志蛋白在结核病诊断的实施例对本发明进行详细说明。本发明提供了mirna生物标识物的基于加尾的反转录-荧光定量pcr技术(即sybrgreen染料法)。具体包括以下步骤：用常规细胞总rna提取法从早期结核患者和健康人对照的外周血淋巴细胞中提取总rna，通过all-in-onetmkitqrt-pcr方法(simonee.barry，2015)，扩大样本量对候选mirna进行验证，建立早期结核患者外周血循环has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p的表达组合物。早期结核病患者外周血循环has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p的表达组合物至少是下列序列的组合：标志蛋白has-mir-374b-5p的mirna序列：gacuauagaacuuucccccuca(见seqidno：1)；标志蛋白has-mir-625-3p的mirna序列：gacuauagaacuuucccccuca(见seqidno：2)22bp；标志蛋白has-mir-362-5p的mirna的序列：aauccuuggaaccuaggugugagu(见seqidno：3)。本发明还同时提供了一种用于上述标志蛋白mirna检测的荧光定量检测的引物组合，该引物组合如下所示；(1)检测标志蛋白has-mir-374b-5p的mirna引物：gactatagaactttccccctca(见seqidno：4)；(2)检测标志蛋白has-mir-625-3p的mirna引物：gactatagaactttccccctca(见seqidno：5)；；(3)检测标志蛋白has-mir-362-5p的mirna引物：aatccttggaacctaggtgtgagt(见seqidno：6)。实施例2本发明的外周血淋巴细胞mirna标志蛋白的引物的应用1.外周血淋巴细胞mirna标志蛋白的检测方法(1)外周血样本收集收集51例新发结核病患者和40例健康对照同时系统收集完整的人口学和临床检验资料。病例来源于当地结核病专业医院(武汉市医疗救治中心)收集的结核病确诊病例(排除了hiv病人)，确诊方法包括：痰涂片镜检，ppd试验，血结核抗原抗体检测，胸部ct等。对照组来自于健康非hiv病人。所有研究对象均签署知情同意书，并提供2ml血液，用常规的枸橼酸钠溶液抗凝。备注说明：每个样本均单独进行如下测定。(2)外周血rna的抽提：采用淋巴细胞分离管分离外周血淋巴细胞，加入1mltrizol裂解。加新开的氯仿0.2ml，轻摇15s。室温静置2-3分钟后，12000rpm，4℃离心15分钟。然后取上清无色水相(约0.6ml)到ep管(depc处理过)，加0.5ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。12000rpm，4℃离心10分钟。观察总rna在管底的白色沉淀，弃去上清，75％乙醇1.0ml洗涤(用depc水新配制)后，7500rpm，4℃离心5分钟。去上清，12000rpm，4℃离心7分钟，用小tip吸干液体。空气中干燥沉淀5-10分钟，depc处理水20-30μl加入，混合均匀，55-60℃水浴10分钟溶解总rna。ndnadrop2000紫外分光光度计检测所提rna浓度及纯度。浓度即为cng/ul。纯度为od260/od280比值，1.8-2.1之间说明纯度尚可。(3)外周血mirna表达量的检测方法采用all-in-onetm试剂盒(购自广州复能基因有限公司)qrt-pcr检测外周血中mirna的表达量反转录合成cdna：在无rnase的0.2mlpcr管中依次加入：混合后稍加离心，在pcr仪中进行反应：37℃60min85℃5min4℃保存实时荧光定量pcr：每个反应10μl，每个样品4个重复：加完后将384孔板贴膜，上机abiprism7900ht型荧光定量pcr仪运行。荧光定量流程如下：95℃15min；95℃15s；60℃60s；后两个步骤为40个循环。(4)分析几种mirna在新发结核患者和对照中的表达水平mirnas荧光定量pcr数据分析是以在外周血样本中存在稳定表达的u6(ctcgcttcggcagcaca)作为内参对照，mirnas相对表达量参考先前文献(corinnaeichelser,2013)报道用2-△△ct方法进行计算△△ct＝(ctmirna-ctu6)实验组-(ctmirna-ctu6)对照组平均值。荧光定量pcr数据分析是采用graphpadprism5软件计算。