专利名称：检测高血压危险因素的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测或诊断受试者体内是否存在患高血压的危险或是否是患高血压的体质的方法，对受试者进行有针对性的抗高血压治疗的方法，以及选出用于研究要测试的抗高血压剂的受试者的方法。
背景技术：
这里引用出版物和其他资料来描述本发明的技术背景，另外，在参考文献中还提供了详细的实施资料。
α2肾上腺素受体(α2-ARs)介导许多由儿茶酚胺去甲肾上腺素和肾上腺素引起的生理反应。在人和其他哺乳动物体内，已知的α2肾上腺素受体共有3种基因亚型，分别为α2A-、α2B-及α2C-肾上腺素受体，在人体基因组中，编码这些受体的基因分别位于10号、2号及4号染色体上。由于这些受体的基因中没有内含子，目前还未发现它们存在剪接变体。这些受体亚型的组织分布以及生理和药理功能已有记载，比如Mcdonald等(1997)和Docherty(1998)所描述的。基于最新的基因靶向和转基因小鼠研究，α2肾上腺素受体介导的大多数归因于目前可得到的α2肾上腺素受体激动剂药理作用，包括对神经递质释放的抑制、中枢性低血压和心动过缓作用、镇静和麻醉、以及镇痛。同样的研究显示，α2B-肾上腺素受体在应答激动剂的活化时可介导外周血压升高反应(Link等，1996；Macmillan等，1996)，因此它在高血压的发作中起着重要的作用(Calzada和Artinano，2001)。现在还没有其他的生理或药理作用被确定地与这种受体亚型相关联。α2C肾上腺素受体亚型似乎涉及复杂行为的调节，但现在还不了解这种亚型在中枢神经系统以外的外周组织或心血管调节中是否具有重要功能。
与许多其他的常见紊乱疾病一样，高血压由基因和环境因素之间复杂的相互作用引起。可以推测，功能上重要的基因变异在机制上对于调节血管功能是重要的，必将与高血压的发病机理和治疗相关联。最近发现了人α2B-AR基因的一种变异形式(Heinonen等，1999)，该变异等位基因编码一种受体蛋白，其在受体多肽的第3个细胞内环的18个氨基酸的酸性区段(其中15个是谷氨酸)上缺失了3个谷氨酸残基。与α2A-AR和α2C-AR相比，该酸性区段在α2B-AR初级结构中的特征是独特的，表明该基序对于α2B-AR的功能起独特作用。对比不同哺乳动物的α2B-AR多肽的氨基酸序列显示，该酸性区段在哺乳动物α2B-AR中是高度保守的，并且人的该酸性区段比其他物种的长，说明这种基序对于受体的功能有重要影响，而且短的形式(D表示“缺失”)可能代表祖先(ancestral)的形式，长的形式(I表示“插入”)可能代表较近代的等位基因变体。Jewell-Motz和Liggett(1995)利用定点突变技术对该区段的16个氨基酸进行缺失和取代，研究了该区段的体外功能，研究结果表明该酸性结构对于全激动剂促进的受体磷酸化作用和脱敏作用是必需的。
基于α2B-AR在小鼠体内的血管收缩特性及该酸性区段在受体脱敏机制中的作用，我们假设缺失变体使受体的脱敏作用降低，因而加强了与高血压相关的全身动脉的血管收缩。为了验证这种假设的正确性，我们对912个中年芬兰男性进行了种群研究。
发明概述本发明的目的是提供一种基于α2B-肾上腺素受体基因的基因型预测受试个体是否存在患高血压的危险的方法，以及一种有针对性进行血压降低治疗的方法。本发明进一步的目的是提供一种选择人类受试者的方法，以研究药物的实验性的抗高血压效果。
本发明涉及一种方法，通过测定编码变异α2B-肾上腺素受体的等位基因的类型，判断一个受试者是否存在患高血压的危险，即测定受试者的人α2B-肾上腺素受体的基因型是否属于缺失/缺失(D/D)型，该方法包括下述步骤a)提供受试者的生物样品；b)提供一种检测方法用来检测生物样品中如下物质的存在1)人α2B-肾上腺素受体插入/插入(I/I)或缺失/插入(D/I)基因型，或2)人α2B-肾上腺素受体缺失/缺失(D/D)基因型，D/D基因型的存在表明受试者有患高血压的增加的危险。
在本发明中，确定受试者是否属于所述D/D基因型的方法只需一种生物样品如血液样品或口腔刮离样品(buccal sweep)即可。如果在上述样品中存在所述D/D基因型，则表明该受试者患高血压的危险性增加和/或提示受试者需要治疗，如进行α2B选择性或α2B非选择性的α2肾上腺素受体拮抗剂治疗。
