有关胚胎移植延迟和使用外周血单核细胞的体外受精方法

有关胚胎移植延迟和使用外周血单核细胞的体外受精方法
【专利摘要】一种体外受精的方法，其中在从患者撷取卵子之后至少2个月，并且优选3个月到12个月，将胚胎植入到雌性患者的子宫中，以降低患者的自身免疫系统对胚胎的自身免疫排斥反应的影响，并且增加妊娠的可能性和成功率，并且其中在胚胎植入前，通过将外周血单核细胞(PBMC)引入到子宫中来对子宫中的子宫内膜进行准备以用于胚胎植入。将所述程序与冷冻保存技术相结合以保存患者的卵母细胞或IVF产生的胚胎。
【专利说明】有关胚胎移植延迟和使用外周血单核细胞的体外受精方法
[0001] 关于联邦资助研究或开发的声明
[0002] 本发明的开发没有使用任何联邦资金，并且是由下列发明人独自开发的。
[0003] 在先申请
[0004] 本申请要求于2012年10月18日提交的在先提交的美国专利申请号13/655, 257 的权益，所述专利申请要求于2011年11月23日提交的在先提交的美国临时专利申请号 61/629,651的权益，所述申请的主题以全文引用的方式并入本文。

【技术领域】
[0005] 本发明涉及体外受精领域，特别是对于由于自身免疫反应而使生育力降低的妇 女。本发明公开了一种通过将体外授精技术任选地与延长她们的卵母细胞或IVF-产生的 胚胎的冷冻保存相结合、并且与在胚胎移植前借助于外周血单核细胞（PBMC)对子宫中的 子宫内膜进行受控准备相结合来提高妊娠植入的植入率和稳定性的方法。
[0006] 发明背景
[0007] 据世界卫生组织报告，全世界每年有超过15%的妇女经历妊娠困难并且寻求医学 帮助（WH01997)，估计十年前全世界范围内有六千万到八千万的妇女。世界卫生组织把任意 的十二个月期间之后没有怀孕作为对不孕的一般定义。然而，许多夫妻在多年尝试自然受 孕未果之后才寻求医学帮助以试图怀孕。生育率的降低与医学和非医学因素有关。例如， 已表明妇女的年龄是怀孕所需要的平均时间的主要直接决定因素。已表明有1:1000的妇 女在30岁前发生卵巢功能早衰，1:250的妇女在35岁时发生卵巢功能早衰以及1:100的 妇女在40岁时发生卵巢功能早衰。因而，最高的出生率是在25岁到30岁的年龄组并且在 35岁之后迅速下降。不孕是当前年龄在25岁到45岁的人群所面对的最常见的健康问题。 因此，对能够延长健康妇女的生育力从而可能避开生育的年龄相关障碍的方法以及对于通 过自然方法不能受孕的妇女来说延长生育力的方法存在着极大的关注和需要。尽管不孕本 身可能不会威胁身体健康，但是它经常对妇女和夫妻的情感、心理以及精神健康产生严重 的影响。
[0008] 辅助生殖技术是涉及以在雌性受试者体内建立妊娠为目的对人卵子（卵母细胞 或卵细胞）和精子（精细胞）两者以及对胚胎进行体外处理的程序。这些程序包括但不限 于包括胚胎移植的体外受精（"IVF")、输卵管内配子移植、输卵管内受精卵移植、输卵管胚 胎移植、配子和胚胎冷冻保存和卵母细胞及胚胎捐献以及妊娠代孕。当其它辅助生殖技术 方法已经失败时，体外受精（"IVF"）已经发展成为不孕或低生育力的主要治疗方法。在 最基本的意义上，所述过程涉及从妇女体内取出雌性卵子和在体外用精子使所述卵子受精 ("体外")。所述过程涉及监测妇女的排卵过程、从所述妇女卵巢内移出多个卵子以及在实 验室内的流动介质中让精子使所述卵子受精。所述卵子一般是通过包括在超声指导下以针 穿刺阴道壁以达到卵巢的经阴道卵母细胞撷取从患者撷取的。通过这个针，可以对卵泡进 行抽吸，并且将卵泡液送到IVF实验室以鉴定和诊断卵细胞。通常从每个患者取出10到30 个卵子。随后将受精卵、（胚胎）、或一般多个胚胎移植到患者的子宫内以试图建立成功的 妊娠。例如：参见美国专利号7, 781，207。
[0009] 体外受精的首次开发是在20世纪70年代，迄今为止已经为很大一部分妇女提供 了有效形式的帮助。当前据报道，IVF占了欧洲所有活产的1.3% [Nygren等，2001]以及 澳大利亚所有活产的1. 7% [Hurst等，2001]。在美国，辅助生殖技术IVF周期从2006年开 始，已经有41，343例出生（54, 656名婴儿），稍多于那一年美国出生总数的1. 0 %。在2010 年，Robert Edwards因为体外受精的开发而被授予诺贝尔生理学和医学奖。接下来的步骤 是Carl Wood首创的，能够冷冻以及依次解冻和移植胚胎，这显著地提高了 IVF治疗的可行 性。
[0010] 根据大量的报道研究，先前的体外受精技术所获得的典型的成功妊娠率仍然相对 较低，在15%到25%的范围内。健康护理专业人员广泛公认，受精最重要的限制因素是胚 胎不能植入到子宫的内衬子宫内膜中。Blake等报道80%到85%的胚胎在移植到IVF患者 体内之后不能引起怀孕，导致胚胎巨大浪费。Simon等证明在正经历IVF周期的妇女中，在 60%的周期中检测到植入，因此在IVF的所有移植胚胎中，40%植入失败。
[0011] 在IVF中较低植入率的一个可能的原因是胚胎是在受精后两天4到8个细胞的阶 段移植到子宫内的。一个观点是使用培养5天到7天到达囊胚期的胚胎可能更好。所提到 的优势包括胚胎和子宫之间的同步性提高以及在较长培养期间能够选择更优质的胚胎。囊 胚移植还可以通过每次转移时允许选择更少数的高胜任性胚胎来帮助减少由IVF引起的 多个出生的数量。在IVF程序中，典型的是移植2个到5个胚胎到子宫中以增加植入的机 会，从而造成多胎妊娠的危险。因此，在美国，IVF治疗后出生的所有婴儿中有多于一半的 是由多胎妊娠引起。在一些情况下，在子宫内发生多个植入，并且随着胚胎在子宫内继续生 长和发育，患者没有能力承载多于一个胎儿或两个胎儿到足月。这时，需要做一个困难的 决定来终止这些妊娠并且从子宫中取出多余的一个或多个胎儿，这一过称为胚胎或胎儿减 少，这个程序是用来减少在多胎妊娠中存活胚胎或胎儿的数量。这种决定将使她们承受道 德上并且通常还有身体创伤两者的影响。由于前述的多个原因，仍然需要开发能够增加每 个胚胎的植入的可能性和确定性的实验室技术。
[0012] 在体外受精中称为自然周期的过程中，受精是在没有使用任何药物的情况下，通 过从处于妇女的自然月经周期的患者收集一个或多个自然选择的卵子来执行的。在改进的 自然周期IVF中，在妇女的自然周期中，使用2天到4天的生育药物以避免自发性排卵并且 使治疗更成功。"轻度IVF"（Mild IVF)是一种在妇女的自然周期中，在一个短的持续时间 内使用小剂量的卵巢刺激药物以意图产生2个到7个卵子并且产生健康胚胎的方法。这种 方法看起来可以减少妇女的并发症和副作用并且它是以优质为目的而不是以卵子和胚胎 的数量为目的。然而，这种方法得到是非常低的妊娠成功率。
[0013] 因此，通常也使用其它技术来增加妊娠机会。最常见的是使用卵巢过度刺激或超 数排卵以刺激卵巢产生多个卵子，随后从患者撷取。长期方案典型地包括通过延长使用促 性腺激素释放激素（GnRH)拮抗剂来下调（抑制或衰竭）垂体卵巢轴。一旦下调过程完成 (通常是在10天到14天之后），随后就开始进行卵巢过度刺激，典型地是使用促卵泡激素 (FSH)。使用这个方案的IVF周期在体外受精中被认为是常规的。短期方案跳过了下调程 序，并且由用来刺激卵巢发育多个卵泡的生育药物治疗方案组成。其它程序使用促性腺激 素释放激素促效剂（GnRHA)，其通过防止提前排卵来降低监测的需要，并且最近以来在使用 具有相似功能的促性腺激素释放激素拮抗剂（GnRH Ant)。在大多数的患者中，可注射的促 性腺激素（一般是FSH类似物）是在密切监测下使用的。这样的监测通常是检查患者的雌 二醇水平和借助于妇产科超声检查法来检查卵泡生长。典型地，需要约10天的注射。卵巢 刺激带来了过度刺激的危险，从而导致卵巢过度刺激综合症（OHSS)、腹胀、卵巢肿大以及呼 吸道、血液动力学和新陈代谢并发症等有可能威胁生命的并发症。此外，最近也已证明用于 刺激进行IVF治疗的患者排卵的生育药物造成子宫内所述胚胎植入接受度的降低并且导 致妊娠植入率降低[Ertzeid等2001]。
[0014] 雌性生育会受到生殖道功能障碍、神经内分泌系统功能障碍或免疫系统功能障碍 的影响。之所以一些雌性癌症患者冒着失去她们生育力的危险，是因为某些种类的化学疗 法治疗和某些类型的放射治疗可以使她们过早绝经，从而使她们绝育。在西欧和北美，在患 有不孕症的妇女中有10 %到20 %确定了内分泌功能障碍[Crosignani等2000]，而且，在 约10%到20%的病例中，不孕的原因仍然未知。据推测，身体的自身免疫反应可能是许多 这样的妇女不孕的原因。生殖自身免疫功能衰竭和缺陷可能与免疫系统的总体激活或特异 性针对卵巢抗原的免疫系统反应有关。
