专利名称：一种外周血单核细胞的富集方法
技术领域：
本发明涉及一种外周血单核细胞的富集的方法。
背景技术：
大量的实验及临床研究表明，树突状细胞(DCs)治疗技术是一个非常具有前景的免疫治疗手段，尤其在肿瘤治疗方面。然而，它的临床实际应用由于受到了多方面因素影响而一直未能有大的突破，其中原因之一就是缺乏一种有效并易行的手段以提供在质量和数量上都能满足治疗需要的树突状细胞。由于外周血中树突状细胞数目有限，直接从外周血中富集治疗所需的树突状细胞不太现实。现有报道中的树突状细胞主要来源于在细胞因子诱导下外周血单核细胞(MCs) 的体外分化。因此，外周血单核细胞的富集和纯化过程是树突状细胞治疗实施的关键之一 (现有技术中MCs —般需要纯化到80%以上方可用于临床，保证治疗效果以及安全性)。虽然目前已有的技术手段如细胞贴壁吸附，免疫选择技术等都能达到一定的质量和数量上的要求，但它们大都需要配置昂贵的符合GMP条件的实验室设施和相对高的人员素质要求， 对临床应用存在着诸多的不便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外周血单核细胞富集方法，该方法可操作性强，耗时短，得到的产品产量、纯度较高，适用于临床的推广。本发明的技术方案如下
本发明的一种外周血单核细胞的富集方法，采用血细胞采集结合离心淘洗。其中血细胞采集采用的抗凝剂与全血的比率为1 :5 -1 :20。抗凝剂与全血的比率为1 :12-1 :13。血细胞采集过程所处理血量为自身血容量的2-4倍。血细胞采集过程中给予患者静脉钙剂的输注。如所述的富集方法得到的外周血单核细胞在肿瘤治疗中的应用。血细胞采集分离结合离心淘洗技术(Centrifugal Elutriation)的原理是基于细胞的物理性质而通过离心分离的，相比于抗原-抗体结合为原理的免疫选择技术而言所得到的细胞产物可能更加“纯朴”。我们的富集结果也表明，该方法得到的产品纯度较高，此外还具有临床适用性高、产量大的特点。相对于较为成熟和一致的由MCs到DCs的体外诱导分化方法而言，用于DCs治疗为目的的MCs的富集及纯化在业内尚无较为统一的方法。我们的应用结果表明，基于离心淘洗技术为基础的MCs富集及纯化方法是较为非常理想的方法，具体表现如下。1)临床适用性自动化设备的应用省去了许多对临床单位来说相对苛刻的要求，由于所有的采集及分离过程均在密闭体系中进行，无需附加的符合GMP条例的实验室设施。其次，时效性极高，MNC采集结束后的一个小时左右即可得到纯度高的MCs终产物。2)可靠的产品质量由于细胞淘洗技术的原理是基于细胞的物理性质而通过离心分离的，相比于抗原-抗体结合为原理的免疫选择技术而言所得到的细胞产物可能更加“纯朴”。3)充足的产量由于现代DCs治疗需要足够量的细胞以满足多次、系列注射的需要。
具体实施例方式1对象计划接受DCs治疗的癌症患者共17位，其中卵巢癌患者9例，乳腺癌患者和黑色素瘤患者各4例。2方法及原理首先采用血细胞分离机采集外周血单个核细胞(MNC)，然后利用自动化细胞淘洗设备将初步收集产物根据细胞大小及密度的不同分离成不同的细胞成分。 所有患者进行MNC采集前都经历过化疗或放疗，MNC采集时间与最后一个化疗或放疗的疗程间的间隔为至少2-3周。32. 1 MNC采集所有患者应用COBE SPECTRA血细胞分离机的AUTO PBSC程序 (美国CARIDIAN BCT公司)进行大处理量的MNC采集。大处理量的定义为处理血量至少为自身血容量的两倍，使用的抗凝剂ACD-A与全血的比率为1 :12到1 :13。采集过程中，所有患者给予静脉钙剂的输注以避免枸橼酸相关的副反应的发生。2.2细胞淘洗 MNC初级产物经细胞计数后将相关数据(包括白细胞数、红细胞数、总体积)输入Elutra Cell Separation System细胞淘洗机(美国CARIDIAN BCT公司产品)中。根据设备提示接通一次性使用的密闭管道，设备将自动运行并生成五个不同的成分同时分装于五个不同的密闭塑料袋中。2.3细胞计数收集患者MNC采集前、后外周血，MNC初级产物及五个不同成分的样本分别予以细胞计数。3数据统计所有数据以mean士s表示，外周血单核细胞的回收率计算=终产品中外周血单核细胞绝对数X 100%+MNC初产品中外周血单核细胞绝对数.
