专利名称：细胞分离方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞分离领域，特别是从样品中分离出所需的细胞。本发明具体还包括从母体血液样品中分离出胎儿细胞的方法，以达到无创产前诊断的目的；和分离红细胞与白细胞的方法；以及在细胞分离中所使用的装置和器件。
细胞分离技术被应用于生物、化学、医学等领域。细胞分离往往是利用细胞与细胞之间性质的差异进行分离。例如，利用细胞之间的介电性质差异、物理形态上的差异等等。但在许多情况下，由于所需分离的细胞的某些性质与样品中所含的其它细胞的性质相近或是差异不明显，使得利用现有技术进行细胞的分离非常困难。
例如，产前诊断及检测是通过某些检查，发现胎儿在宫内安危及疾病情况，避免胎儿死亡及缺陷儿的出生。这其中包括两种诊断一种是对胎儿在母体内的发育进行诊断和监控，主要的方式是采用各种仪器，例如通过胎儿监护仪，超生扫描，X线透视和造影，胎儿镜对胎儿形态进行直接观察等；另一种是检查胎儿是否患有先天性遗传病，例如β一地中海贫血病、镰刀型贫血病等遗传疾病的诊断。后者难度较大。目前，由于人们结婚、生育的年龄越来越大，使得胎儿患上先天性遗传病的几率越来越大；而且平均每对夫妇的孩子数目越来越少，因此，对胎儿先天性遗传病的产前诊断越来越得到人们的重视。常规先天性遗传病的产前诊断方法有羊水诊断(amniocentesis)、胎儿绒膜纤毛采样检测(chorion villussampling，CVS)。羊水诊断即通过羊膜囊穿刺术，抽出母体羊水，以得到胎儿细胞来进行诊断。羊水诊断虽然可以得到较为准确的结果，但是由于要从母体中抽取羊水，对孕妇和胎儿都要造成一定的损害。据报道，通过对比发现，1040例穿刺后的自发流产率为3.5％，而正常的自发流产率为3.3％，有研究报道表明，由于穿刺引发的流产率可以达到0.5％-1％以上。同时对107例经过羊膜穿刺的胎儿进行观察，发现其中10例有皮肤疤痕(燕淑昭，妊娠与胎儿疾病，浙江科学出版社，1987)。羊水穿刺要求实施穿刺的医生有很高的技巧，并且需要严格无菌操作，否则会引起羊膜炎。而实施胎儿绒膜纤毛采样检测所引起胎儿流产的几率更高，可以达到1.0％左右。因此，全世界的科学家都在寻找一种无创的产前诊断方法。
由于母体血液和胎儿血液在胎盘进行营养交换，因此有部分胎儿细胞进入母体血液中。进入母体血液中的胎儿细胞主要有胎儿成核红细胞(fetal nucleated red blood cell，fetal NRBC)，淋巴细胞(lymphocyte)以及滋养细胞(trophoblast)。其中，滋养细胞体积最大，但是由于在其第一次进入母体血液循环后，就在母体肺部降解，因此在母体血液中含量很少。对于胎儿淋巴细胞，不但含量少，并且在母体血液中存活时间很长，所以得到的胎儿淋巴细胞很可能是上一个胎儿的细胞，造成诊断错误。而对于胎儿成核红细胞，由于其在母体血液中相对含量较高，成为产前诊断的首选。针对胎儿成核红细胞的产前诊断方法有荧光激发细胞分类术(fluorescenceactivated cell sorting，FACS)，磁性激发细胞分类术(magneticactivated cell sorting，MACS)等。其中荧光激发细胞分类术价格昂贵，并且检验成功率低。对于磁性激发细胞分类术来说，虽然相对低廉，但为了最终得到胎儿成核红细胞，需要在显微镜下使用细针对单个细胞进行操作，难度比较大。造成上述方法困难的主要原因是(1)胎儿成核红细胞在母体中含量很低。虽然胎儿成核红细胞在母体中的含量比起胎儿淋巴细胞和胎儿滋养细胞高，但也是很低的。母体血液中成核细胞与胎儿成核红细胞的比例是4.65×106～6×106，20ml母体血液经过磁性激发细胞分类术后最终得到的胎儿成核红细胞大约是7～22个。(2)胎儿成核红细胞与母体细胞的性质十分接近。其中它与母体成核红细胞的分别仅仅是胎儿成核红细胞含有特有的血红蛋白ξ以及血红蛋白γ。并且NRBC与淋巴细胞的性质也非常接近。
介电电泳分离是利用介电电泳力对细胞进行分离。作用在一个微粒上的介电电泳力来源于微粒所处的不均匀的交变电场。在外加电场作用下微粒上感生出极化电荷，电偶极矩的大小和方向与微粒及其悬浮介质的介电特性之间的差异有关。
介电电泳力可以是行波介电电泳(travelling wavedielectrophoresis，twDEP)力，也可以是常规介电电泳(conventional dielectrophoresis，cDEP)力。行波介电电泳力是指在行波电场作用下微粒上产生的力。行波电场由相位值不均匀分布的交变电场分量决定。常规介电电泳力是指在幅值不均匀分布的交流电场作用下微粒上产生的力。当一个微粒(如细胞)受到不均匀电场作用时，由于电场和微粒上感生电偶极矩的相互作用，微粒就受到一个介电电泳力的作用。
