专利名称：海绵内酯酸的某些盐、含有它们的药物组合物及其在治疗肿瘤中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及化疗药物领域，且更具体地涉及海绵内酯(discodermolide)酸的某些盐以及所述海绵内酯酸盐在治疗肿瘤中的用途。
背景技术：
海绵内酯(1)是一种新的聚酮类天然产物，它是由Harbor Branch海洋学研究所(HBOI)的研究人员从海产海绵Discodermia dissoluta的提取物中分离而得(Gunasekera SP，Gunasekera M，Longley RE，Schulte GK.，“海绵内酯一种得自海产海绵Discodermia dissolute的新的具有生物活性的多羟基化内酯”[在J.Org.Chem.1991；561346中可见公开勘误表]，J.Org.Chem.1990；554912-15.)。海绵内酯和紫杉醇的结构没有明显的相似性，然而它和紫杉醇(药物“泰素”(Taxol)中的活性物质)都具有稳定微管的作用。在基于机理的实验中，海绵内酯比紫杉醇更为有效。海绵内酯可与紫杉醇竞争性地结合微管蛋白。由于已经证明紫杉醇可用于治疗一些癌症，所以其它具有相同机理类型的化合物也可能具有抗增殖性疾病的作用。
发明概述本发明提供了对多种癌细胞有效的新的抗肿瘤药物。更具体地讲，本发明涉及在杀灭癌细胞方面显示出较高选择性的某些海绵内酯酸盐。此外，本发明提供了含有治疗有效量的某些海绵内酯酸盐的、可用于治疗肿瘤的药物组合物。此外，本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括向患肿瘤哺乳动物施用治疗有效量的某些海绵内酯酸盐。而且，本发明涉及制备某些海绵内酯酸盐的方法。
发明详述本发明的本质是发现了某些海绵内酯酸盐可用于治疗肿瘤。在一个实施方案中，本发明提供了新的式I抗肿瘤药物， 其中R为Li+、Na+、K+、1/2 Ca++、1/2 Mg++、1/2 Mn++、R1R2R3R4N+，或为选自 和 的含氮环，其中R1、R2、R3和R4各自独立地为氢、(C1-12)烷基、羟基(C2-8)烷基或苄基；且n为1至5。
优选的化合物为那些式I化合物，其中R为Li+、Na+、K+、1/2 Ca++、R1R2R3R4N+，或为选自II、III和IV的含氮环，其中R1、R2、R3和R4各自独立地为氢、(C1-8)烷基、羟基(C2-6)烷基或苄基；且n为1至3。
更优选的化合物为那些式I化合物，其中R为Na+、K+、1/2 Ca++、R1R2R3R4N+，或为选自II和III的含氮环，其中R1、R2、R3和R4各自独立地为氢、(C1-6)烷基、羟基(C2-4)烷基或苄基；且n为1或2。
更优选的化合物为那些式I化合物，其中R为Na+、1/2 Ca++、R1R2R3HN+，或为选自 和 的含氮环，其中R1、R2和R3各自独立地为氢、(C1-6)烷基、羟乙基或苄基；且n为1或2。
在另一个实施方案中，本发明提供了可用于治疗肿瘤的药物组合物，其含有可药用的载体或稀释剂和治疗有效量的以上式I化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括向需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的以上式I化合物。
此外，本发明涉及式I化合物用于治疗人体或动物体的用途，尤其是在制备用于肿瘤化疗的药物组合物中的用途。
在以上定义中这里所用的术语“(C1-12)烷基”是指仅由碳和氢组成并且具有1至12个碳原子的直链、支链或环烷基基团。“烷基”的例子包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、3-甲基戊基、环己基、环戊基丁基等。这里所用的羟基(C1-8)烷基的“(C1-8)烷基”部分是指仅由碳和氢组成并且具有1至8个碳原子的直链或支链基团。
海绵内酯酸盐可按下述方法从式1的海绵内酯制备 其中每个R如上所定义。
海绵内酯酸盐的制备包括1的水解。水解需要相对于ROH的1至100当量的1，优选相对于ROH的1至5当量的1。水解在极性有机溶剂、优选醚、更优选四氢呋喃存在下，在0℃至20℃、优选0℃至10℃的温度下进行5分钟至2小时、优选15至30分钟。
