一种异体外周血单个核细胞体外分离试剂盒及使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种异体外周血单个核细胞高纯度、高回收 率体外分离试剂盒及使用方法，采用本试剂盒分离的异体单个核细胞可用于免疫治疗不明 原因习惯性流产。本发明所述的试剂盒包括试剂I:外周血稀释液，试剂II:红细胞沉淀 液，试剂III:单个核细胞分层液，试剂IV:单个核细胞洗涤液。采用本发明的试剂盒进行异 体外周血单个核细胞体外分离可达到如下效果：①单个核细胞回收率可达到90%以上，存 活率达到98%以上，大大提高了外周血单个核细胞使用效率；②分离获得的外周血单个核 细胞纯度可达到95%以上，红细胞和血小板残留率小，极大地避免了由于上述组分导致的 过敏风险；③通过分离前抗凝血预离心步骤，去除血浆，与常规分离技术相比，降低了分离 试剂的使用剂量，有效降低分离成本。
【背景技术】
[0002] 所谓习惯性流产是指连续两次怀孕在同一妊娠周发生自然流产的现象，40%-70% 左右的习惯性流产原因不明，这其中大多数疑为免疫因素所引起。免疫因素造成习惯性流 产的原因是：胎儿是一个既带有母系遗传基因又带有父系遗传基因的新的个体，在母体子 宫内生长发育直至分娩，胎儿与母体存在着免疫对抗和平衡。一旦母、胎双方发生免疫不协 调，往往可引起母体对胎儿的排斥而导致流产。
[0003] 一般来说，习惯性流产的女性在准备再次怀孕前，需首先排除非免疫性因素，因为 内分泌功能的异常是可用药物调整的，而某些染色体异常引起流产则是目前医学无法解决 的，而子宫形态异常、宫腔粘连等问题更要靠手术才能解决。如果上述检查均正常，就应考 虑进行免疫相关因素检查了。随着生殖免疫学研宄的不断深入，人们对妊娠免疫，免疫性 习惯性流产的许多疑难问题有了新的认识，研宄发现封闭抗体缺乏是习惯性流产的主要病 因。正常孕妇的体内都存在一种保护胎儿的抗体一封闭抗体，而80%以上的习惯性流产妇 女体内测不到这种抗体，由于缺乏这种抗体，怀孕后母体对胚胎不能保护而遭排斥，导致流 产。
[0004] 异体外周血单个核细胞免疫治疗是从丈夫身上或第三者抽取静脉血，然后分理提 取单个核细胞经皮下注射到妻子体内，使妻子产生封闭抗体，为母体腹中的胎儿构筑一道 安全屏障，从而最大限度地接纳和保护胎儿并不被流掉。一般用异体外周血单个核细胞免 疫治疗4-6次就可以产生抗体直至受孕生子，第1次注射后皮肤反应重，即24-48小时局 部出现红润硬结直径为3-10_，伴有皮肤发痒，而几次注射皮肤反应逐渐减轻者妊娠预后 良好。然而现有技术中主要存在的问题是分离获得的单个核细胞纯度较低，红细胞和血小 板残留较大，导致输入后的过敏反应风险增大。
[0005] 现有方法如申请号为ZL200710062487. 6的专利公开了一种治疗习惯性流产的生 物学制剂，其中的技术方案为：抽取健康成年男性外周血；玻璃球脱纤维Hanks液1. 5倍稀 释，分离单个核细胞，收集单个核细胞；Hanks液清洗，用RPMI-1640完全培养液重悬、计数， 并调整细胞浓度至2X 106/ml，加入植物血凝素，37°C培养72h ;收集培养液的上清，以离心 超滤及鹿糖密度梯度离心法制备T细胞exosomes ;用无菌滤膜过滤分装，-80°C保存即得成 品。然而，上述方法中需要37°C培养72h，这必然增加0)2细胞培养箱等昂贵仪器，不利于 推广；再就是上述方法操作繁琐，临床不利推广；而且上述方案也不能有效解决提高分离 纯度，减少红细胞或血小板残留的问题。此外，由于细胞冻存复苏对活性的影响，以及目前 国内细胞冻存方法多采用DMS0、动物血清和细胞培养液按不同比例搭配成的冻存液，不可 避免的存在由于外源动物血清的引入，导致的动物病原污染的可能性，这就给异体外周血 单个核细胞在免疫治疗中的应用带到影响，如果为了避免上述问题，采用当次采集，立即施 用的方法，虽然可以避免上述问题，但由于治疗时机的确定、采集时间、采集成本等问题，在 实际操作中迫切需要提供适于体内细胞制剂的冻存液的配比方法。
