一种人体外周血中单核样髓源抑制细胞的检测方法与流程

本发明涉及一种人体外周血中单核样髓源抑制细胞的检测方法。

背景技术：

髓系来源的抑制性细胞（mdscs）是一群骨髓来源的异质性的细胞，根据其形态和表面标志的差异可以划分为两个亚群：粒细胞样髓源抑制细胞（pmn-mdscs）和单核样髓源抑制细胞（mo-mdscs）。其中，mo-mdscs具有较强的免疫抑制能力¹，机体内存在的mo-mdscs会影响乳腺癌等疾病的进展和恶化。基于此，对于mo-mdscs的筛选和检测是十分必要的。

由于mdscs细胞群缺乏特异性的识别标记物，因此现有的筛选和检测的方法十分混杂。almandb等人通过多种癌症样本的分析认为lin⁻hla-dr⁻可以作为标志物来筛选检测mdscs细胞群²，diaz-monterocm等人的工作则认为可以通过lin^−/lowhla-dr⁻cd33⁺cd11b⁺标志组合进行筛选检测³，还有通过cd15⁺从粒细胞群中检测mdscs细胞群的研究工作等等⁴。但是，现有的mdscs及mo-mdscs的检测方法多依赖操作者具有丰富的经验和理论背景基础，未给出mo-mdscs明确的科学的检测方法。（参考文献：

技术实现要素：

为了解决已有技术存在的问题，本发明提供了一种人体外周血中单核样髓源抑制细胞的检测方法。

本发明提供的一种人体外周血中单核样髓源抑制细胞的检测方法的步骤和条件如下：

a、所用的抗体

(101)抗体apcanti-humancd33，简称cd33；

(102)抗体peanti-humancd15，简称cd15；

(103)抗体pe-cf594anti-humanhla-dr，简称hla-dr；

(104)抗体apc-h7anti-humancd14，简称cd14；

(105)抗体pe-cy7anti-humancd45，简称cd45；

(106)抗体fitcanti-mousecd11b，简称cd11b；

b、所用的溶液的制备

(201)pbs溶液的制备：称取nacl8g、kcl0.2g、na2hpo41.44g及kh2po40.24g溶于1l超纯水中，高压灭菌，得到pbs溶液，4℃冰箱保存；

(202)缓冲液的制备：取新生牛血清1ml，加入到9ml的pbs溶液中得到10ml的缓冲液；所述的新生牛是出生6小时内的小牛；

(203)红细胞裂解液的制备：称取nh4cl7.47g、tris2.06g溶于500ml超纯水中，将溶液调节ph至7.2，继续加入超纯水直至总体积为1l，得到红细胞裂解液，4℃冰箱保存；

(204)固定液的制备：量取10ml甲醛溶液加入至1l步骤(201)制备的pbs溶液中，再加入葡萄糖20g，nano30.2g，完全溶解，得到固定液，室温备用；

(205)抗体混合溶液的制备：在步骤(202)制备的200μl缓冲液中加入4μl的hla-dr抗体，6μl的cd15抗体，6μl的cd45抗体，6μl的cd33抗体，8μl的cd14抗体和1μl的cd11b抗体，混匀，得到抗体混合溶液，4℃冰箱避光保存；

c、流式样本溶液的制备

(301)取受试者外周血血液样本10μl加入到1ml红细胞裂解液中，于冰上裂解30min，每10min震荡一次，得到外周血悬液；

(302)将步骤(301)得到的外周血悬液用离心机，4℃低温下1800rpm离心3min，弃去上清液，再加入200μl缓冲液至剩余的沉淀中，使用微量移液器吹打沉淀使之悬起并混匀；

(303)用离心机，4℃低温下1800rpm离心3min步骤(302)的得到物，弃去上清液，再加入20μl抗体混合溶液至剩余的沉淀中，使用微量移液器吹打沉淀使之悬起并混匀，随后将之置于冰上30min，注意避光；