海绵内酯(1)的全合成在几种出版物中述及，例如A.B.Smith等人，J.Am.Chem.Soc.(1995)，117(48)，12011-12；J.Golec等人的专利申请GB94-15399或者I.Paterson等人，Angew.Chem.，Int.Id.(2000)，39(2)，377-380。
所有ROH化合物或者是已知的并在文献中公开，或者可按照与文献中公开的方法类似的方法制备。
如果需要，可对所得的海绵内酯酸盐通过常规技术如层析或尤其是重结晶(如是固体)进行纯化。
显然，对于本领域技术人员而言，式I化合物含有不对称碳原子。因此应该知道各个立体异构体被视为包括在本发明的范围内。
如以上所指出的所有式I化合物都是抗肿瘤剂，并且因此可用于抑制各种淋巴瘤、肉瘤、癌瘤、骨髓瘤和白血病细胞系的生长。式I化合物的抗肿瘤活性可通过贴壁依赖性生长单层实验(ADGMA)进行证明，所述实验测定试验化合物对贴壁细胞单层增殖的生长抑制作用。该实验是按照改进的国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)使用的60细胞系实验而进行的，所作的改进如下1)采用4种代表重要肿瘤类型即MIP 101结肠癌、HCT 116结肠癌、1A9卵巢癌和1A9PTX22卵巢癌的细胞系；和2)使用四氮唑衍生物，即MTT，以测定细胞密度。
ADGMA可对暴露于试验化合物3天后的存活细胞数与加入试验化合物时存在的细胞数进行比较。用四唑衍生物，即溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基-四氮唑(MTT)测定细胞的存活能力，所述MTT在电子偶合剂(PMS；吩嗪硫酸甲酯)存在下可被活细胞代谢还原成水溶性的甲衍生物。甲衍生物在540nm处的吸光度(A540)与存活细胞数成比例。试验化合物的IC50是指将最终细胞数减少到最终对照细胞数的50％所需的化合物浓度。如果细胞增殖受到抑制，所述实验可进一步将化合物定义为抑制细胞化合物(化合物培育3天后的细胞数＞加入化合物时的细胞数)或细胞毒性化合物(化合物培育3天后的细胞数＜加入化合物时的细胞数)。
HCT 116结肠癌细胞系得自美国菌种保藏中心(American TypeCulture Collection(ATCC)，Rockville，MD)。MIP 101结肠癌细胞系得自Robert Kramer博士(百时美施贵宝)且在以前被述及(Niles RM，WilhemSA，Steele GD JR，Burke B，Christensen T，Dexter D，O’Brien MJ，ThomasP，Zamcheck N.“未分化的人结肠癌细胞系(MIP-101)的分离及鉴定”，Cancer Invest.1987；5(6)545-52.)。1A9和1A9PTX22卵巢肿瘤细胞系得自Tito Fojo博士(国家癌症研究所，国家卫生研究所，临床科学部，药学分部，MD 20892)。1A9是卵巢癌细胞系A2780的克隆(Giannakakou P，Sackett，DL，Kang Y-K，Zhan Z，ButersJTM，Fojo T，Poruchynsky MS.“耐紫杉醇的人卵巢癌细胞具有可削弱紫杉醇诱导的聚合作用的突变β-微管蛋白”，J.Biol.Chem.1997，272(4)17118-17125)。1A9PTX22亚系是通过在5μg/mL的维拉帕米存在下将1A9细胞系暴露于5ng/mL紫杉醇中的单步选择反应、作为单个克隆从1A9细胞系中分离而得。所有细胞系在解冻后传代4至20次时使用。使MIP 101结肠癌、HCT 116结肠癌、1A9卵巢癌和1A9PTX22卵巢癌细胞系在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基的平板上保持并接种。
