专利名称：激活的外周血单核细胞在治疗癌症方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及外周血单核细胞的应用，将外周血单核细胞通过“级联引发(cascade priming)”进行刺激或激活，其目的是提供一种用于治疗癌症的药剂。
为了防止癌症，对初始(未受激的)T淋巴细胞进行刺激可构成免疫治疗范围内的一个重要的起点。初始T细胞的最佳激活需要一种αβT-细胞受体(TCR)的特异性抗原的刺激，其通过主要组织相容性复合体(MHC)肽/抗原复合体(MHC＝主要组织相容性复合体)与共刺激信号(stimulatory signals)的共同作用。不存在共刺激则可导致T细胞的功能性失活(deactivation)。该共刺激信号最好由抗原呈递细胞(APC)来提供。
抗原呈递细胞可由大量共刺激分子来提供，而该共刺激分子主要有助于通过T细胞受体(TCR)增强T细胞的特异性激活。激活引发的补偿分子(complementary molecules)已能够在T淋巴细胞和抗原呈递细胞上以膜蛋白的形式得到鉴定。在T淋巴细胞上，将该膜蛋白细分成T细胞共受体，例如CD4分子或CD8分子，以及细胞间粘附分子-1，2，3(ICAM-1，2，3)。后者用抗原呈递细胞和T细胞来表达且与白细胞功能性抗原-1(LFA-1受体家族CD11a/CD18)一起参与交互作用，而该白细胞功能性抗原-1也用抗原呈递细胞和T细胞来表达。CD2分子可用大部分的T细胞来表达、可与CD58(LFA-3)反应。T细胞和抗原呈递细胞表达粘附分子LFA-1和ICAM-1，这对于抗原呈递细胞和T细胞之间的密切接触(intensive contact)非常重要。近来，其它具有共刺激功能的分子已经得到了鉴定，例如CD27/CD27L(CD28共刺激后扩充T细胞)、SLAM(Cdw150，CD2家族的成员，可提高干扰素-γ(IFN-γ)的产量和记忆T细胞的增殖)、以及OX40(CD134可促进2-型辅助T细胞(TH2)的应答并且辅助TH1和TH2的增殖)。其它的共刺激分子的精确功能有待于进行讨论，但是对于单体免疫应答的理解的解释而言的重要性是毫无疑问的(J.E.M.van Leuwen，L.Samelson，T cell antigen-receptor signal transduction(T细胞抗原受体信号转导)，Curr.Opin.Immunol.11242-248(1999))。
癌细胞仅在一个小范围内可提供共刺激信号。此外，癌细胞存在一种趋势，即强烈限制MHC分子的表达，这样来阻止MHC对肿瘤肽的识别。
已经开发出了几种策略用于对抗癌细胞的低度激活并且用于引发初始(未受激的)T淋巴细胞以对抗相应的肿瘤抗原。借助于基因工程在改进共刺激信号方面已经取得了许多成果，例如用可激活T-细胞的基因来转染肿瘤细胞。此外，许多研究都针对肿瘤肽的分离和鉴定。这类肿瘤肽可用于APC的载入(the loading of APC)，其目的是使MHC肿瘤肽复合体有效地递呈给T细胞。用这种方法，来获得T细胞的激活和T细胞记忆的诱导。在临床研究中心，已经将载有抗原的APC重新注入患者体内，其目的是吸引初始T细胞并且引发其对抗肿瘤抗原。到现在为止，已经用肿瘤肽/抗原或通过癌细胞的孵育进行APC的加强载入(intensive loading)。
这些治疗策略的很普通的成果应归于四个主要问题，可以单独地或共同地出现1)在鉴定可在每个单体中诱导强免疫应答的肿瘤抗原方面的困难；2)在肿瘤细胞中选择性呈递抗原的丢失，其由呈递这些肿瘤抗原/肽的单体MHC分子的呈递的丢失造成；3)借助于细胞因子来灭活初始细胞的癌细胞的能力；以及4)共刺激信号不充分。
尤其，用于治疗癌症的另一种策略披露于WO 95/20649。其披露了在体外生成免疫细胞的方法，在该方法中，可溶性CD3抗体与外周血单核细胞(PBMC)进行孵育，并且将上清液用于初始PBMC的孵育。这样可获得免疫活性细胞，T细胞群主要包括辅助T细胞(CD4+)和细胞毒性T细胞(CD8+)，可被重新注入患者体内。