因此，本发明所述的方法可以包括鉴定受试者是否有发展为高血压的增高的危险，和/或受试者是否需要治疗，比如用α2B选择性或α2B非选择性α2肾上腺素受体拮抗剂治疗高血压。
本发明还涉及一种方法，进一步包括如下步骤c)根据受试者是否属于D/D基因型，评估下述至少一项1)受试者发展为高血压的危险，或2)受试者是否需要α2B选择性或α2B非选择性α2肾上腺素受体拮抗剂进行高血压治疗。
本发明更进一步的目的是提供一种方法，该方法通过测定编码变异α2B-肾上腺素受体的等位基因类型，即通过测定受试者的人α2B-肾上腺素受体基因型是否属于缺失/缺失(D/D)型，对高血压受试者实施治疗或靶向高血压的治疗，本方法包括前述的步骤，以及对D/D基因型的受试者施用能影响去甲肾上腺素敏感性或交感神经活性的药物。
本发明还提供了一种试剂盒，用于检测受试者是否存在患高血压的危险，或用于选择合适受试者以进行针对性抗高血压治疗或检验抗高血压试剂的研究，包括测定生物样品中编码变异α2B-肾上腺素受体等位基因类型的用品(means)，还包括其使用方法。
本发明还提供了一种DNA序列，其包含编码变异α2B-肾上腺素受体蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列编码的受体多肽在受体多肽的第3个胞内环上氨基酸294-311位的18个氨基酸的酸性区段中的第298-309位的12个谷氨酸的重复单元上缺失至少一个谷氨酸。
本发明还提供了一种变异α2B-肾上腺素受体蛋白，该蛋白在受体多肽第3个胞内环上氨基酸序列第294-311位的18个氨基酸的酸性区段中的第298-309位的12个谷氨酸重复单元上缺失至少1个谷氨酸。
发明详述本发明关于一种编码变异人α2B-肾上腺素受体的DNA分子以及变异的人α2B-肾上腺素受体蛋白，本发明还涉及一种评估哺乳动物个体是否存在患高血压危险的方法，以及对高血压进行针对性治疗的方法。
应理解，本发明所述的“治疗”还包括了“预防”。
“在12个谷氨酸的谷氨酸重复单元中缺失至少1个谷氨酸”是指在受体多肽第3个胞内环上氨基酸序列第294-311位的18个氨基酸的酸性区段中的第298-309(SEQ ID NO4)位的12个谷氨酸的重复单元中，缺失1-12个谷氨酸中的任意位置或任意数目的谷氨酸。
“人α2B-肾上腺素受体缺失/缺失(D/D)基因型”，简称“D/D基因型”，是指一种个体的基因型，含有两个编码变异α2B-肾上腺素受体的α2B-肾上腺素受体等位基因，该变异α2B-肾上腺素受体在受体多肽第3个胞内环上氨基酸序列第294-311位的18个氨基酸的酸性区段中的第298-309位的12个谷氨酸重复单元上缺失至少1个谷氨酸。相对应的，“缺失/插入(D/I)基因型”是指一种基因型，含有1个编码具有所述缺失的α2B-肾上腺素受体的等位基因，另一等位基因编码没有所述缺失，即有各自插入的α2B-肾上腺素受体。“插入/插入(I/I)基因型”是指一种基因型，其两个等位基因均编码没有所述缺失或其它缺失的α2B-肾上腺素受体。
最近发现了人α2B-AR基因(SEQ ID NO3)的一种常见的变异形式(SEQID NO1)(Heinonen等，1999)，该变异基因编码一种受体蛋白(SEQ ID NO2)，在该受体多肽第3个胞内环上氨基酸序列第294-311位(SEQ ID NO4)的18个氨基酸的酸性区段中的第298-309位的12个谷氨酸重复单元上，第307-309位缺失3个谷氨酸。对一群肥胖的芬兰受试者试验发现，该变异基因(SEQ IDNO1)与基础代谢率(BMR)的降低有关(Heinonen等，1999)。在这166个肥胖者中，47人(28％)携带纯合的(Glu12/Glu12)长型12个Glu的重复单元，而90人(54％)是杂合的(Glu12/Glu9)，另29人(17％)是纯合的短型(Glu9/Glu9)。