1 MNC的采集大处理量MNC采集平均耗时(237. 5士 19. 4)分钟；平均处理血量为(121 士 1384)毫升，相当于自身血容量的(3. 1 士0.4)倍；采集过程中平均血液流速为 (58. 4士 10)毫升/秒；A⑶-A平均用量为(972. 9士 123. 4)毫升。所有患者都能很好地耐受该采集过程。在MNC采集产物中，外周血单核细胞(MCs)平均含量达(32. 2士 13.0)%，绝对数达(3.2 士 1.0)X109，平均采集效率达(54. 9 士 15. 3)%。与采集前相比，采集后患者外周血白细胞计数平均降低(10. 1 士9.0 )%;血小板计数平均降低了(23. 2士 12. 7)%。2 单核细胞(MCs)的分离及富集全自动细胞淘洗过程平均用时为58士2分钟。血小板和血浆被首先分离并主要出现在成分1中；成分2主要为残余的红细胞和大量的淋巴细胞；这之后是两次的管道冲洗过程，分别收集于成分3和4，其中含有少量的淋巴细胞和外周血单核细胞；成分5则是我们的标的细胞。细胞计数结果显示，终产品中外周血单核细胞的平均产量及纯度分别达到了(2. 7士0.9) XlO9和(92. 1 士5. 5)%。以外周血单核细胞作为前体细胞在体外诱导生成树突状细胞并由此制成树突状细胞肿瘤疫苗是当今免疫生物治疗的主要手段。由本方法富集的外周血单核细胞除了在数量和纯度上可满足肿瘤治疗的需要外，更重要的是在其整个采集和纯化过程中，所有的操作都是在密闭的无菌体系中进行的，完全符合药品生产所要求的GMP条件，具有极大的实用价值。
权利要求
1.一种外周血单核细胞的富集方法，其特征在于所述富集方法采用血细胞采集结合离心淘洗。
2.根据权利要求1所述的外周血单核细胞的富集方法，其特征在于血细胞采集采用的抗凝剂与全血的比率为1 :5 -1 :20。
3.根据权利要求2所述的外周血单核细胞的富集方法，其特征在于抗凝剂与全血的比率为 1 :12-1 :13ο
4.根据权利要求1所述的外周血单核细胞的富集方法，其特征在于血细胞采集过程所处理血量为自身血容量的2-4倍。
5.根据权利要求1所述的外周血单核细胞的富集方法，其特征在于血细胞采集过程中给予患者静脉钙剂的输注。
6.一种如权利要求1-5中任一条所述的富集方法得到的外周血单核细胞在肿瘤治疗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种外周血单核细胞富集方法。该方法采用血细胞采集结合离心淘洗，相比于抗原-抗体结合为原理的免疫选择技术而言所得到的细胞产物可能更加“纯朴”。我们的富集结果也表明，该方法得到的产品纯度较高，此外还具有临床适用性高、产量大的特点。
文档编号C12N5/0786GK102352344SQ201110329478
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者林隽, 陈申 申请人:福建省闽东力捷迅药业有限公司