[0015] Haller-Kikkatalo解释了在人体内为了防止对在身体粘膜表面遭遇到的许多外 源性空气传播和食物抗原的自身保护性炎性反应，需要主动耐受机制。然而，耐受的最重 要方面是自身耐受，自身耐受防止身体对自身的组织发起免疫攻击-这是防止自身免疫反 应。自身免疫与免疫反应多个组分的不平衡和针对正常宿主抗原的自身抗体的产生有关。 雌性生育受到下丘脑-垂体-卵巢轴的一系列高度协调同步的相互作用调节。Gleicher 等最初描述了患有子宫内膜异位、不孕和自身抗体增加的妇女体内的生殖自身免疫功能衰 竭。尽管特定自身抗体对不孕致病机理的影响还没有一致的理解，但是自身免疫机制以及 多种自身抗体产生的增加与如卵巢功能早衰（P0F)、临床症状不明显的卵巢衰竭、复发性妊 娠失败、子宫内膜异位、多囊卵巢综合症（PC0S)、原因不明的不孕、IVF尝试反复失败以及 自发性流产等不孕症相关。一些研究已表明的生殖力降低中，特异性抗体并不是很重要并 且强调了免疫系统的总体活化的重要作用[N.Gleicher，2001 ;Dmowski等1995]。
[0016] 已有一组研究致力于开发用于解决免疫相关不孕的方法。第一个并且是最常使用 的方法是使用旨在抑制患者的自身免疫反应以允许妊娠植入的药物。例如，提出低剂量口 服强的松龙疗法用于提高复发性IVF失败的患者的妊娠率。然而，存在自相矛盾的数据， 指示某些抗体伤害胚胎，干扰植入过程或干扰胎盘的形成。这使得难以预测使用这些特定 免疫抑制性药物的疗法的成功。已经开发出使用乙酰水杨酸或肝素进行更温和的预处理 的方法。然而，尽管这一治疗已经普遍使用，但是使用这一方法的妊娠率仍保持相对较低 [Maghraby 等，2007]。
[0017] 最近引入了第二种方法。程序涉及借助于外周血单核细胞（PBMC)来对子宫内膜 和它的周围环境二者进行准备[Fujiwara等，Kosaka等，Yoshioka等]。外周血单核细胞 (PBMC)允许子宫的子宫内膜在胚胎植入前长到足够尺寸，并且还作为胚胎植入妇女的子宫 之后身体用来生长胚胎的基础材料。根据提倡者所言，PBMC已被确定为多能细胞。多能细 胞产生属于特定谱系或密切相关家族的细胞。它们显示出具有自然转化成任何种类的人组 织的能力。多能细胞是用于研究和治疗性处理的宝贵资源。最近在生物工程方面的进展十 分有望用于修复、建造、工程改造、再生、产生和生长组织。
[0018] 欧洲专利申请EP1581637公开了从哺乳动物外周血分离的单核细胞来源的成熟 干细胞以及制备、繁殖和使用这些干细胞的方法。美国专利7, 795, 018的发明人M. Kuwana 和H. Kodamo公开了单核细胞来源的多能细胞（M0MC)，所述多能细胞在诱导分化成内皮的 条件下可以通过培养基培养分化成内皮细胞。还公开了 一种用于制备M0MC的方法，所述方 法包括在纤连蛋白上体外培养PBMC和收集成纤维细胞样细胞。结果表明通过在内皮细胞 的维持培养基EBM-2培养基上培养7天，M0MC分化成内皮细胞，使细胞形态从纺锤形变成 具有多个突起的形态（参见美国专利号7, 795, 018)。因此本发明的研究者假设，PBMC的使 用在生殖过程中是有帮助的并且已将PBMC的使用并入本文所提供的体外受精的新颖技术 中。
[0019] 已经开发出一组多种植入药剂，其可以在IVF治疗中单独或组合应用，用于促进 妇女免疫系统对胚胎的接受。在这些药剂中，可溶性人白细胞抗原G(sHLA-G)看上去是有 希望的。已经认识到，s-HLA型分子在妊娠期间参与免疫反应和母体-胎儿免疫关系的调 节。Sher等在美国专利申请号10/829,081中公开了已经从汇集到一起的正发育的胚胎和 囊胚周围的培养基中分离出了 sHLA-G。他们观察到在培养物中各组胚胎周围的上清液中 sHLA-G的缺乏与IVF植入和妊娠率的明显降低有关。他们提出向用于培养胚胎和/或用于 通过胚胎移植将胚胎递送到子宫环境中的培养基中添加 sHLA-G将会提高那些胚胎的植入 和妊娠的可能性。尽管这种技术是有用的，但是这种方法和任何其它方法都不能单独解决 自身免疫性不孕的问题。本文提出将这些植入药剂与本文中本发明的方法结合使用来提高 妊娠植入的可能性和成功率。
[0020] 最后，工程改造的糖脂样分子构建体已显示能够修饰胚胎以及增强胚胎和靶组织 子宫内膜间的相互作用。在胚胎外表面上建立大分子基质和对所述基质装载用于刺激妊娠 植入的某些药剂就是根据提倡者所言将在将来的IVF治疗中具有非常广泛的应用的技术。 不仅通过这种建设性方法对胚胎进行修饰在体外培养系统中证明是成功的，而且动物还可 以产出由这些修饰胚胎得到的健康后代。然而，这种方法还没有在临床试验中进行测试并 且在当前的医疗工具中被认为仍然不够成熟。
[0021] 很多研究是针对用于提高成功妊娠和孩子出生的可能性的程序。尽管进行了相当 多的研究、技术改进和程序变化，但是利用IVF治疗的成功妊娠率仍然保持平均每周期约 15%到25%。本文的研究者已尝试通过提出一种关注于使妇女免疫系统和胚胎之间的相互 作用稳定的解决方案来应对胚胎植入的挑战和降低自身免疫系统反应的危险。
[0022] 发明概述
[0023] 在本发明最广泛的意义上，提供了一种用于雌性患者的体外受精的方法，所述方 法包括将有效量的包含外周血单核细胞的组合物引入到子宫中、以及在起始所述患者的体 外受精后的预定延迟之后移植至少一个胚胎到所述患者的子宫内的步骤；并且其中当与缺 少这些步骤的体外受精相比较时，所述方法使得成功植入妊娠的子宫中胚胎植入的可能性 增加。预定时间延迟是足以降低胚胎的自身免疫排斥反应或患者的自身免疫反应的危险的 时期。在胚胎移植前的预定时间延迟是患者的至少两个月经周期或两个排卵周期，不过所 述延迟将在患者与患者之间、动物物种、杂交体和变种之间发生变化。在人类患者中，优选 的预定时间延迟是3个月到12个月。
[0024] 本发明的另一个方面是，在时间延迟期快结束时，以使得子宫腔对胚胎的接受度 得到优化的方式对妇女的子宫内膜进行准备。根据本发明，这是通过子宫内注射外周血单 核细胞（PBMC)来完成的，最优选所述外周血单核细胞是获自所述患者。在本文中已观察 至IJ，这种方法使得成功妊娠植入和早期妊娠发育的可能性增加。将与胚胎的冷冻保存相结 合的植入时间延迟与妇女子宫内膜的PBMC准备二者进行组合是本发明的基础。
[0025] 更具体而言，公开了一种用于雌性患者的体外受精方法，所述方法包括以下步骤： (a)获得至少一个卵母细胞并且用精子使所述卵母细胞受精以形成受精卵；(b)在体外，使 所述受精卵发育到胚胎阶段；（c)冷冻保存所述胚胎；(d)等待足以降低所述患者的自身免 疫反应危险的预定时期；（e)在等待期结束之前2天到4天从所述患者的血液中提取第一 部分外周血单核细胞（PBMC) ; (f)在合适的培养基c中培养所述第一部分PBMC ; (g)在所述 等待期的最后一天从所述患者的血液中提取第二部分新鲜的PBMC ; (h)将所培养的第一部 分PBMC与第二部分新鲜的PBMC组合以获得包含新鲜的和培养的PBMC的组合物；（i)将所 述PBMC组合物引入到所述患者的子宫中；（j)将所述胚胎从冷冻保存状态解冻；以及（k) 将至少一个解冻的胚胎移植到所述患者的子宫中以实现妊娠。
[0026] 本发明的另外一个方面是包含PBMC的组合物、产生所述组合物的方法和所述 PBMC组合物在IVF治疗中以及用于生长和工程改造某些生物体靶组织（最优选雌性子宫的 子宫内膜）的应用。这种方法包括从患者的血液中提取PBMC;在4. 8%到6.0%二氧化碳 (C02)存在下，在36. 7°C到37. 3°C下，在含有⑴具有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的RPMI1640 培养基、（ii)人重组白蛋白以及（iii)能够提高PBMC增强组织生长的能力的促进剂（如 人绒毛膜促性腺激素（hCG))的培养基中繁殖一部分所提取的PBMC;以及将新鲜的和培养 的部分PBMC组合以得到所述组合物。
[0027] 发明详述
[0028] 通过定义整篇说明书中所使用和依赖的术语，将使本发明得到更清楚的理解。
[0029] "囊胚"是受精后5天或6天的胚胎，其具有内部细胞团、称为滋养外胚层的外部细 胞层、以及容纳胚胎整体所来源的内部细胞团的充满液体的囊胚腔。滋养外胚层是胎盘的 前体。囊胚被透明带环绕，透明带随后在囊胚"孵化"时脱落。由糖蛋白衣组成的透明带环 绕单细胞期到发育囊胚期的卵母细胞。在胚胎附着和植入之前，透明带通过包括蛋白水解 降解在内的多种机制从胚胎脱落。透明带最初的功能是防止多于一个精子进入卵母细胞， 接着是在胚胎到达子宫中之前防止胚胎过早粘附。