下面的数据显示，在912个芬兰中年男性受试者的人群样本中，纯合短型(Glu9/Glu9)也即α2B-肾上腺素受体的缺失/缺失(D/D)基因型患高血压的危险明显提高。基于这些结果以及借鉴以前的公开出版物，可以假定D/D基因型在持续的受体活化期间下调α2B-肾上腺素受体功能的能力下降。由于改变的α2B-肾上腺素受体功能看来与高血压的发病机理相关，我们认为当有其他高血压危险因素存在时，它也与插入/缺失(I/D)(杂合Glu12/Glu9)、插入/插入(I/I)(纯合Glu12/Glu12)基因型有关。此外，由于在受体多肽第3个胞内环上氨基酸序列第294-311位的18个氨基酸的酸性区段中的第298-309位的12个谷氨酸重复单元上3个Glu的特异缺失看来与高血压相关，我们相信其他的缺失，即在所述的298-309位12个谷氨酸重复单元上缺失至少1个Glu，也可以与高血压的发病机理相关，因为受体多肽第3个胞内环位于对α2B-肾上腺素受体的负调节而言具有重要的作用的位置。因而D/D基因型的人具有长期上调的α2B-肾上腺素受体，导致了全身血压的升高。
α2B-肾上腺素受体介导动脉收缩，并且存在于α2B-肾上腺素受体基因的基因多态现象使一些受试者对α2B-肾上腺素受体介导的抵抗血压调节的动脉(小动脉)的血管收缩更加敏感，从而导致相关的临床失调如高血压。使用α2B-肾上腺素受体拮抗剂对于这些受试者特别有用，但是如果使用了亚型非选择性的α2激动剂，将由于副作用而使危险性更高。因此，使用基因测试来识别受试者是否有α2B-肾上腺素受体基因的缺失变异对于诊断、进行特异治疗的病人的选择以及临床用药测试试验是有用的。识别α2B-肾上腺素受体D/D基因型的基因测试有助于评估个体患D/D基因型相关高血压的危险性。基于其遗传病因学，该测试可用于建立一种特异的高血压亚诊断。
此外，基因测试识别α2B-肾上腺素受体D/D基因型对于高血压病人治疗药物的选择是有用的，如直接或通过中枢神经系统作用来调节、抑制或活化受试者血管α或β肾上腺素受体的药物，比如吲哚洛尔(pindolol)、普萘洛尔(propranolol)、索他洛尔(sotalol)、噻吗洛尔(timolol)、醋丁洛尔(acebutolol)、阿替洛尔(atenol)、倍他洛尔(betaxolol)、比索洛尔(bisoprol)、艾司洛尔(esmolol)、美托洛尔(metoprolol)、赛利洛尔(seliprol)、卡维地洛(carvedilol)、拉贝洛尔(labetalol)、可乐定(clonidine)、莫索尼定(moxonidine)、哌唑嗪(prazosin)或吲达帕胺(indapamid)，包括α肾上腺素受体拮抗剂(α2B-选择性或非选择性)。
例如，血管紧张素II可引起去甲肾上腺素敏感性增加，这种影响至少有一部分是由α肾上腺素受体介导的(Datte等，2000)。使用血管紧张素II抑制药物比如血管紧张素(AT)受体阻断剂所致的血压下降作用，在α2B-肾上腺素受体D/D基因型人体内可被令人信服地提高。这种药物比如卡托普利(captopril)、辛那普利(cinapril)、依那普利(enalapril)、咪达普利(imidapril)、赖诺普利(lisinopril)、莫昔普利(moexipril)、培哚普利(perindopril)、雷米普利(ramipril)、群多普利(trandolapril)、坎地沙坦(candesartan)、依普沙坦(eprosartan)、伊贝沙坦(irbesartan)、氯沙坦(Losartan)、缬沙坦(valsartan)或替米沙坦(Telmisartan)。
一种识别α2B-肾上腺素受体D/D基因型的测试对于由于α2肾上腺素激动剂的副作用而危险性增加的病人的药物治疗方案的选择有益处，或者可能避免对该类病人施用α2激动剂，或者可能在这些病人的治疗方案中使用特异性α2B-拮抗剂。
另一方面可以认为，对D/D基因型以外的病人使用其他的抗高血压药物进行治疗更加有益。
DNA测序可以用于筛选受试者，测定受试者是否为变异基因的携带者。该测定可以用一些已知的DNA分析方法来进行，包括对正常和变异基因进行直接的DNA序列测定，或使用聚合酶链反应(PCR)对等位基因进行特异性扩增，以检测出正常或变异的序列，或通过分子生物学方法如PCR-单链构象多态性(SSCP)方法或变性梯度凝胶电泳(DGGE)间接测定正常或变异基因。正常或变异基因的测定也可以使用限制性片段长度多态性(RFLP)方法，该方法特别适用于对大量的样品进行基因定型。同样的，基于基因芯片或点阵(array)技术的检测可以容易地根据目前已存在的许多这类检测单个-核苷酸多态性的检测方法建立。