[0006] 针对上述问题，本发明提出了一种高纯度、高回收率异体外周血单个核细胞体外 分离试剂盒，用来分离单个核细胞以治疗习惯性流产。本方法操作简单；可工业化生产本试 剂盒；通过血浆去除，与常规分离技术相比，本发明降低一半分离成本；通过本发明的分离 步骤，单个核细胞回收率可达到90%以上，纯度可达到95%以上，存活率达到98%以上，大大 提高了外周血单个核细胞使用效率，提高了受孕率；本发明试剂盒还配制有单个核细胞冻 存试剂，该试剂的组分适于单个核细胞免疫治疗并且能有效提高细胞复苏后活性实现一次 采集异体外周血多次治疗的目的，解决了传统方法每次治疗前都需采集外周血的缺点。
【发明内容】
[0007] 本发明具体涉及一种异体外周血单个核细胞高纯度、高回收率体外分离试剂盒及 使用方法，采用本试剂盒分离的异体单个核细胞可用于免疫治疗不明原因习惯性流产。
[0008] 此外，本发明通过血浆去除，与常规分离技术相比，大大降低了分离成本；通过本 发明的二次分离纯化，单个核细胞回收率可达到90%以上，纯度可达到95%以上，存活率达 到98%以上，大大提高了外周血单个核细胞使用效率；本发明试剂盒还配制有单个核细胞 冻存试剂，该试剂的组分适于单个核细胞免疫治疗并且能有效提高细胞复苏后活性实现一 次采集异体外周血多次治疗的目的，解决了传统方法每次治疗前都需采集外周血的缺点。 本发明所述的异体外周血单个核细胞体外分离试剂盒，包括如下试剂，试剂I :外周血稀释 液、试剂II :红细胞沉淀液、试剂III :单个核细胞分层液、试剂IV :单个核细胞洗涤液和试剂 V :单个核细胞冻存液，以及使用该试剂盒的指导说明书。
[0009] 其中，所述试剂I :外周血稀释液的组分为PBS pH 7.2,不含Ca2+和Mg2+，其中加 入1-3%人血白蛋白。
[0010] 其中，所述试剂II :红细胞沉淀液的组分为体积百分比浓度为〇. 40-0. 65%甲基纤 维素溶液。
[0011] 优选，所述甲基纤维素溶液的浓度为6%，此时红细胞沉降率最高。
[0012] 其中，所述试剂III :单个核细胞分层液的组分为密度1.075-1.077±0. 001 Ficoll400与泛影葡胺混合液。
[0013] 其中，所述试剂IV :单个核细胞洗涤液的组分为PBS pH 7.2、不含Ca2+和Mg2+。
[0014] 其中，所述试剂V :单个核细胞冻存液的组分为PBS (pH 7.2、不含Ca2+和Mg 2+)， 人供体血浆、二甲基亚砜、人血白蛋白和海藻糖的组合。
[0015] 优选，所述试剂V配制为A液和B液形式，其中A液组分为：40%PBS+60%人供体血 浆，B液组分为：80% PBS+15%DMS0+5%人血白蛋白+0. 25 mol/L海藻糖。
[0016] 利用本申请所述的异体外周血单个核细胞体外分离试剂盒可进行外周血单个核 细胞分离操作，其包括如下步骤：抗凝血预离心、红细胞初反应、红细胞沉淀、单个核细胞分 层液两步分离、单个核细胞二次纯化、检菌、单个核细胞冻存。
[0017] 其中，抗凝血预离心步骤为取新鲜抗凝血，加入离心管混匀后以4°C 2000-3000rpm 离心15-20分钟，弃去上清液；本发明通过抗凝血预离心步骤，与常规分离技术相比，可降 低一半分离成本。因为血浆是血液的液体成份，约占全血液的50-60%，通过预离心去除血 浆，可使分离步骤中试剂II和试剂I的用量减少50-60%。
[0018] 其中，红细胞初反应步骤为：将步骤（1)中获得的血细胞沉淀与试剂II按1 :1体 积比例混匀，30-37°C轻微摇晃，反应5-10min。
[0019] 其中，红细胞沉淀步骤为：在步骤（2)所得混合液中加入1/2体积的试剂I并混 匀，室温自然沉降20-30分钟。
[0020] 分离步骤①：收集步骤（3)中获得的上清液，4