[0030] "低温IVF"指的是一种体外受精过程，在这个过程中，将胚胎冷冻保存，接着在胚 胎移植之前解冻，或者是先将用于受精的卵母细胞冷冻接着解冻的过程。"新鲜IVF"指的 是一种体外受精过程，其中胚胎在移植到子宫腔之前不进行冷冻，并且其中用于准备胚胎 的卵母细胞没有预先冷冻。
[0031] "胚胎"是在受精后八（8)周，胚胎期结束之前受精卵分裂的产物。胚胎的裂解期 存在于培养的前三天。"胚胎移植"是将一个或多个胚胎和/或囊胚放入子宫或输卵管的程 序。因此，术语"囊胚"和"胚胎"在本文中可以互换使用，用于定义术语"胚胎移植"的目 的，并且术语"胚胎移植"的应用如所描述和要求在本发明的范围和应用内。
[0032] "子宫内膜"指的是衬在子宫内表面的组织，是由一层上皮细胞组成。植入时，胚胎 首先与子宫内膜和细胞外基质（"粘液"）接触。上皮和下层基质细胞层在月经周期的激素 影响下周期性增厚，分泌粘液，并且从身体脱落。本文中术语"植入"指的是囊胚（在它的 透明带脱落之后）附着和随后穿透，一般是进入子宫内膜中。对子宫内膜内衬的附着可以 通过附着分子与子宫内膜的一种或多种组分（包括上皮细胞膜、粘液、粘液的粘液素组分 或外源引入子宫的组分）之间的相互作用而发生。
[0033] "受精"指的是通过精子穿透卵子并且它们的遗传物质组合，从而导致形成受精 卵。本文所用的"起始体外受精"指的是起始对雌性患者的受控排卵刺激，包括对妇女进行 刺激以诱导多个卵巢卵泡的发育以便在卵泡抽吸时获得多个卵母细胞的药物治疗。
[0034] "子宫"通常称之为娘胎，是包括人在内的大多数哺乳动物的主要雌性激素反应性 生殖性器官，其包括在一端的子宫颈，而另一端连接至一个或两个输卵管（取决于物种）。 子宫的生殖功能是接受从输卵管穿过子宫输卵管结合部的受精的卵子。它植入到子宫内膜 中，并且从专门出于营养目的而发育的血管中获取营养。受精的卵子变成胚胎，附着到子宫 壁，产生胎盘，并且在怀胎期间发育成胎儿直到分娩。如本文所用的术语"子宫"包括用于胚 胎移植目的的输卵管。在本文中术语"子宫"还可以和作为子宫体的腔体的术语"子宫腔" 互换使用。
[0035] 在IVF治疗中，妇女的免疫系统经历卵母细胞的刺激产生和递送。如果在卵母细 胞提取之后不久就将IVF产生的胚胎移植到子宫腔中，那么免疫系统可能会产生过度反 应。免疫系统的这种过度反应可能是身体不能植入胚胎并且导致自身免疫性不孕的原因。 在第一个方面，本发明提出延迟胚胎到子宫的引入以允许调整妇女的免疫系统并且重获它 的适当激素平衡。在时间延迟期间，雌性患者的卵母细胞或胚胎任选地通过冷冻保存加以 保存。
[0036] 适用于本发明的方法的时间延迟是针对各特定患者预定的时间量。对于人患者， 时间延迟可能是任意至少两个月或两个排卵期的时间长度。在优选的实施方案中，预定的 延迟是3个排卵周期，这典型地对应于3个月。大多数妇女经历每28天一个排卵周期。然 而应理解的是，因为排卵周期会随着妇女的不同而变化，所以在本发明IVF程序的治疗过 程中，延迟的实际天数将会随着各患者而变化。有可能雌性患者在3个月周期中将经历仅2 个排卵周期，或同样地，妇女在3个月周期中可能经历多于3个排卵周期。在一些情况下， 有可能患者在IVF治疗起始后的第一次排卵之后将不会经历任何另外的排卵。时间延迟还 可以持续多于3个月，但是优选在3个月到一年之内。本文已证明，预定时间延迟显著降低 了自身免疫性不孕的危险，并且因此显著地增加了成功妊娠的可能性。
[0037] 妊娠植入是使用由患者以外的一个雌性或多个雌性获得的卵母细胞或胚胎的实 施方案在本发明的范围内，所述卵母细胞或胚胎分别被称为"供体卵子"或"供体胚胎"。这 将在以下情况下发生：雌性患者不能排卵或不能产生可用的卵细胞、或通过使患者自己的 卵子受精而获得的胚胎被确定为对于胚胎移植来说具有过多缺陷、或基于形态学或遗传学 测试具有低存活可能性。
[0038] 在常用技术中，进行IVF的妇女需要注射激素以刺激卵泡发育和产生多个卵子。 这个刺激过程一般需要最初使用促性腺激素释放激素（GnRH)促效剂以抑制卵巢功能，从 而防止在所要的时间前排卵。最常使用的药物是柠檬酸克罗米芬CCIomid?),它是通过抑 制雌激素对下丘脑的负反馈来增加促性腺激素产生的选择性雌激素受体调节剂。卵母细胞 的最终成熟和释放的这种诱导经常是通过施用促黄体素来诱导的。用于这些注射的方案在 本领域是熟知的和确定的，并且用于本发明方法的任何实施方案。
[0039] 根据本发明的方法，通过本领域已知的技术从雌性患者收集或撷取未受精的卵 子。这些技术包括在卵巢卵泡中放入特殊设计的针头并且移出包含卵子的液体。一旦卵泡 液体从卵泡中移出，就可以对卵子进行显微镜检查和诊断以观察它们的形态学特征。美国 专利号4, 725, 579公开了一种用于获得用于IVF的卵母细胞的方法。在本文的方法中，从 患者中收集了 6个卵母细胞，但是优选获得4个。卵子接着放入培养箱中。使用常规受精 或胞浆内精子注射（ICSI)使卵子受精。所使用的受精的类型通常是基于雄性的精子参数 或其它因素如胚胎所需要的分析的类型。在常规受精中，将精子和卵子在培养碟中混合，并 且培养过夜以进行受精过程。在胞浆内精子注射中，将一个精子直接注射到卵子中。不管 是哪种技术，都在第二天观察卵子以评估细胞分裂。接着将现在称为胚胎的受精的卵子放 入到能促进生长和发育的特殊培养基中。
[0040] 根据本发明，在合适的培养基上培养IVF来源的卵母细胞或胚胎。可用的培养基 尝试提供细胞生长和发育的所需要的营养，并且寻求尽可能复制在正常情况下雌性生殖系 统中所存在的条件。在本文中使用在实验室程序中适用于体外支持细胞发育和生长的本 领域已知的培养基。实例包括但不限于人输卵管液（HTF) (Irvine Scientific)、N-2-羟 乙基哌嗪-Ν' -2-乙烧（HEPES)培养基（Irvine Scientific)、IVF_50(Scandanavian IVF Science)、 S2(Scandanavian IVF Science)、 G1 和 G2(Scandanavian IVF Science)、 UniIVF、ISM-l、BlastAssist、UTM 培养基（由 Origio A/S 以MEDICULT?培养基名义销 售）、改进的Whittens培养基、Wittinghams T6培养基、Ham' s F-10培养基、Earle' s溶 液。典型地提供如4-吗啉丙磺酸（MOPS)等缓冲系统。程序详细阐述于Trouson等（1980 和 1982)和 Quinn 等（1985)中。
[0041] 组织培养基通常是复杂的系统，包含一系列氨基酸、维生素和其它组分。一些培养 基由补充有碳水化合物能源如葡萄糖、丙酮酸盐和乳酸盐的平衡盐溶液组成。培养基还可 以补充有非必需氨基酸。培养基中的组分通常来源于非人和非动物来源，如重组微生物。希 望采取一定步骤来降低污染的可能性，如合适的纯化和本领域中实施的制备技术。除此之 夕卜，培养基可以包括抗生素，如青霉素或链霉素，以破坏在卵母细胞收集过程中可能引入到 培养基中的细菌。
[0042] 在雌性生殖系统内的体内发育中，在排卵过程中，卵母细胞在卵巢中产生并从卵 巢释放，并且经由输卵管向子宫行进。输卵管的液体包含多种能够向卵母细胞和它周围的 卵丘细胞提供营养的组分。一旦发生受精，则所产生的受精卵就沿输卵管前进并且在约3 天后进入子宫，从而进行内部转化并且经历改变的环境。随着受精卵/胚胎/囊胚的发育， 发生显著的发育变化。在子宫中围绕正在发育的胚胎的液体的组成适于那些变化的需要。 [0043] 和雌性生殖系统的自然环境相比较，没有单一的培养基被优化用于支持配子、受 精、受精卵成熟和胚胎发育。因此，已有多种特殊培养基可用于应付胚胎发育的不同阶段。 举例来说，特别配制了 G1和G2培养基以满足裂解期胚胎和8细胞至囊胚期发育的胚胎的 生理需求。Robertson等的美国专利号6, 605, 468公开了一种用于将早期阶段胚胎繁殖到 囊胚期的培养基。所述培养基包含有效量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)，以 增加发育成准备移植的囊胚的前囊胚胚胎的百分比。还公开了一种使早期阶段人胚胎生长 成准备移植的囊胚的方法。结果是更多比例的胚胎可以生长到囊胚期并且在IVF项目中用 于植入。已经使用培养技术进行了很多研究，其中将胚胎与饲养细胞共同培养[Menezo等， 1990 ;Planchot等，1995]。可以添加如细胞因子等其它刺激因子到培养基中以促进胚胎生 长，如白血病抑制因子（LIF)，参见例如Gough等的美国专利号5, 418, 159。白血病抑制因 子是在体外胚胎学领域中广泛使用的有效激素，如用于维持胚胎干细胞系和增加胚胎移植 的效率。