这种测试还可以通过多种分析RNA在组织中的表达水平的方法来进行。可以设计等位基因特异性探针进行杂交，杂交方法比如使用Northern印迹、RNA酶保护试验或原位杂交方法。来自正常或变异基因的RNA也可以通过将组织中RNA首先转换为cDNA，然后用等位基因特异性PCR扩增该cDNA的方法来分析。
在本发明中使用的试剂盒最好包含本发明方法所需各种组分，各组分分别置于不同容器和/或小瓶中，并且包括实施本方法的说明书。比如，可包括一些或全部的测试所需试剂和其他成分，如缓冲液、引物、酶、对照样品或标准样品等，可以独立包装并置于同一个盒子中备用，方法说明书可以放在盒子中、作为独立的插页或作为盒子上的标签和/或作为盒中各小瓶上的标签。该试剂盒中还可以包含必要的软件，以解释使用该试剂盒将得到的结果，或解释如何利用本方法中使用的基因芯片的结果。
以下实施例将对本发明进行更为详细的描述。
实施例编码α2B-肾上腺素受体的基因组等位基因的测定
PCR-SSCA分析多聚酶链反应-单链构象分析(PCR-SSCA)用于鉴定编码α2B-肾上腺素受体的基因组等位基因，其方法如下编码α2B-肾上腺素受体的基因组DNA分两部分扩增，这两部分特异地针对不含内含子的α2B-肾上腺素受体基因序列(Lomasney等，1990)。PCR扩增使用的引物对为引物对15’-GGGGCGACGCTCTTGTCTA-3’(SEQ ID NO5)和5’-GGTCTCCCCCTCCTCCTTC-3’(SEQ ID NO6)(产物大小878bp)；引物对25’-GCAGCAACCGCAGAGGTC-3’(SEQ ID NO7)和5’-GGGCAAGAAGCAGGGTGAC-3’(SEQ ID NO8)(产物大小814bp)。
引物获自KeboLab(Helsinki，Finland)。PCR扩增以5μl的体积进行，其中包含100ng基因组DNA(从全血中分离获得)，每种引物各2.5mmol/l，1.0mmol/l dNTPs，30hmol/l33P-dCTP，以及0.25U AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)。PCR的条件是使用PCR OptimizerTM试剂盒(Invitrogen，San Diego，CA)进行优化。样品用9600型GeneAmp PCR扩增仪(Perkin Elmer Cetus)进行扩增。PCR产物用限制酶酶切，以进行SSCA分析。引物对1的产物用Dde I和Dra III(Progema Corp.，Madison，WI)酶切，引物对2的产物用Alu I和Hinc II(Promega Corp.)酶切。酶切样品与SSCA缓冲液混合，其中缓冲液包含95％甲胺酰，10mmol/l NaOH，0.05％二甲苯兰和0.05％溴酚兰(总体积25μl)。在加样前，样品在95℃变性5分钟，并在冰上放置5分钟。接着将每种样品3微升加样在MDETM高分辨凝胶(FMC，BioProducts，Rockland，MA)中。分别在6％MDE胶、4℃以及3％MDE胶、室温条件下进行两次凝胶电泳，均保持4W恒定功率，电泳时间为16小时。将凝胶干燥，并于室温下在Kodak BioMax MR胶片上放射自显影24小时。
序列和基因型测定在SSCA中不同迁移率的DNA样品用耐热测序酶循环测序试剂盒(Thermo SequenaseTMCycle Sequencing Kit)(Amersham Life Science，Cleveland，Ohio)测序。
为了鉴定3个Glu缺失的基因型，用标准的方法从外周血中提取DNA。α2B-AR I/D基因型通过电泳分离PCR扩增的DNA片段来测定，基于I/D变异的特点，长的和短的等位基因由于具有9 bp的差别，电泳迁移率也不同来鉴别。
用正义引物5’-AGG-GTG-TTT-GTG-GGG-CAT-CT-3’(SEQ ID NO9)和反义引物5’-CAA-GCT-GAG-GCC-GGA-GAC-ACT-3’(SEQ IDNO10)(Oligole，Eurogentec，Belgium)扩增所需序列区域，获得一段112bp的长等位基因(I)和一段103bp的短等位基因(D)产物。PCR扩增以10μl的体积进行，其中包含～100ng基因组DNA，1×缓冲液G(Invitrogen，San Diego，CA，USA)，0.8mM dNTPs，每种引物0.3μM，以及0.25单位AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT，USA)。