(304)在步骤(303)得到物中加入200μl缓冲液，混匀，随后用离心机，4℃低温下1800rpm离心3min，弃去上清液；

(305)在步骤(304)得到物中加入200μl的pbs溶液，使用微量移液器将之混匀，得到流式样本溶液；

d、mo-mdscs的检测

用步骤3的(305)得到的流式样本溶液，检测流式样本溶液中mo-mdscs的比例，检测步骤如下：

(401)根据细胞的颗粒度和大小的普遍认知标准，使用流式细胞仪圈除流式样本溶液中的粘连细胞和死细胞，得到血液中的活单个细胞群即细胞群i；

(402)使用流式细胞仪，根据抗体cd45分子表达的情况，圈取细胞群i中pe-cy7荧光强度大于2×10²的细胞得到细胞群ii，此为血液中的白细胞群体；

(403)使用流式细胞仪，根据抗体hla-dr的表达情况，从细胞群ii中圈取抗体pe-cf594荧光强度大于2×10²的细胞得到细胞群iii；

(404)使用流式细胞仪，根据抗体cd33以及抗体cd11b的表达情况，从细胞群iii中圈取apc及fitc荧光强度均大于2×10²的细胞群，得到细胞群iv，此为mdscs细胞群；

(405)检测流式样本溶液中mo-mdscs的比例，根据抗体cd14以及抗体cd15的表达情况，从细胞群iv中圈取pe荧光强度小于2×10²且抗体apc-h7荧光强度大于3×10²的细胞群，为mo-mdscs细胞群；

(406)将筛选出的mo-mdscs细胞群数量除以步骤(402)中得到的细胞群ii的数量，得出外周血白细胞中mo-mdscs的比例数值。

本发明提供的一种人体外周血中单核样髓源抑制细胞的检测方法检测出的mo-mdscs比例数值在不同群体中表现出明显的差异，在乳腺癌患者中的比例显著的高于健康人和乳腺良性瘤患者。

有益效果：本发明提供的一种人体外周血中单核样髓源抑制细胞的检测方法，所用的抗体(a)抗体apcanti-humancd33，简称cd33；(b)抗体peanti-humancd15，简称cd15；(c)抗体pe-cf594anti-humanhla-dr，简称hla-dr；(d)抗体apc-h7anti-humancd14，简称cd14；(e)抗体pe-cy7anti-humancd45，简称cd45；(f)抗体fitcanti-mousecd11b；制备流式样本溶液；使用流式细胞仪检测流式样本溶液中mo-mdscs的比例。对于检测mo-mdscs给出了明确的筛选数值的范围和筛选的具体流程。检测简单、操作方便、检查时间短，仅需要微量的外周血样本标记，费用低廉，易于广泛普及。检测的结果进行了统计处理：对151例受试者的外周血血液样本，用本发明提供的一种人体外周血中单核样髓源抑制细胞的检测方法检测，将所述的检测步骤(406)检测的信息，通过计算机，使用graphpadprism6软件进行统计分析，p<0.05，具备统计意义。说明本发明的方法科学可信。

说明书附图

图1是本发明的方法使用流式细胞仪圈除流式样本溶液中的粘连细胞和死细胞得到细胞群i示意图。

图2是本发明的方法使用流式细胞仪得到细胞群ii的示意图。

图3是本发明的方法使用流式细胞仪的细胞得到细胞群iii的示意图。

图4是本发明的方法使用流式细胞仪得到细胞群iv的示意图。

图5是本发明的方法使用流式细胞仪得到的mo-mdscs细胞群的示意图。

图6是本发明的方法检测出的mo-mdscs在不同群体中表现出明显的差异的比例图。

具体实施方式

实施例1一种人体外周血中单核样髓源抑制细胞的检测方法的步骤和条件如下：

1、所用的抗体

(101)抗体apcanti-humancd33，简称cd33；美国bdbiosciences公司；

(102)抗体peanti-humancd15，简称cd15；美国bdbiosciences公司；

(103)抗体pe-cf594anti-humanhla-dr，简称hla-dr；美国bdbiosciences公司；

(104)抗体apc-h7anti-humancd14，简称cd14；美国bdbiosciences公司；

(105)抗体pe-cy7anti-humancd45，简称cd45；美国bdbiosciences公司；

(106)抗体fitcanti-mousecd11b，简称cd11b；天津三箭生物技术有限公司。

2、所用的溶液的制备

(201)pbs溶液的制备：称取nacl8g、kcl0.2g、na2hpo41.44g及kh2po40.24g溶于1l超纯水中，高压灭菌，得到pbs溶液，4℃冰箱保存；