因此，就用于癌症治疗的药剂而言存在一种连续的需求。
根据本发明，使用通过级联引发(所谓的CAPRI细胞)已被激活的PBMC以提供一种用于癌症治疗的药剂。
根据本发明，在体外将患者的PBMC凝聚物(aggregate)中的初始T细胞激活，并且将其引发以对抗其自身肿瘤细胞；在该过程中，PBMC生效无需进行预先的肿瘤抗原载入(loading)。从而就这种体外引发而言，没有必要使用肿瘤细胞或鉴定特异性肿瘤抗原/肽。
在级联引发过程中，通过可刺激T淋巴细胞的药剂，对初始PBMC进行初级刺激(primary stimulation)，并且将这些进行初级刺激的PBMC加到初始PBMC中，结果是初始PBMC被依次激活，并且根据本发明，对提供用于治疗癌症的药剂来说，可使用从其中所得到的CAPRI细胞(“级联引发的”细胞)。
表达“刺激淋巴细胞的药剂”应理解为是指CD3抗体、B7抗体、外源凝集素、钙离子载体(calcium ionophores)、异源细胞、异体细胞等等。单独或联合地使用不同的药剂可用于初级刺激。初级刺激优选通过使用CD3抗体来实现，尤其是固定化CD3抗体。但是初始PBMC、或者更合适地在PBMC凝聚物中的T淋巴细胞的刺激之外，还可通过其它详细列于WO 99/50393中的方法获得，该专利归申请人所有，而在此处明显可作为参考。下面，本发明将基于由CD3抗体所引起的初级刺激的实施例进行更为详尽的描述，而并不用于对本发明进行限定。
在PBMC凝聚物中的T淋巴细胞的初级刺激可借助于CD3抗体与随后加入的白细胞介素-2(IL-2)(所谓的IL-2辅助阶段)来实现。总计4-8小时的初级刺激的孵育期过后，将初始PBMC加入激活PBMC中(或更适合于加到PBMC凝聚物中的激活T淋巴细胞中)。至少18-24小时的进一步孵化期过后(所谓引发阶段)，初始PBMC的刺激结束，以便根据本发明将通过加入IL-2制备的细胞扩充约3天和/或进行使用(所谓扩充阶段)。在该进一步的孵育过程中，细胞的连续的进一步刺激是以进行初级刺激为条件，然而新加入的初始PBMC主要通过在第一步骤中经过初级刺激的细胞来进行刺激。经初级刺激的PBMC与初始PBMC量的数值比，通常约1∶1。用于生产CAPRI细胞的方法和使用其用于治疗与大脑有关的疾病、病症、和缺损的方法已在WO 99/50393中提出，该专利归申请人所有。
根据另一个具体实施例，在白细胞介素2(IL2)辅助阶段中和/或在引发阶段中，可依次加入其它的细胞因子例如白细胞介素-4(IL-4)和/或颗粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)(“IL-4CAPRI细胞”)或干扰素(“IFN-γ CAPRI细胞”)，这样可以通过APC获得另外的肽表达，并且促进另外的APC或T细胞亚群的表达。在新的一系列初始细胞的引发中和后续的表达中使用该CAPRI细胞。
根据另一个具体实施例，共同培养的激活PBMC与初始PBMC的比值从1∶1到1∶10或10∶1进行变化，即百倍。
根据另一个具体实施例，异源的(外来的)免疫细胞还可在CAPRI细胞的生产中使用。在相关的个体中，其中一个或两个HLA单倍体(HLA＝人类的主要组织相容性复合体)重合(coincide)、可以保证初始T细胞与激活的APC之间充分的免疫细胞协同作用。就不同单倍体而言，额外的刺激可能会出现(同种异体刺激)。单倍体的同种异体刺激的差异在很久以前就进行了披露(M.J.Sheehy，P.M.Sondel，M.L.Bach，R.Wank，F.H.Bach，HL-A LD(淋巴细胞决定的)分型引发淋巴细胞的快速分析，Science(科学)1881308-1310(1975))。还对HLA限制性溶解来说，在患者的异源细胞和肿瘤细胞之间如果存在充分的HLA一致性，就可使用非相关的个体细胞。在治疗癌症的过程中可方便地使用下列组合1)患者的活化的APC+个体的初始PBMC可表达相同的与HLA相关的等位基因产生的记忆效应细胞(memory effector cells)不是来自患者，而是同种异体-CAPRI细胞。这构成最常见的变异体，因为在大部分情况下患者的APC最好呈现肿瘤肽。
