专利名称：用白介素-10激活外周血单核细胞的细胞溶解活性的制作方法
技术领域：
本发明涉及白介素-10的使用，白介素-10(IL-10)形式上是细胞因子合成抑制因子(CSIF)通过激发外周血单核细胞(PBMC)的细胞溶解活性而用于肿瘤疾病(癌症)的继承性免疫治疗上。
背景技术：
肿瘤治疗的免疫疗法是基于这样一个概念癌细胞由于某种还不太清楚的原因而逃脱了机体对于畸变或外源的细胞和分子的防御反应而且这种防御反应可以通过治疗的方法去激活以杀死或抑制癌细胞的生长，例如Klein曾讨论过这个问题(Immunology，Wiley-Interscience，1982 pp.623-648)。结果免疫效应子可直接或间接地抑制肿瘤的生长的最近的观察，使人们对这种治疗肿瘤的方法又重新产生了兴趣。[Heberman，Concepts Immunopath.196(1985)(natural killercells resist tumor growth)；Rosenberg et al.，Ann.Rev.Immunol.4681(1988)(use of IL-2-activated killer cellls to treat cancerRalf et al.，J.Exp.Med.167712(1988)(tumoricidal activity ofmacrophages stimulated by lymphokines)；Tepper et al.，Cell 57503(1989)(IL-4 has tumoricidal activity)；M.Cohen，“Lymphokines and Tumor Immunity”，pp.237-253，in S.Cohened.，Lymphokines and the Immune Response(CRC Press，Boca Raton，1990)]。
对肿瘤的免疫应答性受多种类型细胞的调控而且还包括T细胞和单核细胞来源的细胞因子的作用。一种临床有望的免疫治疗方法就是应用IL-2激活的杀伤细胞的所谓“继承性免疫疗法”。[Rosenberg，Supra Rosenberg，Sci.Am，pp.62-69(May 1990)]。尽管IL-2单独或与传统的化疗药物合用在治一些恶性肿瘤时很有效(例如肾细胞癌)，但伴随着有效剂量的IL-2的使用所带来的不利的毒副任用例如血管层渗漏和水肿，使有些人提出这种治疗方法的危险性已超过了它本身的好处。[Cotran et al.，J Immunol.1391882(1987)；Edwards et al.，Cancer Res.523425(1992)]。
人血管内皮细胞对IL-2的毒性特别敏感，表现为血管通透性增加(即血管渗漏综合症)和水肿。引起这种病理反应的可能因素中的一种是IL-2激活的T细胞和中性粒细胞在血管内皮的单细胞层上的粘附作用增强，这一点正如以前在体外所做的工作已证实的那样[Edwars et al.，Supra；Damle et al.，1381779(1987)]。
另一种对肿瘤疾病的免疫治疗的方法是免疫细胞的继承性转移。继承性免疫治疗的定义是向携带肿瘤的宿主体内转移或移植活性免疫药剂例如可直接或间接介导抗肿瘤作用的具有抗肿瘤活性的细胞。继承性免疫疗法是一个很有吸引力的治疗肿瘤疾病的方法。应该指出的是由于转入宿主体内的是有活性的免疫药剂，因此并不需要宿主完全的免疫活性。因此，通常由于患肿瘤而引起的免疫抑制在这种免疫疗法中并不是主要障碍。由于宿主的免疫活性是不要求的，而且实际上这种情况可能对免疫细胞的继承性转移是有益的，因此继承性免疫疗法可以很容易地与其它治疗方法如化疗和放疗相结合使用。而且与其它治疗方法不同的是，这种疗法可能不会产生免疫抑制作用。
肿瘤病人在化疗或放疗中势必引起免疫损伤，而且将常使激活免疫反应有效的效应子细胞外周血单核细胞(PBMCs)的供应减少。在低的效应子细胞∶靶细胞比例条件下就表现效果的治疗方法因而将对这样一些病人是特别有利的。
对肿瘤的免疫反应性受多种类型细胞的调控而且包括T细胞和单核细胞来源的细胞因子的作用。使用重组的人细胞因子的继承性免疫疗法随着IL-2的使用[Rosenkey et al.，J.Immol 1381779(1985)]已涉及到外周血单核细胞(PBMCs)的体外激活[Philips et al.，J.Clin.Oncd.51933(1987)；Perussia，Carr，Opion Immunol.349(1991)]外周血单核细胞的体外处理产生活化的淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和激活的自然杀伤细胞(NK)，二者对各种不同的肿瘤细胞都有细胞溶解活性。
已有报道重组的人白介素-5(IL-5)[Nagasawa et al.，Cell.Immunol.133317(1991)]，白介素-7(IL-7)[Stotter and Lotze，Arch.Surgery1261525(1991)]和白介素-12(IL-12)[Gately et al.，J.Immunol.147874(1991)]可以激活人外周血单核细胞的细胞溶解活性。白介素-10(IL-10)最初的报道是在小鼠中由特异的T辅助细胞亚类作为一种细胞因子抑制因子分泌，可调节小鼠细胞毒T细胞的分化[Chen and Zlotnik，J.Immunol 147528(1991)]。而且还发现用从转染有人IL-10 cDNA的COS细胞回收的上清液孵育人外周血单核细胞，经孵育的细胞在体外可溶解肿瘤靶细胞。对IL-10起反应溶解潜力增强的T细胞，经鉴定为一个CD56+表型，说明是自然杀伤(NK)细胞。