[0044] 在美国专利号6, 838, 235中，Gardner等提出在整个IVF过程中，不是将人生殖细 胞浸入单一培养基，而是随着不同IVF程序的执行，生殖细胞可以移动穿过一系列不同的 培养基。在一种制剂中，培养基经过特别配制以提供与雌性生殖道内发现的实体环境类似 并且有利于胚胎生长和发育的实体环境。本发明提出可以针对卵母细胞撷取和处理；卵母 细胞成熟；普通受精；卵母细胞、受精卵和胚胎检查以及活组织检查；胚胎发育到8细胞阶 段；胚胎发育到囊胚期；胚胎移植；以及冷冻保存提供特殊的培养基。
[0045] 除了使用通常可用于胚胎制备的培养基外，本发明方法还可以和其它技 术相结合以增加妊娠植入的可能性和成功率。已经开发出多种方法，在所述方法 中，先以一定方法对胚胎进行修饰，随后移植到子宫腔中。举例来说，欧洲专利申请 EP1765987(W02005121322A1)公开了通过添加一个或多个产生在血清学上等效于A或B抗 原红血球的细胞的单糖单元对细胞表面Η抗原进行酶促修饰。研究表明，在胚胎上存在透 明质酸受体，并且在母亲子宫的子宫内膜上也有透明质酸受体。透明质酸被认为所起的作 用类似于生物胶，其协助胚胎结合到子宫内膜并且因此支持植入。Carter等的美国专利号 8, 183, 214公开了一种将透明质酸定位到在IVF程序中使用的细胞或多细胞结构（胚胎） 表面的方法。本发明提供了稳定地并入细胞或胚胎的脂质双层或细胞膜从而改变它的生物 活性以改进某些特征（如生长特征、储存特征以及胚胎的存活和移植到子宫之后胚胎实施 的可能性）的碳水化合物-脂质结构。同样，Blake等的美国专利号7, 819, 796公开了用 来增强胚胎附着和植入的又一外源制备的构建体。利用具有插入到胚胎的细胞膜或透明带 中的脂质尾巴的糖脂对胚胎进行修饰，其中糖脂经过修饰以包含结合部分，其中结合部分 经过改适以使得能够结合附着分子。胚胎对子宫内膜的附着可以通过结合部分直接进行 或通过桥接分子进行。另一方法蛋白质涂抹是一种用于在没有基因转移的情况下修饰细 胞膜的外部抗原的方法。国际申请PCT/US98/15124(公布W099/05255)的说明书描述了 通过使胚胎与脂质修饰的粘附分子接触来增强实施，以改良胚胎的发育。美国专利申请号 13/067, 021描述了另一种有效定性和/或定量地改变细胞所表达的表面抗原的非转基因 方法。研究者公开的合成分子构建体并入细胞的脂质双层中，并且提出这样的插入在热力 学上是有利的。前述胚胎制备方法以及本领域中实施的其它方法涵盖在本发明的范围内。
[0046] 在传统的IVF过程中，胚胎在受精后两天每个胚胎处于四（4)细胞期时或在受精 后三天胚胎处于八（8)细胞期时移植到子宫腔。已认识使用培养达到5天到7天处于囊胚 期的胚胎可能是合乎需要的。本发明的IVF方法允许在胚胎/囊胚发育范围内的任何时间 进行胚胎移植。通过目视观察（如通过使用显微镜），当囊胚腔清楚可见并且所占体积大于 胚胎的50%时，认为囊胚和胚胎可以移植到子宫中。在体内环境中，这个阶段通常在受精之 后4天到5天达到，不久之后胚胎就穿过输卵管并且到达子宫。
[0047] 根据本发明的第二方面，本文发明人发现，在IVF治疗期间在胚胎移植之前，将包 含外周血单核细胞（PBMC)的组合物引入到雌性患者的子宫中明显地增加了胚胎在子宫的 子宫内膜中成功植入的可能性，由此产生可存活的妊娠。不欲受到科学理论束缚，认为PBMC 促进妇女子宫内膜和所移植胚胎的健康和活力。
[0048] PBMC是多能祖细胞，其具有从多种但是有限数量的谱系产生细胞的潜力。在一 系列长期细胞分裂结束时，形成胚胎的细胞终末分化并且被认为永久地限定于一种特定功 能。干细胞实验已经能够引导血液干细胞表现的像神经细胞或脑细胞-一种称为转分化的 过程。使用来自于胎儿、脐带或来源于体外受精卵子的胚胎组织在人材料的情况下产生了 道德的和法律的问题，引起了交叉感染的危险和/或可能因为它们可能被接受者的免疫系 统排斥而无效。可以说，使用PBMC产生较少的道德的和法律的问题，因为PBMC是从血液获 得并且不构成干细胞，然而仍然能够分化的细胞。
[0049] 如本文所用，外周血单核细胞（PBMC)是从受试者血液中提取的、收集的、得到的、 分离的或以其它方式获得的多能细胞。PBMC是血液细胞并且具有圆形细胞核。PBMC种类 包括但不限于淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞。这些血液细胞是生物体的免疫系统在抵抗 感染和运行涉及免疫系统的其它功能时所使用的关键组分。淋巴细胞群体由T细胞（CD4 和⑶8阳性，约75% )、B细胞以及NK细胞（总计约25% )组成。PBMC群体还包括嗜碱性 粒细胞和树突细胞。
[0050] PBMC可以通过本领域已知的常用方法从人外周血中分离。这些细胞可以使用 FICOLL? (瑞典 GE Healthcare Bio-Sciences AB LLC)从全血中提取，FICOLL? 是分离血液各层的亲水性多糖，它将把血液分成血清顶层，接着是PBMC层以及白细胞、 红细胞和多形核细胞（如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞）的底部部分。多形核细胞可 以通过溶解红血球而进一步分离。Ficoll?处F.ic〇U-Paque? (瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB LLC)的一部分。通常将Ficoll-Paque?放在锥形管的底部，并且血液 接着在Ficoll-Paque?.上方慢慢分层。在离心之后，在锥形管中可见若干层，从上到下为： 血浆和其它组分、含有PBMC的单核细胞层、Ficoll-Paque?，以及以球粒形式存在的红细 胞和粒细胞。这一分离允许容易地收集PBMC。一些红血球截留（存在红细胞和粒细胞） 可能存在于PBMC层或Ficoll-Paque?层中。在PBMC层中有时可能会发生大量血凝固。 通常将乙二胺四乙酸盐（EDTA))和肝素与FicoM-Paque?结合使用，以防止凝固。因为 Ficoll-Paque?分层是非常缓慢的过程，所以开发了有助于覆盖（这是最耗时的步骤）的 装置。一个这种产品是SepMate?-50 (加拿大StemCell Technology Inc.)，这是一种包含 在Ficoll-Paque'?和血液样本之间形成物理屏障的多孔插入物的专用管。这样允许将血液 样本快速吸移到插入物上，从而避免将它直接覆盖到Ficoll-Paque?上的需要。S印Mate? 插入物也减少了离心步骤的持续时间，并且在离心之后，包含血浆和PBMC的顶层可以倒入 单独的容器中。其它装置包括含有多孔高密度聚乙烯屏障或"玻璃料"的柱。这些产品允 许在不混合多糖和血液的情况下更快速地使血液分层。这种产品的一个实例是由Sigma Aldrich 销售的 "Accuspin System Histopaque-1077"。也有可能使 Ficoll-Paque?分离 系统包括在真空采血管血液采集管中。这些真空采血管增加了采集血液产品的便利性和 安全性，但成本比基础的真空采血管高得多。另一个这种产品Floaties?已证实可使用聚 合物珠粒或粒料的特殊混合物有效地将血液或细胞悬浮液覆盖在Ficoll?.上。这个产品便 宜，降低了研究人员对技术的依赖，并且实际上加速了覆盖过程。任何前述技术，包括在收 集、离析、提取、采集、分离、移出等领域实施或将会实施的其它技术、或从生物体、人或动物 的血液中获得PBMC的任何其它方式均涵盖在本发明的实施方案的范围内。
[0051] 在本发明的一个方面，本文提供一种培养PBMC细胞的方法。所述方法包括在纤 连蛋白涂布的平板上、在含有4. 8%至6. 0%二氧化碳（C02)的加湿氛围中、在36. 7°C到 37. 3°C范围内的温度下、以104/mL-107/mL的密度培养细胞。在所述方法的一个优选实施 方案中，PBMC的培养持续46小时到72小时范围内的时期。在最优选的实施方案中，PBMC 在纤连蛋白涂布的平板上在5. 0% C02的氛围中、在37. 1°C的温度下培养48小时。