2)使用来自“有抵抗力的”个体APC(例如，抗人体乳头状瘤病毒，HPV，R.Wank，C.Thomssen，High risk of squamous cellcarcinoma of the cervix for women with HLA-DQw3(使用HLA-DQw3用于妇女的高危的子宫颈鳞状细胞癌)，Nature(自然)352723-725(1991))，其目的是引发由人类乳头瘤病毒(HPV)引发患有宫颈癌患者的初始PBMC该APC是外来的(同种异体)，所产生的记忆效应细胞来自患者并且是同种异体-APC-CAPRI。
3)所产生的APC和记忆效应细胞是外来的(同种异体)并且是同种异体-同种异体-CAPRI细胞。该同种异体-同种异体-CAPRI细胞是最佳的，如果患者和异源供体与相同的致癌因素进行了接触，且异源供体显示出更好的免疫应答。
同种异体或半同种异体CAPRRI结合的动力学不同于那些“标准的”CAPRI方法。
在本发明的另一个优选具体实施例中，将CAPRI细胞与CD3-活化细胞、或与在TH1种群的方向上加入IFN-γ、或在TH2和CD8+T种群的方向上加入IL-4被极化的CD3-活化细胞进行联合给药。在某种程度上，其具有历史原因，因为在本发明的CAPRI细胞之前，其只有CD3-活化细胞在它适应症方面使用。因为仅仅使用CD3-活化细胞的治疗就低速率的肿瘤复发而言，效果很好(T.Takayama等，Adoptive immunotherapy to lower postsurgicalrecurrence rates of hepatocellular carcinoma(用于较低术后复发率的肝细胞癌的继承性免疫疗法)a randomised trial(一种随机试验)，lancet(刺血针)356802-807(2000))，可能由于增长的CD8+T细胞数目，将这些细胞给药以达到辅助CAPRI细胞的目的。此外，可在患有抑郁症的患者身上成功地使用CD3-活化细胞，像已在DE 19814701中所披露的一样，该专利归申请人所有。这些效果还可成功地用在防止化学治疗或辐射的消极后果。
对于防止肿瘤细胞而言，不存在任何意向对用于解释CAPRI细胞的可确定效果的特殊原理进行限定，下面将进行研究，将该活化机理进行更为详细的说明。
在借助于级联引发的刺激过程中，假定免疫反应的诱导通过PBMC凝聚物中的初始T细胞的普通激活开始(借助于CD3抗体)，这些活化的T细胞分泌大量可激活APC(单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞、B-淋巴细胞)的细胞因子。相应地，活化的APC可分泌大量细胞因子并在一个扩大的范围内表达共刺激配体(ligands)。然而，更为明显的是，通过APC的内源或外源的肽的更有效的呈递。就这种肽而言，其可能有一个由癌细胞所产生的肿瘤肽的问题，并且目前其在一个扩大的范围内，通过APC进行呈递。假定后来加入的初始T细胞的刺激是主要通过已经进行过初级刺激的PBMC的活化的APC实现，即以极为特有的方式，在初始PBMC种群中通过T淋巴细胞(CD4+辅助细胞和CB8+杀伤细胞)的αβTCR来实现。
在级联引发的过程中的不同阶段将在下面进行更为详细的说明。
1)通过细胞因子分泌的CD3-诱导的T细胞激活借助于与αβTCR有关的固定(invariant)CD3多肽，T淋巴细胞与固定化CD3抗体的结合以及加入IL-2可导致T淋巴细胞的激活。该激活还可诱导T细胞的细胞因子的分泌。在该阶段中T细胞种群的类型可能受到影响并且可通过加入细胞因子而扩充；例如，通过加入IL-4，在TH2细胞的方向上可控制后续的扩增(amplification)。在该阶段中，还可观察到CD8+T细胞的显著增殖。