有些情况下，IL-4对由IL-2所诱导的LAK活性产生起相反的作用。[Nagler et al.，J.Immunol.1412349(1988)]。例如，如果人外周血单核细胞同时与IL-2和IL-4一起孵育，对LAK敏感的靶细胞溶胞作用大大减少[Spits et al.，J.Immunol.14129(1988)]。但如果PBMCs在加入IL-4之前用补有IL-2的培养基预先培养3天，细胞的溶解活性都是增加的[Spits et al.，Supra]。而且如果在最初的孵育混合物中包含α-干扰素(α-IFN)或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，则IL-4对I-2对驱动的细胞溶解活性的阻断作用即可减弱[Swisher et al.，Cell.Immunol.128450(1990)]。
Kedar等[Cancer Immunol.Immunother.3563(1992)]最近指出在治疗小鼠肿瘤模型MCA-105肉瘤和M10g癌中，IL-2和α-IFN的顺序使用是一个有效的免疫治疗方式。这项研究的最主要的发现是细胞因子的顺序使用比细胞因子的同时使用有更高的效果。
继承性免疫疗法作为一种治疗人类各种疾病尤其是肿瘤(癌症)的治疗模式，它的可行性和效果已在Rosenberg的美国专利；专利号为No.4,690,915中有描述。然而如上指明那样，需要有实施这样继承性免疫疗法但又不象单独使用IL-2时那样的毒性的方法。还需要有一种在低的效应子细胞∶靶细胞比例的条件下就很有效的治疗方式。
发明概述本发明满足了这些要求，提供了IL-10单独使用或与IL-2合用再和/或与α-IFN合用以增加PBMCs特别是LAK和NK细胞细胞溶解活性的方法。
更特别的是，本发明提供了一个给癌症患者使用激活PBMCs的IL-10的有效剂量并使癌症消退的方法。激活的PBMCs的优选实施方案是同时或后续使用IL-10。
在一种实施方案中是IL-10和IL-2合用，IL-2的量足以增加LAK细胞的活性，但在单独使用时又不会引起毒副作用。
另一种实施方案是IL-10和足以增加LAK细胞活性量的α-IFN合用。
还有一种实施方案是IL-10和(a)足以增加LAK细胞的活性但在单独使用时又不引起毒副作用剂量的IL-2一起使用和(b)足以增加LAK细胞活性量的α-IFN一起使用。
本发明还进一步提供了用内源性白介素-4(IL-4)拮抗阻断由IL-2引起的细胞毒作用的方法，包括给这类病人使用有效剂量的IL-10。
本发明进一步提供了包括IL-10与IL-2和/或α-IFN合用的药剂组合物以及药剂学上可接受的载体。
在前述的方法和组合物中优选使用人的IL-10、IL-2和α-IFN，更优选的是使用重组的人IL-10、IL-2，和α-IFN。
发明详述此处引用的所有参考文献都是经全盘考虑被编入做为参考的。
本发明是一个改进应用IL-2诱导NK和LAK细胞的细胞溶解活性的现有技术的方法。本发明通过完全去除IL-2或大大降低所必需使用的IL-2的剂量而极大的减轻了在使用IL-2的方法中所产生的典型的毒副作用。
除非特别定义，这儿所用的各种术语和用于指导本发明在本领域中所熟知的术语具有相同的含义。
象这儿所用的术语“继承性免疫疗法”含义即是给病人移植激活的有功能的免疫细胞的治疗法。优选实施方案是，这些细胞中包括来源于正在接受治疗的病人的LAK和NK细胞。
这儿所用的术语“消退”的含义是和本领域的普通测定一样，指一个或多个肿瘤体积上的可测量的减小。
这儿所用的“Interleukin-10”或“IL-10”定义是一种蛋白(a)该蛋白是一种氨基酸序列成熟的IL-10的蛋白(例如缺少分泌的前导序列)在1992年7月20日提交的专利U.S.Patent Application Serial No.07/917,806上已公开的那样，而这份专利是与International Application No.WO91/00349是相同的；(b)具有和天然IL-10相同的生物学活性。对于本发明的目的来说，不管是糖基化的IL-10(例如在真核细胞例如CHO细胞中生产的)还是没有糖基化的(例如化学合成的或在大肠杆菌中生产的)都是等效的，而且可以相互替换使用。而且还包括突变蛋白质和其它类似物，包括BCRF1蛋白(非洲淋巴细胞病毒病毒性IL-10)，该蛋白也有IL-10的生物学活性。
适用于本发明用途的IL-10有不同的来源。例如，可从激活的分泌该蛋白培养基中分离获得。另外，IL-10或它的活性片段可按本领域中熟知的标准技术进行化学合成。请见Mettifield，Science 233341(1986)和Atherton et al.，(Solid Phase)A Practical Approach，1989，I.R.L.Press，Oxford。
