一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白领域，特别提供了一种可特异性诱导已感染结核分枝杆菌的人群的外周血单个核细胞分泌相关细胞因子的蛋白。本发明还涉及该特异性蛋白的制备及使用。
【背景技术】
[0002]结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。全世界约有1/3的人口感染结核杆菌，每年新发结核病人约900万，每年约有300万人死于结核病，结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。根据世卫组织2014年10月22日出版的《2014年全球结核病报告》显示，2013年有900万人染上结核病，150万人死亡，约95%的结核病死亡发生在低收入和中等收入国家。中国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。结核病的传染主要是发生在病人未被发现并进行治疗之前，I名结核病患者平均可传染15人。因为在未发现患病前，新发病人没有采取任何预防手段，在与家庭成员、同事、同学等密切接触的过程中，接触者就容易被结核菌感染。
[0003]结核分枝杆菌是一种典型的胞内感染菌，人体对其免疫机制主要是以T细胞为主的细胞免疫。结核分枝杆菌侵入呼吸道后，原肺泡中未活化的树突状细胞(Dendriticcells, DC)抗菌活性弱，不能防止所吞.的结核分枝杆菌生长，但可将结核分枝杆菌吞.并带到他处，提呈抗原，使周围T淋巴细胞致敏，致敏的T淋巴细胞可产生多种细胞因子(INF-γ, IL-2、IL-6与TNF-α等)，这些细胞因子共同作用，杀死病灶中的结核分枝杆菌。根据这一免疫机制，通过对已感染结核分枝杆菌的患者及健康人血液中的细胞因子进行分析对比，发现感染结核分枝杆菌的患者其血液中INF- 丫、IL-2、IL-6、TNF-a的浓度明显升尚O
[0004]对于已经感染了结核分支杆菌的患者，当已经过免疫的特异性淋巴细胞在再次接触结核杆菌时，仍然会分泌相应的细胞因子。为研究结核分枝杆菌的致病机制及免疫机制，研究人员使用体外诱导PBMC产生结核相关细胞因子的方式。外周血是人类免疫系统研究的主要对象，其中的PBMC包括淋巴细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞)、单核细胞和树突状细胞。将已经感染了结核分枝杆菌的患者的外周血采出，提取其中的PBMC，并采用结核相关抗原对其进行刺激，PMBC即可对抗原发生免疫反应，产生相应的细胞因子。由于直接使用结核分枝杆菌进行实验具有相当的危险性，不利于进行大量研究，因此研究人员采用提取的结核分枝杆菌抗原蛋白进行研究实验。
[0005]结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)是从结核分枝杆菌培养滤液中获得的活性物质，其主要成分是蛋白质。pro可以刺激T细胞产生IFN-γ、IL-2等细胞因子，但对于已经经过卡介苗(BCG)免疫个体的样本，PPD同样能够刺激其提取出来的PBMC产生结核相关细胞因子，因此PPD的特异性较低，还需寻找特异性更好的刺激物。
【发明内容】
[0006]为了解决上述存在的问题，本发明通过大量的筛选实验，发现将抗原靶6ku蛋白(early secretary antigenic target 6ku protein，ESAT-6)、培养滤液蛋白(culturefiltrate protein,CFP-10)和Rvl985c蛋白通过特定的连接肽连接成融合蛋白，将该融合蛋白作为抗原可提高刺激的特异性。刺激感染了(/过)结核分枝杆菌的机体中具有免疫活性的PBMC，可显著增强PBMC产生结核相关细胞因子INF- γ、IL-2, IL-6与TNF- α等的能力，说明该融合蛋白作用更高效、敏感性更强、特异性更高、刺激效果好，有利于后续检测这些细胞因子的浓度来对结核病的致病及免疫预防机制进行进一步研究。
[0007]本发明的目的在于提供一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白。
[0008]本发明所采取的技术方案是:
一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白，该融合蛋白为CFP-10, ESAT-6和Rvl985c三个蛋白通过连接多肽按任意顺序连接而成的融合蛋白。
[0009]进一步的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rvl985c、CFP-10-连接肽-Rvl985c-连接肽-ESAT-6、ESAT6-连接肽-CFPlO-连接肽-Rvl985c 或者 ESAT6-连接肽 _Rvl985c -连接肽-CFP10。
[0010]进一步的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rvl985c。
