一种巨核祖细胞的分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞培养领域，尤其设及一种巨核祖细胞的分离方法。
【背景技术】
[0002] 巨核细胞祖细胞（megakaryo巧teprogenitorcell)是一种使人们产生巨核细 胞的细胞，它是从骨髓祖（CFU-GEMM)而得，简称巨核祖细胞。巨核祖细胞存在于CD126/ Lin细胞群中，而CD34+细胞可分为两个细胞亚群，表达比-6R和不表达比-6R，比-6R+细 胞能被刺激形成粒-巨隧细胞、淋己细胞和粒细胞，而IL-6R-细胞当被给予IL-6/SIL-6R 时可形成红系及巨核系细胞。造血干细胞首先分化生成巨核系祖细胞，也称巨核系集落形 成单位（colonyformingunit-megakaryo巧te,CFU-Meg)。巨核系祖细胞分化成为成熟的 巨核细胞后，其边缘部分破裂脱落，形成血小板，每个巨核细胞能生成1000-6000个左右的 血小板；巨核细胞虽然在骨髓的造血细胞中为数最少，仅占骨髓有核细胞总数的0. 05%， 但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。
[0003] 如今恶性肿瘤严重危害人类健康的主要疾病之一，目前主要是通过手术治疗并结 合放化疗。当患者在接受高剂量放化疗后，骨髓造血功能低下，常会出现血小板减少，严重 时会造成患者出血死亡。临床上常采用输注血小板，但血小板来源有限，存活期短，体外易 失活，且反复输注血小板易导致输注无效并增加输血传播疾病的危险。
[0004] 1997年，Bertolini等从外周血中分离CD34+，体外诱导扩增巨核细胞7天，用于 患者血小板恢复。结果显示，体外诱导的巨核细胞可替代血小板输入，或减少血小板输入次 数。2000年，Paquette等将体外动员的外周血细胞经体外诱导扩增巨核细胞9天后，用于改 善大剂量化疗的乳腺癌病人中性粒细胞减少、血小板减少和贫血症状。VandenOudenrijn 等对外周血、骨髓、厮血来源的CD34+细胞体外扩增进行比较，发现厮血来源的CD34+具有 更强的巨核细胞扩增能力。由于厮血造血干细胞移植后血小板的恢复较外周血、骨髓慢，因 此采用体外诱导、扩增巨核祖细胞和巨核细胞，然后输注患者体内，进一步发育成血小板， 缩短血小板的恢复期。因此，分离巨核祖细胞将其用于恶性肿瘤的治疗是目前的研究热点。 阳0化]对于巨核祖细胞的分离，目前的方法主要有两种，一种是通过体外分离造血干细 胞化SC)来获得单核球细胞，再分选CD34+细胞，并对其进行直接诱导培养，得到巨核祖细 胞；另一种是通过体外分离造血干细胞化SC)来获得单核球细胞，进行免疫磁珠筛选，去除 已确定分化方向的细胞，获得Lin-细胞，再将获得的Lin-细胞与IL-6受体的抗体解育，获 得Lin-/CD126-细胞，经过定向诱导分化得到巨核细胞。前者提供的方法相对简单，但得率 低；后者得率相对较高，但提供的方法着重于得到巨核祖细胞，却忽略了其前提条件，分离 单核球的数量直接影响到巨核祖细胞的得率，并且其方法分离过程所采用的甲基纤维素是 不能用于人体静脉回输的，所得的巨核祖细胞诱导所得的巨核细胞（CD41a+/CD61+细胞） 的比例低。
[0006] 因此，应当进一步开发得率高，诱导分化后得到高表达CD41a7CD6r的巨核细胞 的分离巨核祖细胞的方法。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种巨核祖细胞的分离方法，即动 员扩增后分离CD126 /Lin细胞的方法。本发明提供的方法分离巨核祖细胞得率高，其定向 诱导分化后得到的巨核细胞高表达CD41a7CD6r，且可W用于人体静脉回输。 阳00引本发明提供的CD126 /Lin细胞的分离方法，包括W下步骤：
[0009] 步骤1 :分离获得厮血中的单个核细胞，WriiG-CSF刺激培养；
[0010] 步骤2 :刺激培养获得的细胞经免疫磁珠分离筛选得到Lin-细胞；
[0011] 步骤3 :Lin-细胞经免疫磁珠分离筛选得到CD126 /Lin细胞。
[0012] 在本发明的实施例中，rhG-CSF在刺激培养的培养基中的浓度为50ng/mL~ lOOng/mL。
[0013] 在一些实施例中，rhG-CSF在刺激培养的培养基中的浓度为10化g/mL。
[0014] 在本发明的实施例中，刺激培养的条件为5%C02、37°C;时间为3天~7天。
[0015] 在一些实施例中，刺激培养的时间为5天。
[0016]重组人粒细胞集落刺激因子（recombinanthumanGranuloc}fteColony StimulatingFactor,rhG-CSF)，可促进髓系造血祖细胞的增殖、分化和成熟，调节中性粒 细胞系的增殖与分化成熟；也可驱使中性粒细胞释放至血流，使外周中性粒细胞数量增多。 本发明采用rhG-CSF对厮血中分离得到的单个核细胞进行刺激培养W增加其中巨核祖细 胞的含量。实验表明，与未经rhG-CSF刺激的直接用厮血分离单核球筛选得到的巨核祖细 胞相比，W浓度为50ng/ml~10化g/ml的rhG-CSF连续刺激培养单个核细胞3天~7天后， CD34+细胞的在培养所得细胞中的数量百分比提高了 10倍。从根本上提高了巨核祖细胞的 含量，从而提高分离巨核祖细胞的得率和向巨核细胞定向诱导分化后高表达CD41a7CD6r。 阳017] 在本发明的实施例中，刺激培养的培养基为StemSpanS阳Μ无血清培养基。