获得该蛋白或多肽的优选方案是用分离得到的编码IL-10多肽的核酸通过重组技术得到。介绍一般的分子生物学方法的书有例如Sambrook et al.，(Molecular Cloning)(A Laboratory Maunal)，Cold Spring Harbor，New York，2d ed.，1989，和By Ausbel et al.，(eds)(Current Protocolsin Molecular Biology)，Green/Woley，New York(1987 and periodicsupplements)。正确的序列可用标准的技术从基因组文库或者cDNA文库得到。也可使用聚合酶链式反应(PCR)得到。参见，例如(PCR Protocols)(AGuide to Methods and Application)，1990，Innis et al.，(Ed.)Academic Press.New York。
文库是用从合适的细胞中得到的核酸构建的，请见例如在InternationalAppliction Publiction No.WO91/00349中即公开了重组体IL-10的制作方法。有用的基因序列可以查到，例如在各种序列的数据库中例如GenBank.andBMPL or ncleic acid and PIR and Swiss-Prot for protein，c/oIntelligenetics，Mountain View，California，or the Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，Wisconsin上述内容在此引入做为参考。
包含有编码人IL-10的序列的克隆已收藏在American Type CultureCollection(ATCC)，Rockville，Martyland，登记号为68191 and 68192号。带有编码IL-10序列的其他克隆的鉴定可用核酸杂交法或有对于表达载体所编码的蛋白可用免疫的方法检测。根据公开的Intemational Application Publication No.WO91/00349中所保存的序列所得到的寡核苷酸探针是特别有用的，寡核苷酸探针序列也可从其它物种相关基因的保守区中制备。另一选择，基于IL-10氨基酸序列而得的变性探针也可使用。
可用标准的方法转化原核、哺乳动物、酵母或昆虫的细胞系，使它们表达大量的该种多肽。对表达和克隆都适用的大肠杆菌代表菌株包括W3110(ATCCBi，27325)，X1776(ATCC No.31244)，X2282 RR1(ATCCMp/31343)，代表的哺乳动物细胞株包括COS-7细胞株，小鼠L细胞和CHP细胞。See Sambrook(1989)and Ausubel et al.，1987 Supplement)。
可用各种表达载体表达编码IL-10的DNA。在原核或真核细胞中表达重组蛋白的常用载体都可使用。优选的载体包括，由Okayama et al.，Mol Cell.Biol.3280(1983)；and Takebe et al.，Mol.Cell.Biol.8466(1988)所描述的PCD各载体。其它以SV40为基础的载体包括那些已在Kaufmen et al.，Mol.Cell.Biol.21304(1982)and U.S.Patent No.4,675,285中公开的载体这些以SV40为基础的载体对猴COS-7细胞(ATCCNo.CRL 1651)和其它哺乳动物细胞例如小鼠L细胞特别有用。还请看Douwelset al.，(1989 and Supplements)(Cloning Vectors)(A laboratoryManual)Elsevier，New York。
IL-10可在转化或转染的酵母或哺乳动物细胞中以可溶的形式例如以分泌物产品的形式生产。多肽即可按本领域中熟知的标准方法纯化。例如纯化步骤包括硫酸铵沉淀，离子交换层析，凝胶过滤、电泳、亲和层析等。请看，Methods inEnzymology Purificaition Principles and Practiles(Springet-Vertag，NewYork，1982)。
另一种选择是，IL-10也可以不溶的例如聚合体或包涵体的形式生产。这种形式的IL-10可用本领域中熟知的标准步骤进行纯化。纯化步骤的例子中纯化步骤有通过离心将包涵体与已崩解的宿主细胞分离开，然后用促溶剂和还原剂溶解包涵体使多肽形成有生物活性的构型。这些步骤的细节请见例如Winklet et al.，Biochemistry，254041(1986)；Winklet et al.，Bio/Technology 39923(1985)；Kiths et al.，and U.S，.Patent No.4,569,790。
用于转染宿主细胞的核苷酸序列可按标准技术加以修饰以使IL-10或其片段具有各种所期望的特性。这类修饰使IL-10与天然产生的序列在一级结构水平上小同例如用氨基酸的插入，替换、缺失和融合。这些修饰方式可结合使用而获得最终的经修饰的蛋白质链。
氨基酸序列的突变体可以按不同的目标包括增加血清半衰期，方便纯化和制备，增进治疗的效果，减轻在治疗中的毒副作用的发生及严重程度而进行制备。氨基酸顺序的突变体都是自然界中不存在的而是预先确定的突变体，虽然其它一些突变体可以是翻译后突变体例如糖基化的突变体或与聚乙二醇(PEQ)结合的蛋白等等。这些突变体只要它还保留有IL-10的生物学活性，就可在本发明中使用。
对编码多肽的序列的修饰可用各种技术例如位点导向的突变[Gillman等，Gene 881(1987)]容易地完成。多数修饰体都要在一个合适的分析体系中对所期望的特征通过常规的筛选进行评价。例如在International ApplicationPublication No.WO91/00349中即介绍了几种评价IL-10活性的体外检测方法。