将细胞用胰蛋白酶消化并用血红蛋白计数器计数以测定细胞浓度。然后将细胞接种于96孔板中的它们各自的维持培养基中(200μL/孔)，浓度如下MIP 101,2000个细胞/孔；HCT 116，2000个细胞/孔；1A9,10000个细胞/孔；1A9PTX22,10000个细胞/孔。在预实验中测定每孔的细胞数，并在平板接种后的第4天得到75至90％的融合。平板接种后1天时测量的初始细胞密度比培养基空白的细胞密度约略大0.10至0.20个A540吸光度单位。在第0天接种96孔平板并在第1天加入试验化合物。仅A行接受培养基、B至E行每行接受一个细胞系，制得“0时间”平板。接种24小时后(当将药物加到实验平板中时)对“0时间”平板进行如下处理向每孔中加入5μL的MTT储备液(PBS中的浓度为0.5mg/ml)，然后在37℃、5％CO2、潮湿的环境中培育3小时。然后小心地将培养基完全除去。使平板在暗处干燥。向每孔中加入DMSO(二甲亚砜)(100μl/孔)并将平板置于定轨摇摆器上摇摆2小时。将平板置于Molecular Devices平板读数器中的96孔平板读数器中、使用2.35版的Softmax、以吸收模式-末点L-1于540nm处读数，以DMSO作为空白。平板接种1天后，向试验平板中加入试验化合物(最终稀释度为1∶10)然后连序稀释10次。对照平板仅接受溶剂的1∶10稀释物(10％DMSO/90％RPMI 1640)。加入试验化合物3天后，按照以上处理“0时间”平板的方法对所有试验平板和对照平板进行处理。从净生长百分数相对化合物浓度所作的图中确定IC50值。净生长百分数按照以下公式计算[(细胞+药物)A540-初始A540]/[(细胞+药物赋形剂)A540-初始A540]。
可以得到以下IC50值(平均±S.E.M.)，单位为μM
通过使用无胸腺(T细胞缺损)裸鼠中空纤维体内肿瘤细胞培育模型可以进一步证明式I化合物的抗肿瘤活性。使用该模型可以测定试验化合物对在无胸腺裸鼠的皮下(s.c.)生长的中空纤维中的人肿瘤细胞生长的抑制作用。所用的组织学肿瘤类型为MIP 101结肠癌、HCT-116结肠癌、1A9PTX22卵巢癌和1A9卵巢癌。
**P＝＜0.01
每天静脉内施用紫杉醇15mg/kg，为期5天单次静脉内施用实施例1的化合物45mg/kgReg.＝回归如上所述得到细胞系。如以上所提及1A9PTX22亚系是通过在5μg/mL的维拉帕米存在下将1A9细胞系暴露于5ng/mL紫杉醇中的单步选择反应、作为单个克隆从1A9细胞系中分离而得。发现1A9PTX22细胞系对紫杉醇的抗性比亲本1A9强24倍。将1A9PTX22细胞系在无药物的培养基中培养2年后发现其对紫杉醇的抗性不变，这归因于可见于1A9PTX22细胞系中的、β-微管蛋白中Ala364→Thr的突变。
在组织培养培育器(37℃、可调控的含5％的CO2的潮湿气氛)中，使所有细胞系在含有10％热失活的FBS(Life Technologies，Grand Island，NY)的RPMI 1640培养基中增殖和扩展。在T75组织培养烧瓶(Costar，Corning，NY)中进行细胞扩展。使用0.25％的胰蛋白酶-EDTA(LifeTechnologies，Grand Island，NY)在融合达70至90％时收集细胞以制备中空纤维。
在使用前将PVDF中空纤维(Spectrum，Gardena，CA)于70％EtOH中浸泡72小时。使用注射器用3mL冰冷的组织培养液冲洗单个纤维。然后以适当的细胞悬液(对于1A9和1A9PTX22细胞为1×106个细胞/mL，对于HCT 116和MIP 101细胞为0.3×106个细胞/mL)填充每根纤维，并将纤维的两端密封。然后将完整长度的纤维密封入1.5cm的微囊(还称为“中空纤维”)中，每个微囊含有约15μL的适当的细胞悬液。在分离后将每个纤维置于有孔平板中，于37℃培育过夜。
将杂交繁殖的无胸腺(nu/nu)雌性小鼠(“ChrlsAthymic Nude-nu”，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)麻醉。将含有1至2个中空纤维的11-口径套管针通过用剪刀剪开的切口插入动物的颈背部，以进行皮下植入。
植入1天后(4个中空纤维/动物，每个中空纤维含有HCT 116、MIP101、1A9和1A9PTX22中的一个细胞系)，将动物随机分成5组，每组6只小鼠。将第一组动物处死，取回中空纤维并根据已公开的方法进行处理，以确定每个纤维中的存活细胞数(T0)。
余下各组如下处理组1单次静脉施用实施例1的化合物45mg/kg。
组2单次静脉施用实施例1化合物的赋形剂(16.7％聚氧乙基化蓖麻油(Cremophor EL)、8.3％乙醇、75％D5W)。
组3每天静脉施用紫杉醇15mg/kg，为期5天。
组4每天静脉施用紫杉醇的赋形剂(12.5％聚氧乙基化蓖麻油、12.5％乙醇、75％D5W)，为期5天。