样品在9600型PCR扩增仪(Perkin Elmer Cetus)进行扩增。样品需在94℃最初变性2分钟，然后扩增35个循环。PCR扩增条件为96℃40秒、69℃30秒、72℃30秒，最后在72℃延伸6分钟。短的和长的PCR产物可选择两种方法来鉴定1)扩增样品与4μl终止液(耐热测序酶循环测序试剂盒)混合，加热到95℃保持2分钟，趁热加样到测序凝胶中(Long Ranger(TM)，FMC)，将凝胶按照前述方法干燥并放射自显影；2)。用高分辨率4％Metaphor琼脂糖凝胶(FMC Bioproducts，Rockland，Maine)电泳分离扩增的PCR产物，加入溴乙锭显示条带。在上述两种方法中，长(Glu12)和短(Glu9)的等位基因基于其自身的不同迁移率而被分离鉴定。
群体研究前面已提到，对912位芬兰中年男性受试者进行了群体研究(populationstudy)，其中192受试者存在特异的α2B-肾上腺素受体缺失/缺失(D/D)基因型，以下进行详细描述。
已知α2B-AR在小鼠中有血管收缩的特性，这可能与受体脱敏机制中所研究的酸性区段有关，因此我们假设所观察到的插入/缺失型等位基因变异可与高血压有关。为了验证这一假设，我们对912位没有冠心病历史的芬兰中年男性作了群体研究。该研究是作为Kuopio Ischemic Heart Disease RiskFactor Study(KIHD)的一部分进行的，KIHD是一项正在进行的基于群体的研究，以调查造成东芬兰男性心血管疾病的危险因素以及相应结果(Salonen，1988)。该地域具有纯合的人群(Sajantila等，1996)以及高的冠心病发病率和死亡率(Keys，1980)。
在这912位受试者中，192人(21％)携带D/D基因型，256人(28％)携带I/I基因型，464人(51％)携带I/D杂合基因型，该基因型分布符合哈迪-温伯格平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium)(p＝0.46)。
其中，417位男性没有高血压的家族史，495位男性的家族中有高血压患者(父母或者兄弟姐妹有，或父母及兄弟姐妹都有高血压)。可以认为在有高血压家族史的受试者中，高血压与遗传特征具有更明显的相关性，因此在进行α2B-肾上腺素受体基因型和高血压相关性研究时，对有或没有高血压家族史的男性进行分别分析(表1和表2)。在一个对有家族史的男性(表1)的多元线性回归模型分析中，携带D/D基因型的男性的平均心脏收缩血压(BP)相对高于其他基因型(p＝0.021)。在那些有高血压家族史男性的多元逻辑模型中，D/D纯合的男性患高血压(心脏收缩血压至少165mmHg或心脏舒张血压至少95mmHg，或抗高血压药物治疗，表2)的可能性(流行)比其他的高出2.04倍(95％置信区间1.06-3.93，p＝0.032)。
分别在D/D纯合的男性和其他男性中来分析使用α肾上腺素受体拮抗剂如哌唑嗪(prazosin)与高血压之间的联系。根据特定药物以及其他药物对血压影响的不同来判断抗高血压效果。在D/D基因型男性而非其他的男性中，α肾上腺素受体拮抗剂的使用与降低心脏收缩和心脏舒张血压相关，又降低了许多自述副作用的发生。对440个高血压男性进行11年的随访后(心脏收缩血压大于等于165mmHg或心脏舒张血压大于等于95mmHg或抗高血压药物治疗)，在α2B-肾上腺素受体D/D基因型的男性中，使用α阻断剂治疗的人平均心脏收缩血压为111mmHg，使用其他药物治疗的人为137mmHg，而其它基因型的男性的这些平均值为150mmHg和138mmHg。使用β肾上腺素受体拮抗剂(β阻断剂)如阿替洛尔(atenolol)、美托洛尔(metoprolol)、吲哚洛尔(pindolol)具有相似的趋势，同时也与血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂如卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、赖诺普利(Lisinopril)相似。