最好是，治疗人类的疾病应用人的IL-10，虽然，病毒的IL-10或从其他哺乳类来的IL-10也有可能被使用。更优选的方案是使用重组体的人IL-10。人和小鼠IL-10的制备在International Application WO91/00349中已有介绍。非洲淋巴细胞瘤病毒的IL-10(BCRF1蛋白)的克隆和表达已由Moore etal.，在Science 2481230(1990)上公开。重组体人IL-10已成为一种商品可以购买到，例如从Prepro.Tech，Inc.，Rocky Hill，NJ购买。
适于本发明治疗方法的各个体包括任何肿瘤病人都能从激活PBMC细胞溶解活性上，特别是LAK和NK细胞活性激活中获益。代表性的癌症患者已有介绍，例如Rosenberg，Supra在专利和(Scientific American)上的文章已作介绍。本发明的治疗方案也适用于预先处理以使内源性IL-4水平升高的个体，这样以使IL-4阻断了IL-2对细胞溶解活性的激活。在这类个体中优选的治疗方案是在使用IL-2之前先用IL-10预处理。
本发明中所介绍的用以制备IL-10的标准方法和技术也可用于制备IL-2和α-IFN，本发明中使用的IL-2和α-IFN也可从商品途径得到(例如IL-2可从Cetus，Corporation，Emeryville，CA，α-IFN可从Schenng，Corp.，Keniluorth，NJ获得)。
除了IL-10和减低水平的IL-2合用再和/或α-IFN一起按此处介绍的方法使用之外，PBMCs(优选方案是从要接受治疗的病人用标准方法得到)的体外激活以及这些细胞的使用基本上按上面提到的Rosenberg的文献进行。所使用的激活的PBMCs的数量范围为106～1012个。尽管不是必需的，但优选的实施方案是如同这里所述的IL-10与这样激活的细胞一起使用或后续使用。
在一种实施方案中是先用IL-10预处理激活PBMCs[例如在4ng/ml(100单位/ml)或40ng/ml人IL-10的存在下在37℃培养大约3天]，然后，洗涤细胞去除游离的IL-10再加入低浓度的IL-2(典型的是约2units/m)。
这里所用的由1L-10单独或与其他细胞因子一起使用以激活细胞溶解细胞的优选使用方案是用静脉注射。这个也可以用如下方法实行，例如通过中心静脉导管进入大的外周静脉或由经皮的导管进入肝动脉。
IL-10通常以药剂组合物的形式使用，该组合物包括药剂载体和单用的有效剂量的IL-10或者是IL-10与IL-2和/或α-IFN一起合用。药剂载体可以是适于将药剂传输给患者的任何可配伍的非毒性物质，对这类药物的不经过消化道使用途径的有用组合物已有很深的了解，例子参见Remingtons PhermaceuticalScience 15th Ed.(Mack Publishing Company Easton，PA，1980)。另外，本发明的组合物可通过植入的或注射的药物传输系统进入患者体内。例如，Urquhert et al.，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.2499(1984)；Leuis(Ed.)(Controlled Release of Pesticides and Pharmeceuticals)(PlenumPress，NJ.1981)U.S.Patent No.3,270,960；等等。
细胞因子的使用可通过任何熟知的使用途径，包括静脉、腹膜及皮下给药。静脉给药是最优选的使用途径。
当通过非消化道方式给药时，组合物都结合药剂载体做成统一的单位剂量的可注射形式(溶液、悬液、乳液)。这类载体的例子有生理盐水，Ringer’s液，葡萄糖液和Hank’s液。非水相的载体可用非挥发油和油酸乙酯。优选载体是5％葡萄糖/盐溶液。载体可包含一些少量的添加物以增加等渗性和化学稳定性例如缓冲剂和防腐剂等。IL-10的优选的统一形式是基本上不含聚合体和其它蛋白的纯的形式，浓度约为5-20μg/ml。
本发明的组合物也可用标准的基因治疗技术传输而导入患者体内，包括如直接的DNA组织注射，使用重组病毒载体以及转染细胞的植入，见例如，Rosenberg，J.Clin.Oncol.10180(1992)。
此处所介绍的一种或多种治疗药剂的合用可以同时使用(与IL-10一起使用)或者可以顺序使用。优选方案是IL-10先于IL-2使用。α-IFN可以与IL-10和/或IL-2一起或后续使用。所有的药剂在患者体内有足够的浓度以使在治疗上有效而使肿瘤消退。
这里所用的“有效剂量”术语的含义指IL-10的量足以减少或阻止继承性免疫疗法中的副作用，同时又能提高LAK和NK细胞的细胞溶解活性。对一个特殊的患者来说所需的细胞因子的有效剂量可根据象被治疗的肿瘤的类型和状态，患者的整体健康状况、所用的治疗方法、副作用的严重程度以及同时正在使用的其它药物的量和种类等一类因素而不同。
“足以增加LAK细胞的活性”的细胞因子的量这里的定义指用Daudi细胞为细胞溶解评价体系，需要的细胞量所产生的细胞溶解活性至少比IL-10单独使用时可增加25％，优选方案是增加到至少50％，最优选方案是增加到至少约100％。