2)APC的激活T细胞的细胞因子可活化APC、单核细胞分化成巨噬细胞、和树突状细胞成熟。由不同的活化T细胞产生的细胞因子影响APC的主要类型并且还影响可在APC中被激活的酶亚单位的类型。相应地，活化APC分泌可在引发阶段辅助初始细胞激活的细胞因子。
3)引发阶段用APC表达MHC肽复合体和共刺激分子活化的APC分泌细胞因子、表达共刺激分子、和MHC肽复合体，或者从头(de novo)和/或在更高浓度下。目前可将初始PBMC以相同的份数加入活化的PBMC中。活化的APC表达，例如，共刺激B7分子CD80/CD86、粘附分子、和其它共刺激分子以及MHC肽复合体，通过效应T细胞和记忆T细胞中的αβTCR可导致T细胞的完全激活。依靠所产生的细胞因子和/或依靠与1)或2)中的活化T细胞接触，将来自新近加入初始PBMC的一些单核细胞分化，用以形成树突状细胞。可以了解的是，通过MHC肽复合体的呈递，树突状细胞不仅可诱导T细胞的记忆而且可在体内的情况下更新T细胞的记忆。
根据本发明，与提供的用于治疗癌症的药剂有关的级联反应，与所有先前已知的激活方法相比，其优点在于其特异性和在淋巴细胞中的记忆的诱导速度。级联引发要求仅24小时，直至获得PBMC凝聚物中的T细胞的全部细胞毒素的容量，而不必已知肿瘤肽/抗原。
在解释与PBMC凝聚物中的仅CD3-活化T细胞相比CAPRI细胞的明显提高的疗效中，假定根据激活的方法，可出现不同重量的各种免疫细胞亚群。例如，借助于FACS分析(荧光活化细胞分检器)，可确定出现的CD4+T细胞(辅助细胞)和CD8+T细胞(细胞毒性细胞)以及CD45RO+T细胞(记忆T细胞)的数量的不同。PBMC的CD3-激活可产生约25％的CD4+T细胞和58％的CD8+T细胞；在记忆引发的情况下，所观察到的正相反，可产生54％的CD4+T细胞和29％的CD8+T细胞。在这种情况下，最显著的特征是在级联引发的过程中CD45RO+T记忆细胞的增长。仅有3％的未激活的(初始)PBMC显示CD45RO+表型；29％的CD3-激活细胞；49％的CAPRI细胞。在级联引发的过程中，与防止肿瘤细胞有关的记忆细胞的增长具有很重要作用，这是因为记忆效应细胞不要求共刺激、或仅有非常低的共刺激，用于其细胞毒素的活性。记忆效应细胞的进一步特征是它们的MHC限制性溶解能力。
例如，CAPRI细胞具有溶解异源癌细胞系的能力，即另外的外来的患者(foreign patients)的癌细胞系，以高度特异的方式，或相反地以MHC限制性方式，只要该异源癌细胞系和细胞毒素CAPRI细胞表达一种共同的MHC抗原。
如同早已说明的那样，借助于级联引发，在对抗未鉴定肽的未知感染的过程中，可以获得记忆效应细胞。这种未曾报道过的、或者有时即使为已知的在致癌作用中的慢性感染的精确功能为深入研究的目标。许多病毒在致癌作用中通称为主要因素，例如，诸如子宫颈癌中的人类乳头瘤病毒(HPV)16/18这样的病毒。其它的病毒在类似怀疑的情况下，即使没有致免疫肽仍然能够被确定。一个实例为JC病毒，其在结肠直肠癌中是一种重要的致癌因素。尽管患者的结肠直肠癌的消退(regression)能够通过CAPRI细胞的给药获得，其仍然是不清楚的，是JC病毒肽还是肿瘤细胞的其它肽构成CAPRI细胞的溶胞(lytic)活性的实际的攻击目标(target)。
可以每次注射50万-3000万细胞的剂量使用CAPRI细胞。适宜的注射细胞的量，取决于患者的年龄、体重、和/或可能的继发症。可能提高，或在适当时，随治疗时间的增加降低注射细胞的量。通常，在成年患者中每次注射的细胞量约为每次注射100万-2000万细胞。
该注射可以不同的时间间隔给药，例如每周1次到几次、每两周、或更长的时间间隔。
CAPRI细胞的注射经皮内、静脉内、和/或肌内给药。如果肿瘤的尺寸不超过0.5cm的直径，该CAPRI细胞可给药进入肿瘤而不是肿瘤的周围。给药优选通过联合的皮内和静脉内注射实现。