比如在根据KIED基线检查患高血压的344个男性中，使用β阻断剂治疗的D/D基因型受试者平均心脏收缩血压在11年后为134mmHg，使用其他药物的为141mmHg，而携带其他基因型的男性的这些平均值为137和138mmHg。在这440个患高血压男性的11年随访中，携带D/D基因型并用β阻断剂治疗的人平均心脏收缩血压为133mmHg，用其他药物治疗的为139mmHg，而携带其他基因型的男性中这些平均值为139和138mmHg。在用β阻断剂治疗的男性中，携带D/D基因型的平均心脏收缩血压是128.8mmHg(SD 16.2)，携带其他基因型的为135.5mmHg(SD 19.3)(p＝0.04差异)。在调节年龄和体表面积重量(body-mass)(kg/m2)指数的线性协方差模型中，基因型-β阻断剂之间的相互关系有明显的统计学规律(1-sided p＝0.04)。
有些抗高血压药物的抗高血压作用通过肾上腺素受体或去甲肾上腺素敏感性调节机制以外的机制进行，并且对于非D/D基因型的男性作用更大。比如，利尿剂和钙通道阻断剂在非D/D基因型的α2B-AR基因型男性中的降血压作用更大。在用α2肾上腺素受体激动剂如可乐定(clonidine)治疗时，携带D/D基因型的男性具有更强的副作用发生和更小的抗高血压反应。
总之，根据已知的α2B-AR的生物学特性、同种芬兰人群的研究、研究设计、相对有巨大代表性的研究人群，以及高血压与单一因素的联系，都证明D/D受体等位基因是导致高血压的遗传性危险因素。
值得说明的是，本发明的方法可以结合不同的实施方式进行，这里叙述的只是其中一部分，对于本领域的技术人员而言，还存在其他实施方式，且这些方式不背离本发明的目的。因此，这里描述的是举例性的内容，不应该被解释为限制本发明。
表1 在线性回归模型中，影响无高血压家族史和有高血压家族史的男性平均收缩血压最强的危险因素
表2在无高血压家族史和有高血压家族史的男性中，与α□2B-AR基因型和其它最强的危险因素相关的，患高收缩血压的可能性和其95％的置信区间
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<141>
<160>10<170>Patent In Ver.2.1<210>1<211>1344<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1 341)<223>变异的人α2B--肾上腺素受体蛋白的编码序列<400>1atg gac cac cag gac ccc tac tcc gtg cag gcc aca gcg gcc ata gcg 48Met Asp His Gln Asp Pro Tyr Ser Val Gln Ala Thr Ala Ala Ile Ala1 5 10 15gcg gcc atc acc ttc ctc att ctc ttt acc atc ttc ggc aac gct ctg 96Ala Ala Ile Thr Phe Leu Ile Leu Phe Thr Ile Phe Gly Asn Ala Leu20 25 30gtc atc ctg gct gtg ttg acc agc cgc tcg ctg cgc gcc cct cag aac144Val Ile Leu Ala Val Leu Thr Ser Arg Ser Leu Arg Ala Pro Gln Asn35 40 45ctg ttc ctg gtg tcg ctg gcc gcc gcc gac atc ctg gtg gcc acg ctc192Leu Phe Leu Val Ser Leu Ala Ala Ala Asp Ile Leu Val Ala Thr Leu50 55 60atc atc cct ttc tcg ctg gcc aac gag ctg ctg ggc tac tgg tac ttc240Ile Ile Pro Phe Ser Leu Ala Asn Glu Leu Leu Gly Tyr Trp Tyr Phe65 70 75 80cgg cgc acg tgg tgc gag gtg tac ctg gcg ctc gac gtg ctc ttc tgc288Arg Arg Thr Trp Cys Glu Val Tyr Leu Ala Leu Asp Val Leu Phe Cys85 90 95acc tcg