优选方案是IL-10给药用它最大的极限用量，从10～108单位每天每公斤体重。同样地IL-2和α-IFN给药也可使用最大极限用量(例如对IL-2静脉给药所用量为每8小时105单位每公斤体重，用50ml 0.4％生理盐水和5％白蛋白作为载体；α-IFN的剂量为静脉给药每8小时106U每公斤体重，用0.9％生理盐水加5％白蛋白作为载体)。前面已说过，所用剂量是由临床医师根据每个患者个体所能承受的最大极限而作下降调整。
本发明的方法也可与传统的治疗癌症的方法一起使用，例如放疗和化疗使用传统的化疗药物象长春碱、铂类化合物及5-氟尿嘧啶的化疗。
单独使用IL-10或与其它细胞因子合用处理人外周血单核细胞引发对人肿瘤靶细胞的细胞溶解活性增强。因为免疫治疗的效率在很大程度上依赖于肿瘤的负担程度，所以在大块的主要肿瘤块被切除之后使用这里所述的治疗方法将会特别有益。通常在手术位点发生的炎症反应也许会对治疗效果有好处。
实施例下面的非限定性实例将用于本发明的说明。
IL-10对人外周血单核细胞细胞溶解活性的影响研究了IL-10对人外周血单核细胞体外细胞溶解活性的影响。结果概述如下I.IL-10刺激人外周血单核细胞中淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和自然杀伤细胞(NK)的活性。大鼠抗IL-10单克隆抗体可中和IL-10驱动的细胞溶解活性。
2.来源于CHO和大肠杆菌表达系统的IL-10在刺激LAK和NK细胞活性中表现出相同的浓度反应模式，因此在生物学意义上是等效的。
3.PBMCs用IL-10和低剂量IL-2处理所表现出的LAK细胞活性比任何一种细胞因子单独使时的活性都强。
4.PBMCs用IL-10预处理2天后再加入IL-2细胞的溶解活性增加。
5.IL-4抑制IL-2诱导的LAK细胞活性，而IL-10拮抗这种抑制作用。
6.IL-10加上IL-2在低的效应子细胞∶靶细胞比的情况下产生增加的LAK细胞对细胞的溶解活性。
除了对PBMCs所观察到的影响之外还发现在有IL-10的条件下培养的内皮细胞对外源因子(即γ-IFN和TFN-α)的应答不受影响，而在含有IL-2的培养基中培养的内皮细胞却由于IL-2的毒性而不起反应。
材料与方法重组的人细胞因子和抗IL-10的抗体重组的人IL-10是用标准方法生产的(来自大肠杆菌和CHO二者)。用MC-9细胞的增殖检测用标准方法纯化后产品的比活性分别是4.1×107E.coli和2.1×107(CHO)Units/mg[Thompson-Sripes et al.，J.Exp.Med.173507(1991)]，如是按定义为大约4ng基本上纯一的IL-10约含有100单位的生物学活性。
从Palo Alto.CA DNAX分子生物学研究所John Abrams博士处得到一个定名为19F1的大鼠抗人IL-10的单克隆抗体。
人外周血单核细胞的分离(PBMCs)
外周血是用肝素或EDTA作为抗凝剂用静脉穿刺术从健康的成人供体得到的。PBMCs是用二步法分离的，包括葡聚糖沉淀和按着在FICOLL PAQUE”上以1250rpm(转/分)离心30分钟。收集主要包括淋巴细胞和单核细胞的界面带，并用含10％胎牛血清的RPMI培养基(完全培养基)清洗至少二次(JRHBiosciences)。
细胞毒性检测Daudi(对LAK敏感)和K562(对NK敏感)靶细胞分别从美国典型培养物保藏中心(American Type Tissue Collection)分别以登记号(underaccession Nos.)CCL 213和CCL 243得到。用Spits等所介绍[J.Immunol14129(1989)]方法把Daudi和K562细胞标记以51Cr。PBMCs经过培养之后，进行收集，洗二次，即可在一个51Cr释放检测体系中作为效应子细胞(Spits etal.，Supra)。用5×10351Cr标记的靶细胞与不同量的效应子细胞(E/T＝20∶1，5∶1，2∶1)以100μl体积在V型底的96孔板中混合。96孔板以1000rpm离心5分钟后在饱和湿度5％的CO2气中培养4小时，培养4小时后用500xg离心5分钟。上清用SKATRON(Skatron Instruments)收集器收集，并用γ计数器(LKB-Pharmacia)计数。用51Cr标记的靶细胞与1％SDS通过孵育来测定总的溶胞作用。数据代表三次测定的平均值。
溶胞作用的百分比按下式计算 人PBMCs与细胞因子孵育a.IL-10单独孵育除非有特别说明，上述所分离的PBMCs以每毫升1×106细胞的浓度在补加有IL-10或人的IL-10(CHO)含有10％胎牛血清RPMI-1640培养基中37℃培育3天。按上所述确定细胞溶解活性。
b.用IL-10和IL-2同时孵育把PBMCs用4ng/ml的IL-10与或不与IL-2(Genzyme)(2或20U/ml)一起在37℃孵育3天。
c.用IL-10和IL-2的顺序培育把PBMCs用4ng/ml的IL-10在完全培养基中孵育2天。加入IL-2使最终浓度为2U/ml或20U/ml。培养过夜后，测定LAK和NK细胞的细胞溶解活性。
抗IL-10的单克隆抗体对IL-10激活LAK和NK细胞的影响在2μg/ml的抗IL-10单克隆抗体(19F1)或同型对照(大鼠IgG2a)存在的条件下，把PBMCs与40ng/ml IL-10孵育3天。