根据优选具体实施例，除了CAPRI细胞之外，以100万-1500万的剂量范围的CD3-活化细胞对患者给药。与CAPRI细胞相比较可将该CD3-活化细胞给药进入体内的不同位置、或皮内CAPRI浸润部位的附近。给药优选通过皮内和/或肌内注射实现。
除不同种类的疗法外，根据本发明，还可以采用通过使用CAPRI细胞治疗癌症。例如，可使用与CD3-活化细胞有关的适当的CAPRI细胞，其目的是提供一种用于治疗癌症的药剂补充化学疗法范围内的常规的药剂。此外，在放射疗法中，可给予这些细胞。
实施例1.用于产生CAPRI细胞的方法1)起始的CD3激活阶段(2-4小时)将1000万-2000万PBMC(通过Ficoll-Hypaque梯度分离)悬浮在10-12ml体积的培养基(例如，RPMI1640)中，加10％的HyClone胎牛血清，并且沉积到固定化的抗CD3单克隆抗体上。可在任何时间以自体同源的血清替代HyClone血清。
2)IL2辅助阶段(2-3小时)在2-4小时的CD3激活之后，加入20单位的IL-2/ml，其目的是辅助激活并防止凋亡。
3)引发阶段(18-24小时)在2-3小时的IL2辅助之后，将APC充分活化用于引发初始PBMC将补充培养基中的1000万-2000万个初始PBMC加入激活的PBMC中。
4)扩充阶段(72小时，任选的)将经引发的PBMC(现在的CAPRI细胞)计数，并以约20万-40万细胞/ml的浓度重新悬浮在具有20个单位的IL-2/ml补充基(supplemented medium)中。
5)收获CAPRI细胞在72小时的扩充之后，将细胞以每安瓿200万-3000万的测定用量进行收获并贮藏、冷冻，或立刻在治疗的范围内使用。
在不同的级联引发步骤中的异源细胞的使用，以及其它的修饰，可在不改变基本过程的情况下实行。
产生CAPRI细胞和CD3激活细胞的详情披露于WO 99/50393，该专利归申请人所有。
2.CAPRI细胞的治疗给药步骤CAPRI细胞重新悬浮在小体积(1ml)的PBS(磷酸缓冲盐溶液)中，并且优选进行皮内注射和静脉注射。其还可在肿瘤周围进行肌内注射或浸润，另外如果肿瘤尺寸不超过0.5cm的直径的话，可进入肿瘤内。取决于适应症，该步骤采用约50万CAPRI细胞的测定用量(aliquots)开始，但每次注射给药不超过3000万细胞。此外，如果给予CD3激活细胞，以100万-2000万细胞的剂量进行注射。通过皮内和/或静脉注射进行给药。
3.CAPRI细胞活性的体外研究A)CAPRI细胞在24小时内可将固态的癌细胞系溶解。显然消灭癌细胞系后，可再次使用CAPRI细胞。该CAPRI细胞可用于其它的癌细胞系7次并且能够以相同的效率消灭后者的癌细胞系。在该结合中不必一定使用细胞因子用以辅助CAPRI细胞。进行测试的癌细胞系来自黑色素瘤(1个细胞系)、乳腺癌(9个细胞系)、结肠癌(3个细胞系)、多形性恶性胶质瘤(2个细胞系)、以及退行发育(bowenoid)乳头状瘤(1个细胞系)。尤其在退行发育肿瘤的情况下，与在存在退行发育的肿瘤细胞系下已经激活和引发的PBMC细胞相比，CAPRI细胞的(即由患者的激活PBMC引发的初始PBMC)的优越性是明显的。前者具有溶解能力；后者，与之相反，不具有溶解能力。这种退行发育的肿瘤细胞系的组成对该结合尤其有益处，这是因为该肿瘤细胞系仅由约3％的肿瘤细胞构成，其余的97％为成纤维细胞。用于发现成纤维细胞“后面(behind)”的癌细胞的CAPRI细胞的能力是最为重要的，尤其是，与转移病灶结合时，其经常地被成纤维细胞层包围着。与CAPRI细胞相反，只进行了CD3激活的细胞不具有消灭上述列举的固态癌细胞系的能力。必须指出的是就肿瘤活组织检查或癌细胞系的新鲜单细胞悬浮体而言，实验已多次显示后者易于被CD3激活细胞溶解。但对这些肿瘤细胞来说，其是一个之前已通过酶处理被损伤并且没有机会进行再生以建立一个固态肿瘤细胞系的单细胞悬浮体的问题。