tcc atc gtg cac ctg tgc gcc atc agc ctg gac cgc tac tgg336Thr Ser Ser Ile Val His Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Trp100 105 110gcc gtg agc cgc gcg ctg gag tac aac tcc aag cgc acc ccg cgc cgc384Ala Val Ser Arg Ala Leu Glu Tyr Asn Ser Lys Arg Thr Pro Arg Arg115 120 125atc aag tgc atc atc ctc act gtg tgg ctc atc gcc gcc gtc atc tcg432Ile Lys Cys Ile Ile Leu Thr Val Trp Leu Ile Ala Ala Val Ile Ser
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<223>人工序列的描述PCR引物对<400>6ggtctccccc tcctccttc19<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物对<400>7gcagcaaccg cagaggtc 18<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物对<400>8gggcaagaag cagggtgac19<210>9
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物对<400>9agggtgtttg tggggcatct20<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物对<400>10caagctgagg ccggagacac t 2权利要求
1.一种通过测定编码变异α2B-肾上腺素受体的等位基因的类型，检测受试者体内是否存在患高血压的危险的方法，包含以下步骤a)提供受试者的待测生物样品；b)提供一种检测，来检测生物样品中是否存在i)人α2B-肾上腺素受体插入/插入(I/I)或缺失/插入(D/I)基因型，或ii)人α2B-肾上腺素受体缺失/缺失(D/D)基因型，D/D基因型的存在表明受试者患高血压的危险性增加。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测是DNA检测。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述检测是通过使用基因或DNA芯片、微阵列、条带、板或待检测的一个以上的基因、突变或RNA表达的类似组合来进行的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，等位基因型是通过使用聚合酶链式反应来测定的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品是血液样品或口腔刮离样品，所述基因组DNA是从这些样品中分离的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测基于一种包含单链cDNA的捕获探针，其包含编码变异α2B-肾上腺素受体蛋白的核苷酸序列，该变异α2B-肾上腺素受体蛋白的核苷酸序列在位于受体多肽第3个胞内环上氨基酸294-311位18个氨基酸酸性区段中，第298-309位12个谷氨酸的谷氨酸重复单元上缺失至少一个谷氨酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测基于一种包含单链cDNA的捕获探针，该cDNA对应于α2B-肾上腺素受体，该受体在受体多肽第3个胞内环上氨基酸序列第294-311位18个氨基酸酸性区段中第298-309位12个谷氨酸的重复单元上没有谷氨酸的缺失。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的方法用于检测受试者是否将受益于可影响受试者去甲肾上腺素敏感性或交感神经活性的药物的治疗。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的方法用于检测受试者是否将受益于α2B-肾上腺素受体拮抗剂的治疗。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的方法用于检测如果给药受试者亚型非选择性α2激动剂或利尿剂或钙通道阻断剂，是否受试者副作用的危险性增加。