IL-10对人外周血单核细胞中淋巴因子激活的杀伤细胞和自然杀伤细胞细胞溶解活性的影响根据所用的肿瘤靶细胞从操作上即可区分LAK和NK细胞的细胞溶解活性。来源于Burkitt’s淋巴瘤的Daudi细胞是经典的检测激活的LAK细胞细胞溶解活性的靶细胞。来源于人红白血病K562细胞株的细胞被用做检测NK细胞细胞溶解活性的特异靶细胞。在这些实验中把人的PBMCs用不同浓度的IL-10处理3天再用上面介绍的标准的51Cr的释放测定法确定细胞溶解活性。
LAK的活性结果如表1所示，其中标准差在平均值下面给出。
表1IL-10对淋巴因子激活的PBMCs的激发作用(用溶胞作用的％表示a)IL-10浓度(ng/ml)b供体 0 0.040.4 4 40 1001 0 4.2518.344 26.2 67.52 0 5.5 7.2 10 31.5 27.63 1817.729.239.1 29.7 55.14 0 8.8 10.222.2 35.8 35.95 4.6 8.1 15.620.6 20.1 12.16 14.6 19.740.754.4 42.9 43.4平均值 6.2 10.620.2c31.7c31.0c40.2c±3.3 ±2.6 ±5.1 ±6.8 ±3.2 ±8.0a.51Cr标记的Daudi靶细胞的溶胞作用百分比是在20∶1的效应子细胞靶细胞比和用标准的铬释放测定法得到的。数据代表三次测定的平均值。
b.在测定细胞溶解活性之前，把从正常供体得到的人PBMCs先用IL-10处理3天。
c.用Student’s-t检验确定，IL-10处理组和培养基对照组间有显著性差异，P≤0.05。
表1的资料显示IL-10对从6个人供体中得到的PBMCs中LAK活性的影响。尽管6个供体之间差异显著，但在所有6个供体中IL-10诱发的细胞溶解能力的增加都表现出对IL-10的浓度依赖。统计学活性显著的IL-10的浓度是0.4ng/ml或更大(P≤0.05)。而且还观察到供体PBMCs显示了一个细胞溶解活性的基础水准(即在无细胞因子条件中)，在所有测定过的效应子细胞与靶细胞比中5％或更少的细胞溶解活性对IL-10反应最灵敏(资料未附上)
对其它肿瘤靶细胞，包括人肾细胞瘤株，两个不同的人黑色素瘤株和人结肠癌细胞株也得到类似的结果。Rosenberg也曾用过人肾细胞瘤和黑色素瘤细胞，而且还对带有这样肿瘤的病人用IL-2做过体内的继承性免疫治疗。在所有的实验中，靶细胞的溶细胞作用百分比都依赖IL-10浓度。
在另外的一些实验中发现IL-10单用或与IL-2合用也可引发增加对U937(人组织细胞瘤)；SW620(人结肠癌)和SKBR3细胞(人乳腺癌)的细胞溶解活性。在用HS294T细胞(人黑色素瘤)做靶细胞时的实验中IL-10在所测试过的剂量中不表现引发反应。
基础水平的NK的细胞溶解活性(即在不含细胞因子的条件下对K562靶细胞的溶胞作用有比LAK细胞基础水平的溶胞活性要高的趋势。NK的活性可用细胞因子如IL-2进一步增强[Perussia，Supra；Philips and Lanier J.Exp.Med164814(1986)]。
在测定LAK细胞活性的平行实验中，用上述6个相同的供体测定了IL-10对PBMCs中NK细胞活性的影响。结果如表2所示，其中标准差在平均值下面给出。
表2IL-10对PBMCs中NK活性的激发(以溶胞作用的％表示a)IL-10的浓度(ng/ml)b供体 0 0.04 0.4 4 40 1001 22.2 30.6 25.257.2 51.549.72 20.4 24.7 31.356.7 65.671.53 61.4 55.6 37.981.1 80.081.54 13.8 25.2 23.237.5 52.254.25 13.0 19.9 20.225.1 23.520.36 15.9 25.3 45.466.6 43.756.1平均值 24.4 30.2 30.554.0c52.75c55.5c±7.5±5.2 ±3.9 ±8.2 ±7.8 ±8.5a.51Cr标记的Daudi靶细胞的溶胞作用百分比是在效应子细胞与靶细胞比为20∶1的条件下用标准的铬释放测定法得到。数据是三次实验的平均值。
b.从正常供体来源的人PBMCs在测定细胞溶解活性之前先用IL-10处理3天。
c.用Student’s-t检验确定IL-10处理组和培养基对照组间有显著性差异，P≤0.05。
从表2可明显看到IL-10诱导从供体来源的PBMCs中NK细胞介导的细胞毒作用的增强有显著的剂量依赖性。IL-10的浓度为4ng/ml或更高时的溶胞作用在统计学上明显增加。如同在LAK活性测定中一样，IL-10对NK细胞活性的影响依供体不同而有差异。
IL-2与IL-10对内皮细胞的影响的比较设计了在IL-10存在下测定内皮细胞单细胞层的存活能力的实验。内皮细胞在IL-10存在条件下培养时对外源细胞因子(γ-IFN和TFN-α)的应答没有减弱，而平行实验以相同单位剂量的IL-2用培育相同的时间由于IL-2的毒性而使细胞对外源细胞因子的应答能力丧失。
抗IL-10的单克隆抗体对IL-10激活LAK和NK细胞作用的影响如表3和表4所示表示的平均值带有标准差，在2μg/ml IL-10的单克隆抗体19F1存在下，分别地用40ng/ml的IL-10对LAK和NK细胞的细胞溶解活性的激活减少3倍(P≤0.05)。用2μg/ml的大鼠IgG2a同型对照抗体代替抗IL-10的单克隆抗体所产生细胞的溶解活性水平所得的结果与那些单独用40ng/ml IL-10所得结果在统计学上是不能得出区别的。
