一种外周血单个核细胞无血清冻存液及冻存方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞冻存液技术领域，具体涉及一种外周血单个核细胞无血清冻存液 及冻存方法。
【背景技术】
[0002] 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，指外周血中 具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞（monocyte)、树突状细胞和造血干细胞等。 PBMC在体外可诱导分化成多种免疫细胞，如细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK)、自然杀伤细 胞（NK)、自然杀伤性T细胞（NKT)，在抗肿瘤、抗感染等方面具有重大用途。因此，冻存PBMC 在细胞治疗方面具有很重要的意义。
[0003] 细胞冻存是细胞长期保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于_196°C液氮 中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候 再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染 或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。
[0004] 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢 冷冻法冻存细胞。目前最常用的冻存保护剂为二甲基亚砜（DMSO)，这种物质分子量小，溶解 度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损 伤。由于高浓度DMSO对细胞有毒性，还必须添加其他的液体成分，如血清、细胞培养基，以 降低DMSO的浓度，减少对细胞的伤害。
[0005] 现有PBMC冻存液主要以DMSO为主，联合胎牛血清（FBS)或人血清（HAS)，并 添加细胞培养基。血清可保护PBMC免于遭受冻存、复苏的损伤。比如，王桂喜等比较 DMS010% +FBS90%、DMS010% + 右旋糖酐 40(Dextran-40)10% +FBS80%、DMS010% +(羟 乙基淀粉）!ES 6%+FBS 84%等冻存液配方对对PBMC的保护作用，结果显示DMS010% +Dextran-4010% +FBS80%的冻存效果最好，PBMC复苏后活率最高，为79. 7±1. 5%。Robab Nazarpour等研宄发现，10 %~15% DMS0+40 % FBS冻存PBMC效果较好。此外，公开号为 CN102669087A的中国发明专利申请，公开了一种外周血单个核细胞冻存液，包含渗透性冷 冻保护剂、葡聚糖、血清或血浆、生理盐水。此外，细胞培养基也是冻存液的常用组分， 比如覃春捷等用以RPMI 1640培养基和DMS0、10%白蛋白作冻存保护剂在-80°C条件下直 接冻存外周造血干细胞。
[0006] 现有技术中干细胞冻存液所使用的胎牛血清常携带动物源性病毒，比如欧洲多个 国家发生疯牛病，其血清中含有导致疯牛病的病毒，用于冻存细胞会导致此类病毒传播。此 外，有研宄表明长期与胎牛血清接触的干细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生内吞，内吞 胎牛血清后的干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化，应用于人体后有可能发生异种动物 蛋白引起的免疫反应，从而导致干细胞移植后成功率降低以及不良反应的发生。而人血清 亦可传播潜在的病毒，比如乙肝病毒，艾滋病毒等。因此，中国药品和食品质量监督管理局 2003年发布的《人体细胞治疗临床研宄和质量控制指导原则》明确指出，应尽量避免使用血 清培养细胞，包括动物血清和人血清。
[0007]为了避免使用血清带来病毒感染，有些人使用了人血白蛋白，但人血蛋白在临床 上可能引起一些不良反应，比如过敏性休克、发热、心脏损害、呼吸系统损害、肾脏损害等， 这限制了含有白蛋白的细胞冻存液在临床上直接使用的安全性。
[0008] 另外，现有的冻存液配方中含有细胞培养基，细胞培养基不能直接注射入人体，故 如果需要细胞复苏后直接移植，则必需通过离心把细胞培养基去除掉，而离心又会导致刚 刚复苏的细胞受损，活率降低，影响细胞治疗效果。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种外周血单个核细胞无血清 冻存液，该冻存液由DMSO、右旋糖酐40、勃脉力A组成，不含动物血清、人血清、细胞培养基， 且冻存效果良好，细胞复苏后既可直接用于临床，又可在体外诱导成免疫细胞NKT、CIK，在 临床上颇具应用价值。本发明具体的技术方案如下：
[0010] 一种外周血单个核细胞无血清冻存液，其特征在于，按体积分数计包括以下组分： 5~20%的二甲基亚砜、0? 5~10%右旋糖酐40,余量为勃脉力A。
[0011] 其中勃脉力A为中国药监局批准用于临床的复方电解质注射液，其组分为：每 1000 ml含氯化钠5. 26g、葡萄糖酸钠5. 02g、醋酸钠3. 68g、氯化钾0. 37g、氯化镁0. 30g。
[0012] 本发明的目的还可以通过以下方案实现：
[0013] 实现本发明的一种技术方案是：所述外周血单个核细胞无血清冻存液按体积分数 计包括以下组分：10%的二甲基亚砜、1 %右旋糖酐40,余量为勃脉力A，所述右旋糖酐40为 6%右旋糖酐-40葡萄糖注射液，其含有葡萄糖，可为细胞提供一定的营养成分。
[0014] 实现本发明的一种技术方案是：所述外周血单个核细胞无血清冻存液按体积分数 计包括以下组分：20%的二甲基亚砜、2%右旋糖酐40,余量为勃脉力A，所述右旋糖酐40为 6 %右旋糖酐-40葡萄糖注射液。
[0015] 本发明还提供了利用上述外周血单个核细胞无血清冻存液来冻存外周血单个核 细胞的方法，具体的技术方案如下：
[0016]-种外周血单个核细胞无血清冻存方法，其特征在于包括以下步骤：
[0017] (1)提供外周血单个核细胞；
[0018] (2)配制权利要求1至3任意一项所述的外周血单个核细胞无血清冻存液；
[0019] (3)用勃脉力A重悬外周血单个核细胞，并向细胞悬液中加入等体积的无血清冻 存液，然后分装于冻存管中，将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，在-80°C环境中冷冻，次 日再移入液氮罐。
[0020] 优选地，步骤（3)加入的勃脉力A的量以使得外周血单个核细胞的浓度为最终冻 存液中外周血单个核细胞浓度的两倍为准。
[0021] 优选地，步骤（3)冻存管中，外周血单个核细胞的密度为（0. 5~I) X l〇Vml。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0023] 1、本发明摒弃采用动物血清、人血清、细胞培养基作为冻存液的成分之一，而是采 用了勃脉力A和右旋糖酐40联合二甲基亚砜来作为PBMC的冻存液，避免了传播潜在病原 体的风险，提高了细胞冻存的安全性，又确保了 PBMC的冻存效果；另外，不含细胞培养基的 冻存液，PBMC复苏后可以直接回输人体，在临床上具有很大的实用价值；本发明的配方在 没有白蛋白的情况下，亦取得良好的冻存效果。
[0024] 2、本发明的冻存液中，DMSO易穿透细胞，在细胞冻存过程中可以使冰点下降，减少 细胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤；右旋糖酐40则起到稳定细胞膜的作 用，避免细胞遭受冻存伤害；勃脉力A则维持电解质平衡，使细胞处于一种比较温和的更接 近于体内环境的溶液中。
[0025] 3、本发明选择合适于外周血单个核细胞冻存的物质配制成冻存液，且简化了冻存 液的组分，但获得了突出的效果，用本发明冻存液冻存的外周血单个核细胞复苏后，安全无 毒，可直接用于临床，又可在体外诱导成免疫细胞NKT、CIK