在第7天时，将所有动物处死，并取回中空纤维进行处理以确定每个纤维中的存活细胞数(T为用试验化合物处理的动物体内的纤维中的存活细胞数，C为用相应的赋形剂处理的动物体内的纤维中的存活细胞数)。抗肿瘤活性表达为“ΔT平均/ΔC平均％”[比较处理组与赋形剂对照组中细胞的增长，其中ΔT平均/ΔC平均％＝(T平均-T0平均/C平均-T0平均)×100％]。使用以下公式计算回归(1-T平均/T0平均)×100％。结果的统计学显著性均用双尾Student’s t-检验进行评价。
式I化合物可单独使用或和其它治疗剂组合使用。可能组合使用的治疗剂尤其为一种或多种细胞抑制或细胞毒性化合物，例如化疗药物，其选自(包括但不限于)多胺生物合成抑制剂；蛋白激酶抑制剂，特别是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶如蛋白激酶C的抑制剂，或者是酪氨酸蛋白激酶如EGF受体酪氨酸激酶(例如PKI166)、VEGF受体酪氨酸激酶(例如PTK787)或PDGF受体酪氨酸激酶(例如STI571)的抑制剂；细胞因子；负生长调节剂如TGF-β或IFN-β；芳香酶抑制剂如来曲唑；SH2结构域和磷酸化蛋白相互作用的抑制剂；抗雌激素药物；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；微管活性剂如紫杉醇或埃坡霉素(epothilone)；烷化剂；抗肿瘤的抗代谢药物；铂化合物；抗血管生成化合物；促性激素释放素拮抗剂；抗雄激素药物；二膦酸盐例如AREDIA或ZOMETA以及曲妥珠单抗(trastuzumab)。以编号、通用名或商品名标识的活性药物的结构可从现行版的标准目录“默克索引”或从数据库例如国际专利数据库(例如IMSWorld Publications)中得到。因此其相应内容在此引入作为参考。
用于抑制肿瘤的式I化合物的精确剂量取决于几种因素，包括宿主、所治疗病症的性质和严重性、给药方式和所使用的具体化合物以及(若有的话)组合伙伴。然而，通常当式I化合物以每周期(每周期＝3至6周)1至300mg/kg体重的单剂量或对于大多数大型灵长类动物以每治疗周期50至5000mg的单剂量、经胃肠外(例如经腹膜内、静脉内、肌内、皮下、肿瘤内)或经直肠或经小肠(例如经口服)、优选经静脉内或经口服、更优选经静脉内施用时，可得到满意的肿瘤抑制效果。优选的每3至6周治疗周期的静脉单剂量为1至75mg/kg体重，或对于大多数大型灵长类动物的日剂量为50至1500mg。通常的静脉剂量为45mg/kg，每3周1次。
通常，最初施用小剂量，然后逐渐增加剂量直到所治疗宿主的最佳剂量被确定。剂量的上限为产生副作用时的剂量，并可通过对所治疗的宿主进行试验而确定。
式I化合物可以和一种或多种可药用的载体以及任选地一种或多种其它常用的药物辅料组合使用，并以片剂、胶囊、囊片等的形式经小肠例如经口服施用，或以无菌注射液或混悬液的形式经胃肠外(例如经腹膜内或经静脉内)施用。可通过常规方法制备经肠内和经胃肠外施用的组合物。
式I化合物可配制成包含抑制肿瘤有效量的活性物质的经肠内和经胃肠外施用的药物组合物，这种组合物为单位剂量的形式且含有可药用的载体。
以下实施例对本发明所包含的代表性化合物及其合成进行了说明。然而，应该清楚地知道该实施例仅仅起到说明的作用。
实施例(2R，3S，4S，5S，7S，8Z，10S，11S，12S，13Z，16S，17S，18S，19S，20S，21Z)-19-[(氨基羰基)氧基]-3，5，7，11，17-五羟基-2，4，10，12，14，16，18，20-八甲基-8，13，21，23-二十四碳四烯酸钠盐的合成。
给25mL圆底烧瓶配备以磁力搅拌和隔膜，并将其保持在氮气环境中。向烧瓶中装入95mg(0.16mmol)6-[(2S，3Z，5S，6S，7S，8Z，11S，12R，13S，14S，15S，16Z)-14-[(氨基羰基)氧基]-2，6，12-三羟基-5，7，9，11，13，15-六甲基-3，8，16，18-十九碳四烯基]四氢4-羟基-3，5-二甲基-(3R，4S，5R，6S)-2H-吡喃-2-酮[化学文摘号127943-53-7]和6mL THF。搅拌并使固体溶解后，使烧瓶在冰浴中冷却。在约25分钟内用注射器加入1.6mL 0.10M的NaOH(0.16mmol)。使混合物恢复到室温后，TLC显示反应完全。TLC条件洗脱液100％EtOAc；显色Vanillan/H2SO4/EtOH加热；Rf＝0.5。使混合物在t-BuOMe(30mL)和水(30mL)之间分配。将各层分离并将含有产物的水层用另外30mL t-BuOMe洗涤。将水层过滤并蒸发溶剂得到白色残余物。将残余物用约30mL水重新溶解并冻干，得到白色固体状的所需产物。