表3抗IL-10的单克隆抗体对IL-10诱导的淋巴因子激活的杀伤细胞的细胞溶解活性的抑制(以溶胞作用％表示)a培养条件b供体 培养基 40ng/ml IL-10 IL-10IL-10+19F1 +IgG2a1 5.6 23.5 15.7 28.22 4.7 21.3 11.0 17.53 5.4 42.5 0.0 35.84 2.1 42.0 12.8 26.55 4.7 19.1 0.0 11.65平均值 4.5±0.629.6±5.3 7.9c±3.3 23.9±4.3a.51Cr标记的Daudi靶细胞的溶胞作用百分比是在20∶1效应子细胞∶靶细胞比和用标准的铬释放法测定的。数据是三次测定的平均值。
b.从正常供体得到的人外周血单核细胞在测细胞溶解活性之前先在2mg/ml19F1(抗人IL-10)或大鼠IgG2a(同型对照)存在的条件下用40ng/ml IL-10处理3天。
c.用Student’s-t检验IL-10单独处理和在抗IL-10单克隆抗体存在处理之间结果有显著性差异，P≤0.05。
表4抗IL-10单克隆抗体对IL-10诱导的自然杀伤细胞活性的中和作用(以溶胞作用％表示a)培养条件b供体 培养基40ng/ml IL-10 IL-10IL-10 +19F1 +IgG2a1 21.1 38.320.6 27.22 28.0 71.022.2 53.23 22.2 51.5 0.0 70.54 18.0 25.412.3 20.85 23.2 53.254.5 84.9平均值22.5±1.6 47.9±7.6 19.1c±6.6 51.3±12.7a.[51Cr]标记的Daudi靶细胞溶胞作用百分比是在20∶1效应子细胞∶靶细胞比和用标准的铬释放法测定的。数据是三次测定的平均值。
b.从正常供体得到的人外周血单核细胞在测细胞溶解活性之前先在2mg/ml19F1(抗人IL-10)或大鼠IgG2a(同型对照)存在的条件下用40ng/ml IL-10处理3天。
c.用Student’s-t检验IL-10单独处理和在抗IL-10单克隆抗体存在处理之间结果有显著性差异，P≤0.05。
IL-10和其它细胞因子合用所诱导的细胞溶解活性a.IL-10和IL-2同时孵育人PBMCs在5∶1的效应子细胞∶靶细胞比和IL-10存在下用次极限激活浓度的IL-2(2或20U/ml)孵育，结果如表5所示，平均值下是标准差。
表5在人外周血单核细胞中用IL-10和IL-2同时孵育所诱导的淋巴因子激活的细胞溶解活性(以溶胞作用％表示a)培养条件b供体 培养基 2U IL-2 4ng IL-10IL-10 20U IL-2+IL-210.0 3.3 3.715.9 24.622.6 7.6 3.823.5 41.036.1 5.0 13.317.7 11.443.350.1 51.668.7 80.052.4 9.4 12.829.3 45.769.928.9 16.038.8 67.1平均值 4.117.4 16.832.3 44.9c±1.42 ±7.6 ±7.2 ±7.2 ±10.4a.[51Cr]标记的Daudi靶细胞的溶胞作用百分比是在5∶1的效应子细胞∶靶细胞比和用标准的铬释放法测定的。数据是三次测定的平均值。
b.把从正常供体来源的人外周血单核细胞在测细胞溶解活性之前先用4ng/mlIL-10和2U/ml IL-2处理3天。
c.用Student’s-t检验测定供体PBMCs用IL-10和IL-2处理与用20U/mlIL-2单处理比较，细胞溶解活性之间无显著性差异，P≤0.05。
如表5所示，2U/ml和4ng/ml IL-10合用使LAK活性(效应子细胞∶靶细胞＝5∶1)有额外的增加。这种活性水平比二种中任一种细胞因子单用时的活性都显著增高。达到了10倍高的IL-2浓度所产生的活性水平。用Studeat’s-t检验测得结果在统计学上是有意义的，P≤0.05。
b.IL-10和α-IFN同时孵育用PBMCs IL-10和α-IFN共同孵育对Daudi细胞的细胞溶解活性表现为相似的额外的增加，但对NK靶细胞却不是。结果如表6所示，标准差在平均值下面给出。
表6在人外周血单核细胞中用IL-10和α-IFN合用对淋巴因子激活的杀伤细胞活性的诱导(以溶胞作用％表示a)培养条件b供体 培养基 α-IFN IL-10 IL-10+α-IFN14.4 7.917.835.721.011.715.432.031.612.3 5.526.4平均值 2.310.612.631.4±1.0 ±1.4±3.8 ±2.7a.[51Cr]标记的Daudi靶细胞的溶胞作用百分比是在10∶1的效应子细胞∶靶细胞比和用标准的铬释放法测定的。数据是三次测定的平均值。
b.从正常供体制备的人外周血单核细胞在测定细胞溶解活性之前先用4ng/mlIL-10和100U/ml α-IFN处理3天。
c.用Student’s-t检验测知，IL-10和α-IFN合用与IL-10或α-IFN单独使用比较诱导供体PBMCs的细胞溶解活性上所观察到的不同在统计学上是有意义的，P＜0.05。
相反，IL-10与IL-4、IL-5、GMCSF或γ-IFN一起使用都不比IL-10单独使用更有效(结果未列出)。
IL-10和IL-2的顺序孵育按上面介绍的方法，将PBMCs保持在培养基或加有IL-10的培养基中。两天后加入IL-2，使其终浓度为2或20U/ml。在再一次过夜培养后测定对Daudi细胞的细胞毒害活性。从5个供体综合的结果如表7所示，其中标准差在平均值的下面给出。