[0052] 本文用于繁殖提取的PBMC的培养基是Rosewll Park Memorial Institue培养 基，通常称为RPMI培养基，可从多种来源得到。RPMI培养基通常用于细胞和组织培养。 RPMI1640培养基已常规用于无血清人淋巴细胞、骨髓细胞和杂交瘤细胞的生长。RPMI1640 培养基使用碳酸氢盐缓冲系统，并且在它的PH8制剂中，与大多数哺乳动物细胞培养基不 同。根据本发明方法的优选培养基使用包含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的RPMI1640培养基。
[0053] 根据本发明的另一个方面，将人重组白蛋白（HRA)添加到培养基中。HRA是以高浓 度存在于血浆中的众所周知的载体蛋白质，具有大约19天的循环半衰期。它的作用是将脂 肪酸运输到组织中、蛋白质稳定、结合金属离子到表面以及在血浆中的抗氧化作用。HRA可 以从很多供应商广泛获得，例如从Novozymes，Inc.或Sigma-Aldrich，LLC。在本发明的方 法中添加 HRA到培养基中充当改良PBMC生长的食品补充剂。
[0054] 在本发明的又一方面，将人绒毛膜促性腺激素（hCG)添加到本文的RPMI1640培养 基中。人绒毛膜促性腺激素（hCG)在人体内在妊娠期间由胎盘合胞体滋养层释放到母体循 环中。已表明hCG是免疫调节激素并且据报道施用hCG会增加妊娠成功率，并且hCG抗血 清抑制胎儿植入。hCG与某些受体（LHCG受体）相互作用，并且促进妊娠开始时黄体的维 持，使得它能够分泌激素黄体酮。黄体酮使子宫富含血管和毛细管内衬，以便它可以维持胚 胎和胎儿的生长。由于它的高负电荷，hCG可以排斥母亲的免疫细胞，从而在前三个月期间 保护胎儿。已假设，hCG可能是发展局部母亲免疫耐受的胎盘联系物。举例来说，hCG处理 的子宫内膜细胞诱导T细胞凋零增加（T细胞溶解）。这些结果表明，hCG是发展滋养层周 围免疫耐受的联系物，并且可以促进滋养层的侵入，已知这会促进子宫内膜中的胎儿发育。 [Kayisli等，2003]。还表明，hCG水平与妊娠妇女的晨吐严重性相关。本发明培养基中hCG 的最小浓度不少于5IU/mL。为了清楚起见，本文还发现，根据本发明方法制备的培养基中的 hCG充当提高PBMC增强组织生长（特别是在本发明的IVF过程中子宫内膜的生长）的能力 的促进剂。当用本发明的PBMC组合物处理时，培养的PBMC和/或培养的和新鲜的PBMC组 合物的组合具有改变患者子宫内膜组织的尺寸和接受性的能力。这将引起尺寸的增加，特 别是子宫内膜的厚度增加，以及植入时子宫内膜结合胚胎的能力增强。
[0055] 本发明的体外受精方法提供了通过上述培养技术获得的PBMC用于提高妊娠植入 的用途。从雌性患者获得卵母细胞之后，从患者的血液中提取一部分PBMC。这一部分PBMC 接着根据上文公开的方法，在合适的培养基中培养以获得所要量和品质的PBMC。在本文讨 论的预定等待或延迟时期之后，再从所述患者获得一部分血液并且从所述血液中提取一部 分新鲜的PBMC。或者，可以将首次从患者获得的血液批次分成含有PBMC的不同部分，对 其中的一部分或一些部分进行培养，并且一部分或一些部分保持新鲜。新鲜部分优选是在 预定等待时期的最后一天获得的。接着将一些或全部新鲜PCMB与一些或全部培养的部分 PBMC组合以获得包含新鲜的和培养的PBMC的组合物。在本发明的优选PBMC组合物中PBMC 的浓度在每一毫升组合物4百万个到5百万个细胞范围内；然而高达每毫升组合物8百万 个细胞的浓度在本发明的范围内是可行的。组合物可以以任何合意的方法混合或进一步掺 混或处理，以便在不损伤细胞的情况下组合PBMC。接着，典型地通过导管注射，将PBMC组合 物引入到患者的子宫腔中。根据本发明，在20小时到72小时之后，最优选24小时，将一个 或多个胚胎移植到子宫中用于植入，以实现妊娠。本文的研究者已证明，这种技术使身体能 够使用PBMC作为基础物质，以增加子宫内子宫内膜层的厚度，并且因此降低妊娠植入失败 的危险。
[0056] 重要的是，在本发明的IVF治疗的过程中，PBMC是从患者本身提取的。然而，在本 发明范围内设想，培养的部分PBMC可以来源于除正在进行体外胚胎移植的患者以外的个 体。在这种情况下，新鲜部分的PBMC优选是获自正在进行胚胎移植的患者，以应对患者的 自身免疫反应。
[0057] 对胚胎和患者生殖系统两者进行植入前诊断是本发明的又一方面。诊断患者时， 子宫内膜的厚度在胚胎移植时优选在9_到11_的范围内，子宫内膜厚度典型地可以用超 声测量。
[0058] 典型地也执行植入后诊断。在移植后两周使用例如血液b-hCG(人绒毛膜促性腺 激素）测试和本领域中通常已知的其它技术来进行确定一个或多个胚胎是否已植入到子 宫内膜中，即程序是否已得到成功的妊娠植入的测试。hCG在妊娠诊断和妊娠相关的条件 (如异位妊娠、自发性流产、21号染色体三体、葡萄胎妊娠和绒毛膜癌）中是必需的。在通过 检测血清或子宫中的hCG来诊断妊娠时存在"生化妊娠"事件，其不会发展成临床妊娠 。Zer 等的美国专利号4, 315, 908阐述了一种通过放射免疫测定来检测hCG的方法。0' Connor 等的美国专利号8, 163, 508提供一种用于通过检测样本中hCG的早期妊娠相关同种型的量 利用hCG方法来预测受试者妊娠的方法和试剂盒。这些诊断方法和其它的方法适用于本发 明的范围。
[0059] 临床医生力图鉴定出那些最有可能达成存活妊娠的胚胎用于移植。在某些实施方 案中，本发明提供对从患者撷取或体外制备的卵母细胞、囊胚或胚胎进行的形态学、遗传学 和动力学测试。诊断方法包括胚胎的显微镜物理分析，以鉴定那些根据胚胎的形态特征观 察和胚胎的遗传学测试看起来正常发育的胚胎。"植入前遗传学诊断"通过分析极体、卵裂 球或滋养外胚层来鉴定胚胎是否包含遗传的、结构的、和/或染色体的改变或异常。"植入 前遗传学筛检"涉及分析胚胎的极体、卵裂球或滋养外胚层以便检测非整倍体、突变和/或 DNA重排。用于诊断胚胎的至少3种基础辅助性孵化和活组织检查技术在本领域中是已知 的。这些技术包括使用特殊的显微手术刀或玻璃针在胚胎的透明带上以机械方式产生切 口；用如台式液等酸对一部分透明带进行化学消化；或使用激光去除透明带以辅助分离胚 胎。
[0060] 在优选的实施方案中，通过使用显微镜（例如，Nikon Eclipse TE2000-S显微镜） 对胚胎进行目视观察，胚胎在它被植入到子宫中之前，将同时显示某些确定的实体或形态 特征。根据以引用方式并入本文的Gardner等，1994的分类，囊胚成熟的状态确定为范围 II AB-VI AA，在Gardner等，1994的分类中，对滋养外胚层的细胞内物质和厚度进行分类。 水平VI AB表示囊胚成熟的最高状态，与从透明带孵化形成的囊胚一致。
[0061] 胚胎的遗传学诊断可以利用本领域已知的任何技术来进行，如传统的细菌人工染 色体（BAC)阵列CGH以及与其类似其它技术。也称为微芯片阵列、阵列或生物芯片的微阵 列已广泛用于基因表达和其它基因组研究，并且提供了优于BAC的技术优势。微阵列通常 是通过在表面上印刷或合成与基因组中的已知序列互补的核酸来制造的。生物体的全部基 因组或其部分可以通过使荧光标记的扩增DNA(脱氧核糖核酸）与阵列杂交来评估。以全 文引用方式并入本文的美国专利申请号12/587, 406公开了一种体外受精的方法，其中通 过全基因组扩增和多态性微阵列分析对IVF胚胎的全部24条染色体进行植入前遗传学诊 断。所述方法涉及对IVF胚胎进行活组织检查以去除一个或多个细胞并且从细胞中提取核 酸。接着执行基因组扩增允许收集胚胎的遗传学信息，以便基于获得的遗传学信息，预测胚 胎的遗传学常态。这种技术也使得确定胚胎的核型成为可能。在分析了胚胎之后，针对植 入子宫中的可能性对它们进行分级。在对胚胎进行遗传学分析的实施方案中，基于遗传学 预测，选择用于植入到子宫中的一个或多个合意胚胎。
[0062] 胚胎的动力学诊断是可用于选择用于胚胎移植的最合意、最健康胚胎的另一重要 程序。一个可用的工具是Primo Vision时间延迟胚胎监测系统（Vitrolife AB, G0teb〇rg, Sweden)。Prima Vision是当胚胎在培养箱中生长时，设计用来捕捉胚胎影像，在体外受精 周期中使用的照相机和计算机系统。胚胎在培养碟中发育时照相机获取的影像在实验室的 计算机屏幕上显示。计算机系统不仅提供胚胎影像，还提供有关它们的生长型态的信息。 这一信息允许胚胎学家和临床医师观察胚胎的健康发育，并且允许检测在生长早期阶段可 能发生的细胞分裂时序的任何问题。Primo Vison的另一个益处是它允许胚胎不从它们的 培养箱移除的情况下进行这些观察。这允许将胚胎保留在它们趋于更快生长的受控环境 中。根据本发明，选用于胚胎移植的最合意胚胎应显示以下动力学标准：从2细胞期到3细 胞期分裂的时间因子为5小时到12小时；在受精卵阶段之后35小时到40小时时应具有3 个细胞；在受精卵阶段之后48小时到56小时时具有5个细胞；到发育第三天开始时具有8 个细胞。所有细胞应优选具有相同的尺寸，或尽可能接近，并且破碎水平应该不多于5%到 10%。