B)在与来源于新鲜肿瘤活组织检查的9个乳癌细胞系有关的研究中，MHC-II类限制性溶解变得显著。例如，来自供体带有HLA II类等位基因DQB1*0201的CAPRI细胞，溶解自体同源的癌细胞系(还有DQB1*0201)等等，异源的乳癌细胞系对DQB1*0201同样是阳性的。就CAPRI细胞而言，所发生的同样的溶解为HLA-DQB1*0603限制生的。只有HLA-DQB1*0603阳性自体同源的癌细胞系和其它的HLA-DQB1*0603类型的癌细胞系被溶解。即使就乳癌细胞而言，HLA-II类限制性溶解是占优势的，在某些情况下仍然可观察到HLA-I类限制性溶解。抗呈递HLA II类分子完全阻止了癌细胞的溶解，然而抗HLA-I类分子的抗体只减少了癌细胞的溶解。级联引发后通过磁珠分离法脱除CD4+或CD8+免疫细胞，其结果是导致所残留的CAPRI细胞的溶解活性完全丧失。相反，去掉CD56+或CD57+自然杀伤细胞实际上对溶解活性没有影响。这样得出结论CAPRI细胞还可进行HLA-I类限制性溶解，然而，占优势的是HLA-II类限制性溶解。自然杀伤细胞对于CD4或CD8是显阳性的，而对CD56或CD57则显阴性，其可能在一个小范围内对CAPRI细胞的溶解活性有利。
4.体内研究A)以检测易进入的肿瘤为基础，能够确定出CAPRI细胞的体内药效(efficacy)。下面进行肿瘤的治疗和检测一种黑色素瘤、两位患乳癌患者的皮肤转移灶(cutaneous metastases)、一位患卵巢癌患者以及一位患有退行发育乳头状瘤患者的皮肤转移灶。如果肿瘤直径不大于0.5cm的话，使用的方法是向肿瘤内部和周围直接注射。就较大的肿瘤而言，例如，患有卵巢癌的患者测量的皮肤转移灶为5cm×8cm，可在肿瘤边缘进行注射，即在扩张的区域内。每周注射一次或每周注射两次，以这种方式进行治疗的所有肿瘤灶6-8周后表现出消退(regression)。这种结果是有益的，尤其是，就患有退行发育乳头状瘤的患者而言，这是因为这位患者在慕尼黑大学的皮肤病学医院一年内采用激光外科并且采用膏状物(cream)的局部施用已经进行了5次治疗。不过，在注射CAPRI细胞之前，肿瘤细胞保持再现(reappearing)在外阴和肛门区。目前患者已经两年无肿瘤了。
B)在CAPRI细胞的体内药效(efficacy)的研究范围内，进行治疗的乳癌患者表现出5次肝转移，该肝转移已经通过活组织检查和超声波及CT进行了检测。至少2000万每周注射2次，但不能超过3000万，将CAPRI细胞针对这位患者通过静脉内给药，该患者在CAPRI细胞治疗期间没有进行其它的治疗。8周后，通过超声波检查，可以对肿瘤消退的最初无误的症状进行确认。在4位患有转移性结肠癌的4位患者中，采用CAPRI细胞治疗可诱导肿瘤明显的消退。这4位患者中的2位不再接受任何化学治疗，这是由于化学治疗具有相当大的副作用和/或由于其没有疗效。
C)就A)和B)中所描述的患者而言，没有进一步的给药或没有改变以前的给药。除CAPRI细胞之外，还可使用CD3激活细胞。
D)上述CAPRI细胞的效果可在自体同源的体系中获得。然而，在不同的级联引发阶段，还可采用异源的(外来的)细胞。其只在化学治疗期间已经损失了大多数免疫细胞的一些患者中进行。异源细胞有时可强化CAPRI细胞的溶解活性。例如，可以在活化的第一阶段使用患者的细胞(见“用于产生CAPRI细胞的方法”，步骤1和2)，然后使用异源的初始PBMC来引发患者的自体同源的激活PBMC(同种异体-CAPRI)。在一个患有结肠直肠癌患者的家族中，其父亲没有发生任何癌症，但是结肠中却经常出现息肉(polyps)，这被认为是癌症早期的现象，可以用该父亲(同种异体-APC)的APC用于引发患者的初始免疫细胞。在这种情况下，父本的APC可引发患者的初始PBMC，并且可导致记忆效应细胞的生成，一种结果可以患者的癌细胞系为基础进行测试。在这种特殊的家族情况下，还可将同种异体-同种异体-CAPRI细胞进行诱导，即父亲的激活APC能够引发父亲的初始PBMC，而以这种方式获得的细胞具有溶解患者(儿子)癌细胞系的能力。必须指出的是这些父本CAPRI细胞可作为同种异体-同种异体-CAPRI细胞用于患者的癌细胞系上，而根本没有与患者的细胞接触，既不与APC接触，也不与患者的癌细胞接触，甚至不与从这种癌细胞中流出的肽接触。