(202)缓冲液的制备：取新生牛血清1ml，加入到9ml的pbs溶液中得到10ml的缓冲液；所述的新生牛是出生6小时内的小牛；

(203)红细胞裂解液的制备：称取nh4cl7.47g、tris2.06g溶于500ml超纯水中，将溶液调节ph至7.2，继续加入超纯水直至总体积为1l，得到红细胞裂解液，4℃冰箱保存；

(204)固定液的制备：量取10ml甲醛溶液加入至1l步骤(201)制备的pbs溶液中，再加入葡萄糖20g，nano30.2g，完全溶解，得到固定液，室温备用；

(205)抗体混合溶液的制备：在步骤(202)制备的200μl缓冲液中加入4μl的hla-dr抗体，6μl的cd15抗体，6μl的cd45抗体，6μl的cd33抗体，8μl的cd14抗体和1μl的cd11b抗体，混匀，得到抗体混合溶液，4℃冰箱避光保存；

3、流式样本溶液的制备

(301)取受试者外周血血液样本10μl加入到1ml红细胞裂解液中，于冰上裂解30min，每10min震荡一次，得到外周血悬液；

(302)将步骤(301)得到的外周血悬液用离心机，4℃低温下1800rpm离心3min，弃去上清液，再加入200μl缓冲液至剩余的沉淀中，使用微量移液器吹打沉淀使之悬起并混匀；

(303)用离心机，4℃低温下1800rpm离心3min步骤(302)的得到物，弃去上清液，再加入20μl抗体混合溶液至剩余的沉淀中，使用微量移液器吹打沉淀使之悬起并混匀，随后将之置于冰上30min，注意避光；

(304)在步骤(303)得到物中加入200μl缓冲液，混匀，随后用离心机，4℃低温下1800rpm离心3min，弃去上清液；

(305)在步骤(304)得到物中加入200μl的pbs溶液，使用微量移液器将之混匀，得到流式样本溶液；

4、mo-mdscs的检测

用步骤3的(305)得到的流式样本溶液，检测流式样本溶液中mo-mdscs的比例，检测步骤如下：

(401)根据细胞的颗粒度和大小的普遍认知标准，使用流式细胞仪圈除流式样本溶液中的粘连细胞和死细胞，得到血液中的活单个细胞群即细胞群i（见图1）；

(402)使用流式细胞仪，根据抗体cd45分子表达的情况，圈取细胞群i中pe-cy7荧光强度大于2×10²的细胞得到细胞群ii，此为血液中的白细胞群体（见图2）；

(403)使用流式细胞仪，根据抗体hla-dr的表达情况，从细胞群ii中圈取抗体pe-cf594荧光强度大于2×10²的细胞得到细胞群iii（见图3）；

(404)使用流式细胞仪，根据抗体cd33以及抗体cd11b的表达情况，从细胞群iii中圈取apc及fitc荧光强度均大于2×10²的细胞群，得到细胞群iv，此为mdscs细胞群（见图4）；

(405)检测流式样本溶液中mo-mdscs的比例，根据抗体cd14以及抗体cd15的表达情况，从细胞群iv中圈取pe荧光强度小于2×10²且抗体apc-h7荧光强度大于3×10²的细胞群，为mo-mdscs细胞群（见图5）；

(406)将筛选出的mo-mdscs细胞群数量除以步骤(402)中得到的细胞群ii的数量，得出外周血白细胞中mo-mdscs的比例数值。

由此方法检测出的mo-mdscs比例数值在不同群体中表现出明显的差异，在乳腺癌患者中的比例显著的高于健康人和乳腺良性瘤患者(见图6)。

本实施例，对151例受试者的外周血血液样本，分别用本发明提供的一种人体外周血中单核样髓源抑制细胞的检测方法检测。检测的结果进行了统计处理：将所述的检测步骤(406)检测的信息，通过计算机，使用graphpadprism6软件进行统计分析，p<0.05，具备统计意义。说明本发明的方法科学可信。