[0063] 根据本发明，将由患者得到的卵母细胞或已发育到准备移植胚胎期的受精卵母细 胞保存一段时间，即抑制患者的自身免疫反应所需要的必需时期，直到患者的免疫系统充 分准备好以接受胚胎用于受孕。大多数患者希望在可能的情况下怀有她们自己的后代，并 且因此希望使用她们自己的卵母细胞或胚胎。因此，在大多数常见情况下，患者的卵母细胞 或胚胎需要保存。
[0064] 在某一部分患有不孕症的妇女中，妇女不能产生卵子或排卵，或经历排卵停止或 少排卵，因此提供从另一雌性个体中获得的供体卵母细胞或供体胚胎用于体外程序。因此 在本发明的某些实施方案的范围内预期，向患者植入不是来源于患者本身，而是来源于不 同个体的胚胎，因此，将供体卵母细胞或供体胚胎移植到患者用于植入。
[0065] 将来自一个物种的卵子或胚胎移植到不同于所述卵子或胚胎所来源的物种的实 施方案也在本发明的范围内。举例来说，将来自于驴的胚胎移植到马的子宫。
[0066] 然而，最常见的情况仍然是需要保存卵母细胞或胚胎，（一般是患者来源的那些， 但有可能来自另一来源）。可以通过使卵母细胞或胚胎经受低温条件，如缓慢冷却、快速冷 冻以及玻璃化来提供保存。不像精子，精子可以成功地冷冻并且使用多年，卵子含有大量的 水分，这使得冷冻更困难。当卵子被冷冻时，在卵子内可以形成冰晶。这些冰晶可以破坏细 胞的结构。为了帮助使冰晶的量减至最少，科学家在缓慢冷冻卵子时去除一些水分。美国 专利申请号10/777, 149描述了一种方法，包括离心卵母细胞或胚胎（例如狗、猫、猪、家畜、 小鼠、大鼠和猴的胚胎）以极化卵母细胞或胚胎外部的细胞质脂质，在脂质去极化之前引 起卵母细胞或胚胎的冷冻的低温保护剂存在下使卵母细胞或胚胎经受低温条件，接着低温 储存冷冻的卵母细胞或胚胎。然而，迄今为止，已发现不可能去除所有水分，并且因此不能 通过缓慢冷冻来防止细胞内和细胞外冰晶的形成。因此，一旦解冻，这些缓慢冷冻卵子的卵 母细胞受精、胚胎活力以及妊娠植入较低。
[0067] 已尝试使用低温保护剂来进行快速冷冻。低温保护剂是一种用于保护生物组织不 受因冰形成造成的冷冻破坏的物质。低温保护剂通过增加细胞内的溶质浓度来起作用。为 了在生物学上可用，低温保护剂必须容易穿透细胞并且对细胞无毒。常规低温保护剂是二 醇，如乙二醇、丙二醇和甘油；2-甲基-2, 4-戊二醇（MPD);二甲亚砜（DMS0)和蔗糖。甘油和 DMS0已被低温生物学家使用数十年，以减少在液氮中冷冻保存的精子和卵子的冰形成。已 发现，低温保护剂的混合物比单一药剂低温保护剂的毒性更低并且更有效。甲酰胺与DMS0、 丙二醇和胶体的混合物是多年来所有人工产生的低温保护剂中最有效的。许多低温保护剂 还通过在移走水分子时与生物分子形成氢键来起作用。在水溶液中，氢键合对于合适的蛋 白质和DNA功能来说是重要的。因此，当低温保护剂置换水分子时，生物材料保持它的天然 物理结构和功能，尽管它们不再浸入到含水环境中。
[0068] 最近，已应用玻璃化方法来保存卵母细胞和胚胎、生物组织、用于移植和人体冷冻 的器官，玻璃化方法是一种在没有冰晶形成的情况下冷冻和固化的方法。一些低温保护剂 通过降低溶液或材料的玻璃转变温度来起作用。以这样的方式，低温保护剂防止实际冷冻， 并且溶液在玻璃相中保持一定的柔性。尽管缓慢和快速冷冻都是可行的，但是根据本发明 的方法，玻璃化是优选的保存卵母细胞和胚胎的方法。在玻璃化期间，卵母细胞或胚胎冷冻 的速度足够快以至于冰晶没有时间形成。任何已知的玻璃化技术都可以在本发明的方法中 使用，用于保存和储存。通常，将卵母细胞或胚胎首先放置在具有较低浓度防冻剂的浴槽 中，同时还具有蔗糖以汲出卵母细胞或胚胎的水。接着，将卵母细胞放入到高浓度防冻剂浴 槽中少于1分钟，同时立即冷冻。在本发明方法的范围内可行的玻璃化方法的一个实例包 括将维持的胚胎放入37°c的MEDICULT?培养基中，接着将胚胎放入22°c到24°C的培 养基中，接着将所述培养基在专门的cryotop或cryoleaf载体中放入液氮中。
[0069] 根据本发明的IVF方法，当已确定患者的自身免疫系统重获激素平衡时，雌性患 者准备继续胚胎移植。在这时，终止卵子或IVF来源的胚胎的冷冻保存。将卵母细胞或胚胎 从防冻溶液中移出，并且解冻。一旦解冻，就通过上面描述的任何技术，通过将精子直接注 射到卵子中的辅助生殖技使未受精的卵子受精。胚胎的解冻通过以下方式进行：将胚胎从 液氮溶液中取出，放入到温度为约37°C的溶液中，在室温下洗涤，再次放入37°C的溶液中， 放入培养基中，接着放入保持在与雌性子宫腔内部温度相似的温度（36. 8°C到37. 2°C )下 的培养箱中5小时到24小时的时期，最优选在37. 1°C的温度下5小时到7小时。
[0070] 本发明方法的最后阶段是将一个或多个胚胎引入到患者体内以试图产生妊娠的 程序。这个程序称为"胚胎移植"并且包括将胚胎移植到子宫、子宫腔或输卵管中。胚胎移 植典型地包括使用小而软的导管并且在超声探针引导下，将所选胚胎穿过子宫颈放入到雌 性患者的子宫腔中。如以上所提供，根据本发明方法，优选在胚胎移植前至少24小时，通过 使用适用于递送的导管将PBMC组合物注射到子宫腔中来准备患者子宫的子宫内膜。胚胎 典型地维持在胚胎移植培养基中，例如Medicu丨t? UTM培养基，并且可以包含HAS、重组人 胰岛素、庆大霉素。
[0071] 本发明的另一方面是通过将组织相容性抗原如可溶性人白细胞抗原G(sHLA-G) 引入充当"敌友通讯器（friend-or-foe communicator) "以允许妇女的免疫系统对胚胎的 正面识别和接受的系统中来进一步促进妊娠植入。研究已在植入前胚胎上和在IVF研究期 间获得的周围培养基中检测出可溶性形式sHLA-G的前体HLA-G。这些结果表明，sHLA-G在 妊娠的早期阶段便已牵涉其中。还提出sHLA-G起胚胎品质指标作用的潜力[Menicucci等 1999]。一项研究表明，可以对植入前胚胎上清液中的sHLA-G水平进行定量，并且通过充当 可以在胚胎选择准则中与形态学测试结合使用，以增加成功植入可能性的适用胚胎品质指 标来表明妊娠可能性的阳性结果。在一个实施方案中，将s-HLA-G添加到胚胎移植培养基 中，其中在胚胎移植培养基中的优选浓度测量值在0. 175光学密度（0D)到0.350光学密度 范围内，其中0D指的是在400nm到450nm范围内的波长，更具体来说在405nm的波长下测 得的光学密度。通过测量光学密度来测定sHLA浓度的程序综述于很多出版物中。[参见例 如S. Marti等，2007]。将s-HLA-G添加到胚胎移植培养基中，并且接着将胚胎在所述培养 基中培养5分钟到20分钟，并且更优选约10分钟，随后立即将胚胎移植到子宫中。
[0072] 本发明的一个相关方面提供一种根据本发明中阐述的方案，通过使患者的靶组织 在PBMC组合物存在下生长来生长、修复、工程改造、恢复或以其它方式处理所述靶组织的 方法。通过在培养的PBMC存在下引入组织或通过使用培养的和新鲜的PBMC的组合PBMC 组合物进行培养来生长组织。体内和体外2种方法都涵盖在内。这种方法的一个实施方案 在于祀组织是雌性患者子宫的子宫内膜。然而，如Kuwana等的美国专利号7, 795, 018和 8, 216, 838所公开，PBMC被视为多能细胞，其非常适用于细胞移植，以供器官再生，包括骨、 软骨、骨骼肌、脂肪、心肌、血管、内皮和神经元。因此，包括本发明的培养的和新鲜的PBMC 二者组合的本发明的方法、培养基和组合物完全可以扩展超出IVF治疗和子宫内膜治疗的 边界，扩展到涉及能够用PBMC治疗的其它组织的生长、修复和工程改造的应用。
[0073] 本文中应当注意，本发明的概念和实践与人最相关，但是也适用于广泛多种动物 的胚胎植入。本发明不限于人的体外受精或使用通过采用PBMC组合物实现自身免疫系统 延迟的胚胎植入。举例来说，所述技术可以用于动物，如鼠类动物，包括褐鼠和家鼠；用于伴 侣动物，包括狗和猫；以及用于驯养家畜动物，如猪、马、驴、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼，以及 其它动物，以增加这些动物活产率。这种增加将在家畜行业具有显著的经济效益并且在科 学和医学研究和开发领域具有社会效益。