[0018] 在本发明的实施例中，刺激培养的单个核细胞的接种密度为1X1〇6个/mL。
[0019] 本发明采用免疫磁珠分离的方法从经刺激培养的细胞中分离巨核祖细胞，首先采 用cocktail抗体混合物分离得到Lin-细胞，而后采用CD126抗体（抗白细胞介素6受体 抗体）筛选获得CD126 /Lin细胞，即IL-6R细胞群。经鉴定，筛选得到的IL-6R细胞群进 行体外定向诱导分化培养得到的巨核细胞高表达CD41a7CD6r，比例高达81 %。
[0020] 在本发明的实施例中，步骤2中免疫磁珠分离的抗体为CD2抗体、CD3抗体、CD5抗 体、CD14抗体、CD16抗体、CD19抗体、CD24抗体、CD41抗体、CD6化抗体及GlycophorinA抗 体的混合物。
[0021] 在本发明的实施例中，CD2抗体、CD3抗体、CD5抗体、CD14抗体、CD16抗 体、CD19抗体、CD24抗体、CD41抗体、CD6化抗体及GlycophorinA抗体的质量比为 阳02引在本发明的实施例中，步骤2中免疫磁珠分离的溫度为4°C，时间为30min。
[002引具体的，步骤2中免疫磁珠分离的步骤包括：将经刺激培养后的细胞W1~2mL PBS缓冲液重悬，向细胞悬液中添加免疫磁珠，然后添加CD2抗体、CD3抗体、CD5抗体、CD14 抗体、CD16抗体、CD19抗体、CD24抗体、CD41抗体、CD6化抗体及GlycophorinA抗体，4°C 解育30min，后分选得到Lin-细胞。
[0024] 在本发明的实施例中，步骤3中免疫磁珠分离的抗体为CD126抗体。
[00对在本发明的实施例中，步骤3中免疫磁珠分离的溫度为4°C，时间为30min。
[00%] 具体的，步骤3中免疫磁珠分离的步骤包括：将步骤2中分离得到的Lin-细胞与 免疫磁珠和CD126抗体混合，4°C解育30min，后分选得到Lin/CD126细胞。
[0027] 在本发明的实施例中，单个核细胞的制备方法包括：
[0028] 步骤1 :经抗凝处理的厮血与径乙基淀粉溶液混合，去除红细胞，获得上清液；
[0029] 步骤2 :上清液与淋己细胞分离液混合后，经离屯、收集单个核细胞。
[0030] 在一些实施例中，径乙基淀粉溶液中包括径乙基淀粉和氯化钢，其中径乙基淀粉 的浓度为60g/L;氯化钢的浓度为9g/L。
[0031] 在一些实施例中，经抗凝处理的厮血与径乙基淀粉溶液的体积比为（2~6) :1。
[0032] 在本发明的实施例中，厮血采集采用抗凝采血管采集。
[0033] 在本发明的实施例中，上清液与淋己细胞分离液混合的体积比为2:1。
[0034] 本发明提供了一种巨核祖细胞的分离方法，该方法将分离得到的单个核细胞W rhG-CSF刺激培养3~7天，从而增加细胞中巨核系细胞的含量，W免疫磁珠对经刺激培养 的细胞进行筛选，获得巨核祖细胞。采用本发明提供的方法对巨核祖细胞进行分离，得率较 高且向巨核细胞定向诱导分化后得到表型为CD41a7CD6r的细胞比例较高。实验表明，对 20~100MJ齐血进行分离，获得的巨核组细胞的数量可达2. 75X106个，显著优于不进行刺 激培养分离筛选的对照组。经鉴定，所得细胞中巨核组细胞的数量百分比为5~15%，经14 天定向诱导分化培养，巨核细胞的数量总数可扩增312. 5+21. 2倍，CD41a7CD6r细胞（巨 核细胞）的比例可达81%。且采用该方法分离获得的细胞可直接用于人体回输。
【具体实施方式】
[0035] 本发明提供了一种巨核祖细胞的分离方法，本领域技术人员可W借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来 说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例 进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文的方法和应用进 行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0036] 本发明采用的试剂和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0037] 下面结合实施例，进一步阐述本发明： 阳03引实施例1单个核细胞分离
[0039] 将采集的厮血50mL中加入25mL径乙基淀粉注射液（北京双鹤药业股份有限公 司）（厮血：径乙基淀粉=2:l(v/v))，充分混匀，静止15minW上，沉降红细胞，吸取上清 液；
[0040] 将上清液加至装有淋己细胞分离液的离屯、分离管中（上清：分离液=2:l(