表7在人外周血单核细胞中用IL-10预处理接着用IL-2处理对淋巴因子激活的细胞溶解活性的诱导(以溶胞作用％表示a)预培养条件b供体培养基IL-10cIL-2dIL-10+IL-2e129.7 21.1 44.8 1162 5.5 18.3 12.2 20.7314.7 58.1 74.5 100426.2 59.5 54.3 81.95 4.8 28.2 22.5 40.6平均值 16.2 37.0 41.7 71.8±5.1 ±9.0 ±11.4 ±17.9a.[51Cr]标记的Daudi靶细胞的溶胞作用的百分比是在5∶1的效应子细胞∶靶细胞比和用标准的铬释放法测定的。数据是三次测定的平均值。
b.从正常供体制备的人外周血单核细胞在加入2U/ml IL-2之前先在加有4ng/ml IL-10的培养基中保持2天。在再过夜培养后测定细胞溶解活性。
c.供体PBMCs用IL-10孵育3天。
d.供体PBMCs在加入IL-2前是单独培养在培养基中的。
e.供体PBMCs在加入20U IL-2之前先用IL-10孵育2天。
如表7所示，供体PBMCs在加入IL-2之前先用IL-10预处理的实验组所观察到的细胞溶解活性(71.8±17.9％)比在加入IL-2之前只将供体PBMCs培养在完全培养基中的实验组的细胞溶解活性(41.7±11.4)增加了约2倍。在用IL-10预处理和那些不用IL-10预处理的样本间所观察到差异在统计学上是有意义的P≤0.14。
在用IL-10接着用α-IFN顺序孵育中见到有类似的细胞溶解活性增加的模式(资料未出示)。
IL-10和IL-4对IL-2诱导的细胞毒作用的阻断把从6个人类供体得到的PBMCs培养在培养基中，培养基分别含有单有20U/ml的IL-2，20U/ml的IL-2加1000U/ml的IL-4，20U/ml IL-2加1000U/ml IL-4加4ng/ml IL-10。结果如表8所示，标准差在平均值的下面给出。表8IL-10对人外周血单核细胞中IL-4对IL-2诱导的淋巴因子激活的细胞溶解活性的阻断的拮抗作用(以溶胞作用％表示a)供体 培养基 IL-2bIL-2c+IL-2d+IL-4 IL-4+IL-10112.727.6 35.045.72 5.426.3 17.533.73 1.725.1 14.136.04 3.829.6 14.122.15 3.347.1 17.163.86 6.649.5 20.640.8平均值 5.534.2 19.740.3±1.6 ±4.5 ±3.2 ±5.7a.对[51Cr]标记的Daudi靶细胞溶胞作用百分比是在20∶1的效应子细胞∶靶细胞比和以标准的铬释放法测定的。数据是三次测定的平均值。
b.从正常供体分离到的人外周血单核细胞用20U/ml IL-2处理3天。
c.供体PBMCs用20U/ml IL-2和100U/ml人IL-4处理3天。
d.供体PBMCs用20U/ml IL-2，1000U/ml人IL-4和4ng/ml IL-10处理。
如表8中的数据表明单独用20U/ml IL-2处理，LAK敏感的靶细胞的溶胞作用比例约34.2％。当孵育开始时即加入1000U/ml的IL-4时，溶胞作用能力被抑制了大约2倍。但如果在最初培养的24小时加入4ng/ml的IL-10，IL-4的抑制作用就没有了。
IL-2单用和所有三种细胞因子一起使用的结果无显著性差异(Student’s-t检验，P≤0.05)，说明IL-10对IL-4阻断作用的拮抗是基本上完全的。
只要不违背本发明的精神实质和范围，本发明可做各种修改和变动，这一点对本领域的技术人员是显而易见的。这儿所介绍的具体实施方案只是以举例的形式给出的，而本发明也只是受后面所附的权利要求条款所限制。
权利要求
1.一种治疗癌症的方法，包括给癌症患者施用有效量的IL-10激活的PBMCs以使该癌症消退。
2.权利要求1的方法，进一步包括同时或顺序对所说的个体施用有效量的IL-10。
3.治疗癌症的药剂组合物的生产方法，包括将IL-10激活的PBMCs与药理学上可接受的载体混合。
4.权利要求1到3之任一方法，其中IL-10的施用是与(a)足够量的能增强LAK细胞活性但又不引起毒副作用的IL-2和/或(b)足够量的能增加LAK细胞激活活性的α-IFN合用的。
5.治疗癌症的药剂组合物，包括IL-10激活的PBMCs和药理上可接受的载体。
6.权利要求5的药剂组合物，进一步包括IL-10单用或与IL-2和/或α-IFN合用。
7.IL-10激活的PBMCs在治疗癌症方面的应用。
8.IL-10激活的PBMCs在制造治疗癌症的药剂方面的应用。
9.权利要求7或8的应用，其中IL-10激活的PBMCs和单独的IL-10一起使用或者与IL-10、IL-2和/或α-IFN一起使用。
10.一种拮抗内源性IL-4对IL-2诱导的细胞毒作用的阻断作用的方法，包括对有这类治疗需求的患者施用有效量的IL-10。
11.IL-10在制造拮抗IL-4对IL-2诱导的细胞毒作用的阻断作用的药剂方面的应用。
12.权利要求1至11之任一项的方法、药物组合物或应用，其中的IL-10是人IL-10。
全文摘要
本发明涉及IL-10的使用，单独用或与IL-2和/或α-IFN合用，激发外周血单核细胞的细胞溶解活性以治疗癌症。
文档编号A61K38/21GK1142186SQ94194863
公开日1997年2月5日 申请日期1994年1月20日 优先权日1994年1月20日
发明者M·A·许瓦兹 申请人:先灵公司