1H NMR(300MHz，D2O)δ6.75(1H，dd，J＝16.8，11.0Hz)，6.22(1H，t，J＝11.2，Hz)，5.65(1H，t，J＝9.4Hz)，5.51(2H，m)，5.38(1H，d，J＝16.8Hz)，5.29(1H，d，J＝10.1Hz)，5.02(1H，d，J＝10.1Hz)，4.75(1H，dd，J＝10.3，2.2Hz)，4.53(1H，t，J＝9.0Hz)，4.11(1H，q，J＝4.9Hz)，3.82(1H，q，J＝4.5Hz)，3.34-3.23(2H，m)，3.16(1H，m)，2.71(1H，m)，2.51(1H，m)，2.32(1H，m)，1.94-1.72(4H，m)，1.71-1.55(5H，m)，1.32(1H，m)，1.11(3H，d，J＝6.7Hz)，1.07(3H，d，J＝6.7Hz)，1.02(3H，d，J＝6.7Hz)，0.97(3H，d，J＝6.7Hz)，0.88(3H，d，J＝6.7Hz)，0.87(3H，d，J＝6.7Hz)，0.80(3H，d，J＝4.5Hz).
权利要求
1.式I化合物， 其中R为Li+、Na+、K+、1/2 Ca++、1/2 Mg++、1/2 Mn++、R1R2R3R4N+，或为选自 和 的含氮环，其中R1、R2、R3和R4各自独立地为氢、(C1-12)烷基、羟基(C2-8)烷基或苄基；且n为1至5。
2.权利要求1的式I化合物，其中R为Li+、Na+、K+、1/2 Ca++、R1R2R3R4N+，或为选自II、III和IV的含氮环，其中R1、R2、R3和R4各自独立地为氢、(C1-8)烷基、羟基(C2-6)烷基或苄基；且n为1至3。
3.权利要求2的式I化合物，其中R为Na+、K+、1/2 Ca++、R1R2R3R4N+，或为选自II和III的含氮环，其中R1、R2、R3和R4各自独立地为氢、(C1-6)烷基、羟基(C2-4)烷基或苄基；且n为1或2。
4.权利要求3的式I化合物，其中R为Na+、1/2 Ca++、R1R2R3HN+，或为选自 和 的含氮环，其中R1、R2和R3各自独立地为氢、(C1-6)烷基、羟乙基或苄基；且n为1或2。
5.权利要求1的化合物，其为(2R，3S，4S，5S，7S，8Z，10S，11S，12S，13Z，16S，17S，18S，19S，20S，21Z)-19-[(氨基羰基)氧基]-3，5，7，11，17-五羟基-2，4，10，12，14，16，18，20-八甲基-8，13，21，23-二十四碳四烯酸钠盐。
6.药物组合物，其含有可药用的载体或稀释剂和治疗有效量的权利要求1至4的任何一项的化合物。
7.权利要求6的药物组合物，其含有可药用的载体或稀释剂和治疗有效量的(2R，3S，4S，5S，7S，8Z，10S，11S，12S，13Z，16S，17S，18S，19S，20S，21Z)-19-[(氨基羰基)氧基]-3，5，7，11，17-五羟基-2，4，10，12，14，16，18，20-八甲基-8，13，21，23-二十四碳四烯酸钠盐。
8.治疗肿瘤的方法，其包括向需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1至5的任何一项的化合物。
9.权利要求1至5的任何一项的式I化合物用于治疗人体或动物体的用途。
10.权利要求1至5的任何一项的式I化合物在制备用于肿瘤化疗的药物组合物中的用途。
11.制备权利要求1的化合物的方法，其包括在极性有机溶剂存在下用ROH水解具有式1的化合物，其中R如权利要求1中所定义。
12.权利要求11的方法，其中的溶剂为醚，并且水解是在0℃至20℃的温度下进行的。
全文摘要
本发明涉及式(I)的海绵内酯酸盐，其中R如文中所定义；含有所述盐的药物组合物；所述盐单独或与其它治疗剂的组合在治疗肿瘤中的用途；还涉及制备所述盐的方法。
文档编号A61P35/02GK1503782SQ02808386
公开日2004年6月9日 申请日期2002年4月16日 优先权日2001年4月17日
发明者F·R·小欣德, P·K·卡帕, E·M·勒泽尔, F R 小欣德, 勒泽尔, 卡帕 申请人:诺瓦提斯公司