nonparametricmann-whitneytest方法统计mirnas在不同组之间的差异表达水平(统计学上认为p<0.05时，具有显著性差异；p<0.01时，具有极显著性差异)，差异表达的mirna数据处理结果以平均值±标准误表示，并绘制含误差线的散点图。(5)分析三种mirna(has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p)的组合物对结核病的诊断价值。2.结果(1)研究对象的一般特征表2病例-对照人群特征分布利用roc曲线分析用来判断单个外周血mirna诊断新发结核病的灵敏度和特异性。采用多变量的logistic逐步回归模型用来计算并形成外周血mirna组合物诊断的效率。利用spss17.0软件分析roc曲线和logistic回归模型。2)has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p在新发结核患者和对照组中的表达水平：在51例新发结核患者和40例对照组中，通过rt-pcr实验，结果如图1，51例新发结 核病患者和40例健康对照者中用荧光定量pcr方法验证这3个外周血mirnas。结果显示这3个外周血mirnas的表达水平在两组之间也均存在差异。has-mir-374b-5p(p＝0.0422)的表达水平在新发结核病患者中高于健康对照者,has-mir-625-3p(p<0.0001)和has-mir-362-5p(p＝0.0093)在新发结核病患者中低于健康对照者；图1表示是应用荧光定量pcr方法验证3个mirnas在51例新发结核病患者和40例健康对照者中的差异表达；所以，认为外周血中has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p可能作为早期诊断结核的生物标识。(3)has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p的组合物对新发结核病的诊断价值roc曲线分析用来首先评估3个外周血mirnas单个诊断新发结核病的灵敏度和特异性。曲线下面积(auc)has-mir-625-3p，0.7634(p<0.0001；95％ci,0.6638-0.8629)，has-mir-374b-5p，0.5204(p＝0.7697，95％ci,0.3840-0.6569)和has-mir-362-5p，0.5651(p＝0.2949；95％ci,0.4419-0.6883)。应用最佳临界值，我们计算得到灵敏度和特异性分别是:has-mir-625-3p，77.8％和61.54％；has-mir-374b-5p，50％和57.5％；has-mir-362-5p，51.16％和72.41％。表2:本发明标识蛋白检测结果与现有方法检测结果的比较特征新发结核患者组健康对照组总人数5140年龄(年)40±16.227±4.9性别(男/女)29/2223/17痰涂片(+/-)37/14/荧光抗酸染色(+/-)36/15/蛋白芯片lam(+/-)47/4/16kda蛋白(+/-)34/17/38kda蛋白(+/-)28/23/胸部ct+/全血ifn-γ检测(+/-)+9/31mirna检测(+/-)36/5112/40进一步釆用多元逻辑回归方法(multivariatelogisticregressionanalysis，罗壮.应用logistic 回归和roc曲线综合评价survivin、γ-ifn及crp联合检测对鉴别良恶性胸水的诊断价值[d].昆明医学院2009)计算has-mir-374b-5p、has-mir-625-3p和has-mir-362-5p组合物诊断活动性新发结核病的roc曲线,构建诊断结核特异外周血mirnas组合物。构建了新发结核病3个特异性外周血mirnas组合物的逻辑回归模型的回归方程:logit(p)＝0.125-0.662*(has-mir-625-3p)-0.367*(has-mir-362-5p)+0.114*(has-mir-374b-5p)，3个外周血mirnas组合物诊断新发结核病的roc曲线，灵敏度为70.8％，特异性为70.0％，曲线下面积(auc)是0.782(p<0.0001,95％ci，0.688-0.876)，比单个外周血mirna诊断的敏感性和特异性高，3个外周血mirnas组合物auc在0.78以上时，诊断活动性新发结核病同时具有较高的敏感性和特异性(见图2)。将mirna检测结核与现有方法进行比较(表2)，进一步说明这三个mirna及其组合对新发结核病具有一定的诊断价值，可以用来制备新发结核病的诊断试剂盒中的应用。参考文献：[1]罗壮.应用logistic回归和roc曲线综合评价survivin、γ-ifn及crp联合检测对鉴别良恶性胸水的诊断价值[d].昆明医学院2009当前第1页12