权利要求
1.外周血单核细胞的应用，通过级联引发(CAPRI细胞)刺激所述外周血单核细胞，其可通过以下刺激方法获得外周血单核细胞(PBMC)通过药剂刺激T-淋巴细胞进行初级刺激将初始外周血单核细胞加到已经受过初级刺激的所述外周血单核细胞中并且进行孵化，以刺激所述初始外周血单核细胞，其目的是提供用于所述治疗癌症的药剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，应用由自体同源的或同种异体的构成的CAPRI细胞。
3.根据权利要求1或2之一所述的应用，其特征在于，所述外周血单核细胞通过CD3抗体和/或B7抗体和/或外源凝集素和/或钙离子载体和/或同种异体细胞和/或异体细胞进行初级刺激。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述外周血单核细胞通过CD3抗体进行初级刺激。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述外周血单核细胞通过固定化CD3抗体进行初级刺激。
6.根据权利要求1-5之一所述的应用，其特征在于，所述外周血单核细胞的初级刺激和/或所述初始外周血单核细胞的刺激是在存在白细胞介素-2和/或白细胞介素-4和/或干扰素γ的情况下进行的。
7.根据权利要求1-5之一所述的应用，其特征在于，经初级刺激的外周血单核细胞与初始外周血单核细胞的比率在1∶10-10∶1之间。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，经初级刺激的外周血单核细胞与初始外周血单核细胞的比率为1∶1。
9.根据权利要1-8之一所述的应用，其特征在于，所述CAPRI细胞通过皮内注射、静脉注射、和/或肌内注射、和/或在所述肿瘤内部或周围给药。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述CAPRI细胞通过皮内注射和静脉注射给药。
11.根据权利要求9或10之一所述的应用，其特征在于，所述CAPRI细胞以每次注射50万-3000万细胞的剂量给药。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述CAPRI细胞以每次注射100万-2000万细胞的剂量给药。
13.根据权利要求1-12之一所述的应用，其特征在于，所述CAPRI细胞连同CD3激活淋巴细胞一起给药。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述CD3激活淋巴细胞以每次注射100万-2000万细胞的剂量给药。
15.根据权利要求13或14之一所述的应用，其特征在于，所述CD3激活淋巴细胞通过皮内注射和/或肌内注射给药。
16.根据权利要求13-15之一所述的应用，其特征在于，除所述CAPRI细胞以外，将所述CD3激活淋巴细胞给药进入患者体内的不同位置。
17.根据权利要求1-16之一所述的应用，其特征在于，将其连同与所述疾病类型相对应的药物治疗或放射疗法治疗一起进行。
全文摘要
本发明涉及外周血单核细胞的应用，通过级联引发(CAPRI细胞)刺激外周血单核细胞，其目的是提供一种用于治疗癌症的药剂。还可以将CAPRI细胞与CD3激活细胞联合给药。
文档编号A61P35/00GK1503678SQ02808623
公开日2004年6月9日 申请日期2002年4月24日 优先权日2001年4月26日
发明者鲁道夫·旺克, 鲁道夫 旺克 申请人:鲁道夫·旺克, 鲁道夫 旺克