11.根据权利要求1所述的方法，其中包含如下步骤选择D/D基因型的受试者以进行临床药物试验，测定化合物的抗高血压作用。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述的化合物是一种影响受试者去甲肾上腺素敏感性或交感神经活性的药物。
13.根据权利要求8或11所述的方法，其中，所述的化合物是一种直接或通过中枢神经系统作用，调节、抑制或活化受试者血管α或β肾上腺素受体的药物。
14.根据权利要求8或11所述的方法，其中，所述的化合物是一种血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II抑制剂或血管紧张素受体抑制剂。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述的化合物是一种α2B选择性或α2B非选择性的α2肾上腺素受体拮抗剂。
16.一种对高血压受试者进行针对性高血压治疗的方法，通过测定编码所述变异α2B-肾上腺素受体等位基因的类型，即通过测定受试者的人α2B-肾上腺素受体基因型是否属于缺失/缺失(D/D)型来进行，该方法包括权利要求1中所述的步骤，并对D/D基因型的受试者施用能影响去甲肾上腺素敏感性或交感神经活性的药物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述的药物是一种直接或通过中枢神经系统的作用，调节、抑制或活化受试者血管α或β肾上腺素受体的药物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述的药物是吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、美托洛尔、赛利洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、可乐定、莫索尼定、哌唑嗪或吲达帕胺。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述的药物是一种血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II抑制剂或血管紧张素受体抑制剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述的药物是卡托普利、辛那普利、依那普利、咪达普利、赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、雷米普利、群多普利、坎地沙坦、依普沙坦、伊贝沙坦、氯沙坦、缬沙坦或替米沙坦。
21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述的药物是α2B选择性或α2B非选择性的α2肾上腺素受体或α肾上腺素受体拮抗剂。
22.一种试剂盒，可用于检测受试者是否存在患高血压的危险因素，或用于选择进行针对性抗高血压治疗的受试者，或用于选择进行临床药物试验以测定化合物的抗高血压效果的受试者，其中包含可测定来自所述受试者的生物样品中编码变异α2B-肾上腺素受体的等位基因类型的用品，还可选择地包括解释检测结果的软件。
23.权利要求22所述的试剂盒的用途，用于检测受试者是否存在患高血压的危险，或用于选择进行针对性抗高血压治疗的受试者，或用于选择进行临床药物试验以测定化合物的抗高血压效果的受试者。
全文摘要
本发明关于一种检测受试者是否存在患高血压的危险因素、对受试者进行针对性抗高血压治疗的方法，本方法包括从受试者体内分离基因组DNA、确定包含编码变异α
文档编号A61P9/12GK1522303SQ02808601
公开日2004年8月18日 申请日期2002年2月13日 优先权日2001年2月20日
发明者朱卡·萨洛南, 朱卡 萨洛南 申请人:Oy朱里拉布有限公司