[0074] 虽然本发明在上文进行了大体定义，但是本领域的技术人员应了解，本发明不限 于此并且包括下列实施例提供进一步说明的实施方案。应理解的是，在不背离本发明的范 围的情况下，可在本领域范围内进行其它特定功能性修改。本发明的优势由以下实施例说 明，阐述所述实施例以说明本发明的方法和组合物，并且意欲所述实施例纯粹是本发明的 原则和应用的举例说明且不应认为对其范围构成限制。 实施例
[0075] 本发明由以下实施例说明。进行研究以检查和比较两种IVF程序。第一种程序称 为"新鲜IVF"（Fresh-IVF)方法，并且第二种程序称为"低温IVF"（Cryo-IVF)方法。进行 临床结果的统计学比较，以检查卵母细胞撷取后延迟妇女子宫腔的胚胎或囊胚植入对患有 不孕症的妇女的妊娠率的影响。术语"妊娠率"、"临床妊娠率"和"植入率"在本文中可以 互换使用，并且指的是每1〇〇个胚胎移植周期所表示的临床妊娠的数量。进一步研究在"新 鲜IVF"和"低温IVF"两个程序中子宫内外周血单核细胞（PMBC)施用对妊娠率的影响。
[0076] 受试者：总计检查一百八十（180)位患有不孕症的妇女。在本研究之前，每一个患 者先前已进行了 2次或者更多次的不成功"新鲜IVF"治疗，并且在参与文本的研究之前，至 少一次"低温IVF"治疗失败。将妇女分成两组，每组90位妇女。组1中妇女的平均年龄是 35. 5岁±3. 4岁。组2中患者的平均年龄是36. 5岁±5. 5岁。受试者准备如下：
[0077] IVF程序：对两个组中的患者应用采用GnRH (促性腺激素释放素）的标准IVF方案 以进行受控卵巢刺激。每位患者的卵巢刺激期在10天到12天之间。在经阴道穿刺时，测 得卵泡的平均尺寸是约18mm。对两组患者应用Gonal、Menopur、Choragon以维持黄体期。 一般来说，从每一位患者撷取10个到12个卵子。不少于80%的所得卵母细胞的成熟度足 以受精（如Gardner所测定，成熟MII阶段）。
[0078] 撷取卵母细胞后，将卵母细胞在C02浓度在5. 5%到5. 7%范围内的Universal IVF培养基（可从丹麦Origio A/S公司获得的MEDICULT? )中在36. 8°C到37. 1°C 的温度下培养。接着通过ICSI和标准IVF两种程序使卵母细胞受精。在考虑到精子指 数、患者年龄、先前经历阴性结果的IVF尝试的情况下选择所述技术。在标准IVF程序的 情况下，将精子添加到UnilVF培养基中的卵母细胞中。将发育到第二天的受精卵放入 ISM-1培养基中。在卵母细胞是通过经阴道穿刺获得的情况下，将卵母细胞放入UnilVF培 养基中。在通过ICSI程序受精后，将卵子立即放入ISM-1中。在裂生胚发育的前3天， 胚胎在MEDICULT? Universal IVF培养基中培养，并且在培养的第4天和第5天在 MEDICULT? BlastAssist培养基中培养，直到囊胚形成。使用MEDICULT? UTM培 养基进行胚胎移植。
[0079] 玻璃化：使用标准MEDICULT?方法，对发育第5天的囊胚或胚胎应用玻璃化。 将胚胎放入特殊溶液中以去除尽可能多的水。将胚胎在cryotop载体上放入液氮中。一个 载体上放置不多于2个胚胎。冷冻胚胎储存三（3)个月到1年的等待期。
[0080] PBMC制备：从每个患者提取外周血单核细胞（PBMC)。在"新鲜IVF"方案中在卵 母细胞撷取的当天或者在"低温IVF"方案中在胚胎移植到子宫中之前三天从患者获取第一 部分PBMC。最初，从每位患者获取10mL外周血。将全部量（10mL)的外周血与10mL具有 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的MEDICULT? RPMI1640培养基混合，形成总体积20mL的稀释 血液。之后使用淋巴细胞分离介质（密度梯度介质）从血液中分离PBMC。使7mL体积的 稀释血液在3mL密度梯度介质上分层。分层之后，在每分钟1500转的速度下进行分层血液 的离心持续30分钟到35分钟以得到PBMC。通过在4°C下以每分钟1600转的速度离心10 分钟，将如此获得的PBMC在RPMI中洗涤2次。经过洗涤的PBMC转移到培养基中。培养基 由含L谷氨酰胺和碳酸氢钠并且添加了人绒毛膜促性腺激素（hCG)和人重组白蛋白（来自 Sigma-Aldrich Co.，LLC)的RPMI1640培养基混合物组成。培养条件维持在5. 0% C02和 37°C。PBMC培养期是48小时到52小时。在48小时到52小时之后，从同一患者再获取一 部分全血。再用相同的方法提取PBMC。将第二批PBMC与培养的PBMC组合，并且将混合物 通过导管转移到患者的子宫腔中。所述程序在总计10分钟到15分钟内快速完成。每个患 者子宫内应用的总PCMB混合物的体积是在0. 2mL到0. 3mL范围内。
[0081] 胚胎解冻和移植：对于每个患者，选择2个囊胚用于胚胎移植。使用标准 MEDICULT? ^?案执行解冻。将胚胎从液氮中移出，并且放入37°C的溶液中，之后在室 温下用若干种溶液洗涤，再次放入37°C的溶液中，之后放入在温度为37. 1°C的温度下放入 培养箱中的培养基中6小时。在解冻之后，将胚胎在BlastAssist MEDICULT?.培养基 中培养3小时到4小时。之后将胚胎放入MEDICULT?UTM培养基中约15分钟。通过 Cook?医学超声控制导管，使用MEDICULT? UTM培养基执行胚胎移植。
[0082] IVF程序：2组妇女都进行IVF治疗。对组1进行的IVF程序不涉及使用PCMB ;而 组2的IVF程序的进行使用了 PBMC。每组妇女的治疗过程包括2个阶段：一个"新鲜IVF" 周期和一个"低温IVF"周期，如本文所描述。在胚胎移植当天，在两组患者中，测得子宫内 膜尺寸是9mm到11mm。在胚胎移植之后，与IVF治疗中的标准一样对所有患者施用黄体酮， 以便准备子宫内膜用于胚胎植入。通过在胚胎移植后两周进行血液b-hCG测试来确定胚胎 的植入。在胚胎移植后三周，通过超声检查来确定临床妊娠。
[0083] 两组妇女都经历一个移植2个囊胚的"新鲜IVF"周期。对每个患者进行妊娠测 试。当测试显示没有临床或生化妊娠时，表明失败。在"新鲜IVF"周期未能引起胚胎成功 植入的那些情况下，进行"低温IVF"周期，其中在阴性"新鲜IVF"周期（这是在从患者的 卵巢撷取卵母细胞的那天之后约三（3)个月测得的）之后2个月经周期到3个月经周期之 间的时间延迟期之后，将冷冻胚胎引入到患者的子宫腔中。
[0084] 组1妇女没有接受任何PCMB应用；组2妇女在等待期结束之后立即接受PBMC治 疗。在"新鲜IVF"周期中，在卵子撷取后48小时到52小时胚胎培养第二天时，将PBMC施 用到每个患者的子宫中。在"低温IVF"周期中，在胚胎移植之前约24小时，将PBMC施用到 子宫中。
[0085] 结果：进行没有PBMC的新鲜IVF治疗的那组患者得到22. 2%的植入率（在90例 ET之后，20例临床妊娠）。在"新鲜IVF"方法中使用PMBC使得植入率增加到31. 1 % (在 90例ET之后，28例临床妊娠）。在通过"低温IVF"治疗进行尝试（组1和组2均持续至 少3个月的时间延迟）的那组妇女中，没有子宫内应用PBMC的植入率是21. 4% (在70例 ET之后，15例临床妊娠），然而在应用PBMC之后，植入率几乎两倍高，为41.9% (在62例 ET之后，26例临床妊娠）。组1 (没有应用PBMC的90位患者）的总成功率是38. 9% (35 例临床妊娠）。组2 (应用了 PBMC的90位患者）的总成功率是60. 0% (54例临床妊娠）。 研究的临床结果呈示于下表1中。缩写"ET"表示"胚胎移植"。
[0086] 表1 :在有或没有对患者施用PBMC的情况下，"新鮮IVF"周期和"低淵IVF"周期 的棺入率。
[0087]

【权利要求】
1. 一种用于雌性患者的体外受精方法，所述方法包括以下步骤： (a) 将有效量的包含外周血单核细胞的组合物引入到子宫中，以及 (b) 在起始所述患者的所述体外受精后的预定延迟之后移植至少一个胚胎到所述患者 的所述子宫中；并且 其中当与缺少这些步骤的体外受精方法相比较时，所述方法使得成功起始妊娠的所述 子宫中所述胚胎植入的可能性增加。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述预定延迟是足以降低所述患者的自身免疫反应 危险的量的时间。
3. 根据权利要1所述的方法，其中在胚胎移植前的所述预定延迟至少是所述患者的两 个月经周期或两个排卵周期。