[0011]进一步的，上述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0012]进一步的，上述融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rvl985c的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0013]进一步的，上述融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rvl985c的碱基序列如 SEQ ID NO:2 所示。
[0014]本发明的有益效果是:
I)本发明提供了一种可以刺激PBMC产生结核相关细胞因子的融合蛋白，与现有的刺激物相比，其作用更高效、敏感性更强、特异性更高、刺激效果好。在本发明融合蛋白的作用下，PBMC可高效产生结核杆菌抗原特异性的IFN- γ、IL-2, IL-6, TNF- α等结核相关因子，并且这一刺激诱导反应不受BCG (卡介苗)的干扰。
[0015]2)本发明选用的连接肽链为经过设计、筛选的可以显著提高融合蛋白活性的短肽。目前蛋白领域研究中常用的连接肽主要有(Gly4Ser)3，而本发明所采用的连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS，使得CFP-10-ESAT_6-Rvl985c融合蛋白中各自蛋白的空间构象及活性得到更好的实现，与混合肽、或其他融合蛋白相比，本发明融合蛋白的特异性及诱导效果具有明显的进步。本发明提供的融合蛋白对结核病致病及免疫预防机制的研究有重要意义，从而对结核病的控制具有积极的意义。
【附图说明】
[0016]图1为ELISA检测各组人PBMC在融合蛋白CFP-10-ESAT_6-Rvl985c作用下分泌细胞因子IL-2的情况；
图2为ELISP0T检测不同处理组中PBMC分泌IFN- γ的水平； 图3为细胞流式检测不同处理组中PBMC分泌TNF- α的水平；
图4为ELISPOT检测不同处理组中PBMC分泌IL-6的水平；
图5为ELISPOT检测各组PBMC分泌IFN- γ的水平；其中本发明融合蛋白的连接肽为GGGGSGGGSGGSGS ； (Gly4Ser)3_融合蛋白组的连接肽为(Gly4Ser) 3，其他序列均与本发明融合蛋白相冋；
图6为ELISPOT检测各组PBMC分泌IFN- γ的水平；实验组孔中含有本发明融合蛋白，阳性对照组中含有植物凝集素PHA ;
图7为ELISPOT检测不同处理组中PBMC分泌IFN- γ的水平。
【具体实施方式】
[0017]实施例l:CFP-10-ESAT-6-Rvl985c融合蛋白目的基因合成及原核表达载体的构建
I)分别用CFP10、ESAT-6和Rvl985c的上下游引物，用PCR分别扩增CFP-10、ESAT-6和Rvl985c的目的片段，使用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增并回收上述片段。
[0018]2)采用人工合成方式合成两种带有连接肽核苷酸序列的核苷酸链，其中一种核苷酸链(下文简称连接肽链I)两端分别包含CFP-10和ESAT-6部分序列，中间为连接肽的碱基序列(SEQ ID NO:4)，另一种核苷酸链(下文简称连接肽链2)两端分别包含ESAT-6和Rvl985c部分序列，中间也为连接肽的碱基序列(SEQ ID NO:4)。
[0019]3)取CFPlO DNA模板、连接肽链IDNA模板各I μ 1，用CFPlO的上游引物和连接肽链I的下游引物进行重叠PCR，获取CFP-10-连接肽融合基因；切胶回收融合片段作为模板，同时加入ESAT-6 DNA模板，再用CFPlO的上游引物和ESAT-6的下游引物进行重叠PCR，获取CFPlO-连接肽-ESAT-6融合基因；同理，用CFPlO的上游引物和连接肽链2的下游引物进行重叠PCR，获取CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽融合基因，切胶回收融合片段；最后用CFPlO的上游引物和Rvl985c的下游引物进行重叠PCR，获取CFPlO-连接肽-ESAT-6-连接肽Rvl985c融合基因(其核酸序列如SEQ ID NO:2所示)，切胶回收融合片段。
[0020]4)将CFPlO-连接肽-ESAT-6-连接肽Rvl985c融合基因片段连接到pMD19_T载体上。挑取单克隆，菌液PCR筛选阳性克隆，最后酶切鉴定。将表达载体pET-28a和上述阳性克隆的质粒进行双酶切(BamH I和Hind III)，目的基因乙醇沉淀回收，载体过柱回收。然后用T4 DNA Ligase对酶切的载体和目的片段进行连接，再转化到表达宿主大肠杆菌BL21感受态细胞中。挑取单克隆，菌液PCR鉴定与双酶切鉴定后获得的阳性菌落进行测序鉴定。选取鉴定正确的重组菌进行保种，备用。
[0021]实施例2:融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽_Rvl985c的诱导表达和纯化<