4. 如权利要求1所述的方法，其中所述外周血单核细胞是从所述患者的血液中获得。
5. 如权利要求1所述的方法，其中所述胚胎是在胚胎移植培养基内移植到所述子宫中 并且所述胚胎移植培养基包含起始促进剂。
6. 如权利要求5所述的方法，其中所述患者是人，所述起始促进剂是可溶性人白细胞 抗原G(sHLA-G)并且所述胚胎移植培养基中所述sHLA-G的浓度在0. 1750D到0. 3500D的 范围内，其中OD指的是在400nm到450nm范围内的波长下测量到的光学密度。
7. 如权利要求6所述的方法，其进一步包括临胚胎移植到所述子宫之前，将所述胚胎 在所述胚胎移植培养基中培养5分钟到20分钟范围内的时期。
8. -种用于雌性患者的体外受精方法，所述方法包括以下步骤： (a) 在所述患者中起始排卵以获得至少一个卵母细胞， (b) 从所述患者获得外周血单核细胞（PBMC)， (c) 在步骤（a)之后的预定延迟之后，将所述患者的PBMC引入到所述患者的子宫中，以 及 (d) 在步骤（c)之后，将所述胚胎引入所述雌性患者的所述子宫中以实现所述胚胎在 所述子宫中的植入。
9. 如权利要求8所述的方法，其中所述患者是人，所述胚胎是通过使在步骤（a)中从所 述患者获得的卵母细胞受精而获得的；步骤（c)的所述预定延迟等于所述患者的至少两个 月经周期或两个排卵周期；并且在步骤（d)中，在步骤（c)之后20小时到24小时，将所述 胚胎引入到所述患者的所述子宫中。
10. -种用于雌性患者的体外受精方法，所述方法包括以下步骤： (a) 起始体外受精， (b) 从所述患者的血液中获得第一部分外周血单核细胞（PBMC)， (c) 在合适的培养基中，培养所述第一部分PBMC, (d) 从所述患者的血液中获得第二部分新鲜的PBMC， (e) 将所述第一部分培养的PBMC与所述第二部分新鲜的PBMC组合， (f) 在胚胎移植前，将所述组合的PBMC引入到所述患者的所述子宫中，以及 (g) 将至少一个胚胎移植到所述患者的所述子宫中以实现妊娠。
11. 如权利要求11所述的方法，其中步骤（c)的所述合适的培养基包含具有L-谷氨酰 胺、碳酸氢钠、人重组白蛋白和人绒毛膜促性腺激素（hCG)的RPMI1640培养基；并且其中所 述hCG的浓度是每一毫升所述培养基不少于5IU。
12. -种用于雌性患者的体外受精方法，所述方法包括以下步骤： (a) 从所述患者中获得至少一个卵母细胞， (b) 用精子使所述卵母细胞受精以形成受精卵并且使所述受精卵在体外发育到胚胎 期， (c) 冷冻保存所述胚胎， (d) 从所述患者的血液中提取第一部分外周血单核细胞（PBMC)， (e) 在合适的培养基中，培养所述第一部分PBMC， (f) 等待足够降低所述患者的自身免疫反应危险的预定时期， (g) 在步骤（f)的所述等待期的最后一天，从所述患者的血液中提取第二部分新鲜的 PBMC, (h) 将所述培养的第一部分PBMC与所述新鲜的第二部分PBMC组合以获得包含新鲜的 和培养的PBMC的组合物， (i) 将所述PBMC组合物引入到所述患者的所述子宫中， (j) 将所述胚胎从冷冻保存状态解冻，以及 (k) 将至少一个解冻的胚胎移植到所述患者的所述子宫中以实现妊娠。
13. 如权利要求12所述的方法，其中所述预定时期是在步骤（a)开始时测得的，并且所 述时期是所述患者的至少两个月经周期或两个排卵周期。
14. 如权利要求12所述的方法，其中所述胚胎是通过玻璃化进行冷冻保存的。
15. 如权利要求12所述的方法，其进一步包括在胚胎移植前执行所述胚胎的遗传学测 试的步骤。
16. 如权利要求12所述的方法，其进一步包括在所述胚胎的体外发育的至少部分中， 诊断所述胚胎的动力学的步骤。
17. 如权利要求12所述的方法，其进一步包括在胚胎移植前，诊断所述胚胎的形态学 特征的步骤。
18. 如权利要求17所述的方法，其中当根据Gardner分类所确定，所述胚胎具有II AB-V AA范围内的囊胚成熟状态时，执行所述胚胎移植。
19. 如权利要求12所述的方法，其进一步包括测量所述患者的所述子宫的子宫内膜的 步骤，并且其中在胚胎移植时，所述子宫内膜的厚度是在9mm到11mm的范围内。
20. 如权利要求12所述的方法，其中所述第一部分PBMC是在4. 8%到6. 0%二氧化碳 (C02)存在下，在36. 7°C到37. 3°C下培养的，所述合适的培养基包含：（i) RPMI1640培养基、 L-谷氨酰胺、碳酸氢钠，（ii)人重组白蛋白以及（iii)人绒毛膜促性腺激素（hCG);并且其 中在所述培养基中所述hCG的最小浓度不少于5IU/mL。
21. 如权利要求12所述的方法，其中将所述第一部分PBMC培养48小时到72小时范围 内的时期。
22. 如权利要求12所述的方法，其中步骤（i)的所述组合物中PBMC的浓度是在每毫升 所述组合物中4百万到8百万个细胞的范围内。
23. 如权利要求12所述的方法，其中在步骤（i)中引入到所述子宫中的所述组合物的 体积是在〇. lmL到0. 3mL的范围内。
24. -种培养外周血单核细胞（PBMC)的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 提供一部分从患者血液中获得的PBMC，以及 (b) 在4. 8 %到6.0 %二氧化碳（C02)存在下，在36.7°C到37.3 °C下，使所述部分的 PBMC在培养基中繁殖，所述培养基包含：（i)具有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的RPMI1640培养 基，（ii)人重组白蛋白以及（iii)能够提高PBMC增强组织生长的能力的促进剂。
25. -种培养外周血单核细胞（PBMC)的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 从患者的血液中提取PBMC， (b) 在4. 8 %到6. 0 %二氧化碳（C02)存在下，在36. 7°C到37. 3°C下，使将一部分所提 取的PBMC在培养基中繁殖，所述培养基包含：（i)具有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的RPMI1640 培养基，（ii)人重组白蛋白以及（iii)能够提高PBMC增强组织生长的能力的促进剂， (c) 将步骤（a)中获得的新鲜PBMC与步骤（b)中获得的培养的部分PBMC组合以得到 包含新鲜的和培养的PBMC的组合物。
26. -种培养外周血单核细胞（PBMC)的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 提供一部分从患者的血液中获得的PBMC， (b) 在4. 8 %到6.0 %二氧化碳（C02)存在下，在36.7 °C到37.3°C下，使所述部分的 PBMC在培养基中繁殖，所述培养基包含：（i)具有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的RPMI1640培养 基，（ii)人重组白蛋白以及（iii)能够提高PBMC增强组织生长的能力的促进剂， (c) 从患者的血液中提取至少另外一部分新鲜的PBMC， (d) 将所述培养部分的PBMC与所述新鲜部分的PBMC组合以产生包含新鲜的和培养的 PBMC的组合物， (e) 任选地，重复步骤（b)持续足够获得所要量的培养PBMC的时期，以及 (f) 任选地，重复步骤（c)和步骤（d)。
27. 如权利要求26所述的方法，其中步骤（a)的所述患者不同于步骤（c)的所述患者。
28. 如权利要求26所述的方法，其中所述促进剂是在所述PBMC培养基中最小浓度为 5IU/mL的人绒毛膜促性腺激素。
29. -种修复、工程改造、恢复或治疗患者组织的方法，所述方法包括使所述组织在如 权利要求26所述的组合物存在下生长。
30. 如权利要求29所述的方法，其中所述组织是所述患者的子宫的子宫内膜。
31. 如权利要求1所述的方法，其中所述患者具有人、鼠类或家畜动物来源。
32. 如权利要求8所述的方法，其中所述胚胎是通过对从不同于雌性患者的动物的物 种、杂交体或变种的动物患者、物种、杂交体或变种获得的卵母细胞进行受精得到的。
【文档编号】C12N5/00GK104126004SQ201280067823
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2012年11月21日 优先权日:2011年11月23日
【发明者】A·费斯科沃, I·费斯科瓦, I·兹杨科瓦, S·兹尔科沃 申请人:迈渣德塔医学知识产权控股公司