介电电泳力的表达式为 其中r是微粒半径，εm是微粒悬浮介质的介电常数，Erms是电场均方根值，因子fCM＝(εp*-εm*)/(εp*+2εm*)是介电极化因子(Clausius-Mossotti因子)。复式介电常数定义为εx*＝εx-jσx/(2πf)。介电极化因子与外加电场的频率f、电导率σ、微粒介电常数(记为p)、微粒悬浮介质的介电常数(记为m)有关。
从公式(1)可以看出，介电电泳力一般由两个分量构成即常规介电电泳(cDEP)力和行波介电电泳(twDEP)力。常规介电电泳力和与场强梯度(Erms2)相互作用的电场感生极化的同步(in-phase)分量有关，该感生极化项Re(fCM)，即因子fCM的实部，是常规介电电泳的极化因子。行波介电电泳力与和电场相位梯度(x，yz)发生交互作用的电场感生极化的异步(out-of-phase)分量有关，该感生极化项Im(fCM)，即因子fCM的虚部，是行波介电电泳的极化因子。值得指出的是，若一个电场其场强分量的相位是不均匀分布的，则该电场是一个行波电场。电场沿着随位置不同而相位值递减的方向延伸。理想行进电场的相位分布沿电场行进方向是位置的线性函数。这样，常规介电电泳力是指因交流电场场强不均匀分布而在微粒上产生的力。尽管常规介电电泳力有时在文献中也被简称为介电电泳力，但在这里避免使用这样的简化术语。
半径为r、受交变电场不均匀分布场强作用的微粒所受的常规介电电泳力 为FρcDEP=2πϵmr3χDEP▿Erms2-----(2)]]>其中Erms是场强的均方根值，εm是介质的介电常数。表示常规介电电泳力的公式(2)与上述的介电电泳力的一般表达式一致。因子χcDEP是微粒的常规介电电泳极化因子，可以表示为χcDEP=Re(p mϵp*+2ϵm*)-----(3)]]>这里Re是复数的实部，符号εx*＝εx-jσx/(2πf)是复式介电常数。参数εp、σp分别是微粒的有效介电常数和电导率(可能与外加频率有关)。例如，典型的生物细胞将具有与频率相关的电导率和介电常数(至少部分上是由于细胞质膜极化引发的)。
当一个微粒的常规介电电泳极化因子为正(χcDEP＞0)时，微粒受常规介电电泳力作用向强场区域运动，这称为正向常规介电电泳。导致微粒作正向常规介电电泳运动的常规介电电泳力称为正向常规介电电泳力。当一个微粒的常规介电电泳极化因子为负(χcDEP＜0)时，微粒受常规介电电泳力作用远离强场区域向弱场区域运动，这称为负向常规介电电泳。导致微粒作负向常规介电电泳运动的常规介电电泳力称为负向的常规介电电泳力。
对一个半径为r，受行波电场 (即E场的x分量沿z方向行进，x分量的相位值沿z向是位置的线性函数)作用的微粒来说，作用在其上的理想行波电场的行波介电电泳力FtwDEP为FTWDEP=-4πϵmλr3ζTWDE2·aρz-----(4)]]>其中E是场强大小，εm是介质的介电常数，ζtwDEP是微粒的行波介电电泳极化因子ζtwDEP=Im(p mϵp*+2ϵm*)-----(5)]]>其中Im指相应复数的虚部，符号εx*＝εx-jσx/(2πf)是复式介电常数，参数εp、σp分别是微粒的有效介电常数和电导率(外加频率相关)。
这样根据行波介电电泳极化因子的正负，介电电泳力的行波分量将沿着或逆着行波场的传播方向作用于微粒上。如果在工作频率下微粒的行波介电电泳极化因子是正的(ζTWD＞0)，则作用在微粒上的行波介电电泳力将与电场行进方向相反。如果在工作频率下微粒的行波介电电泳极化因子是负的(ζTWD＜0)，则作用在微粒上的行波介电电泳力将与电场行进方向相同。对微粒(包括生物细胞在内)的行波介电电泳操纵而言，作用在直径10微米的微粒上的行波介电电泳力的数量级在0.01至10000pN之间。
一般地，一个行波电场同时诱导产生行波介电电泳力(FtwDEP)和常规介电电泳力(FDEP)。一个微粒到底如何被移动或操纵取决于这两种力(FcDEPand FtwDEP)的相对比值。于是，对微粒或微粒混合物的操纵就依赖于电场分布、外加频率、行波介电电泳和常规介电电泳极化因子的大小。因此，微粒例如生物细胞所受的常规介电电泳和行波介电电泳力就依赖于它们的介电性质，也就于它们的介电常数和电导率相关。具有不同介电特性的微粒在同样的电场作用下所受的常规介电电泳和行波介电电泳力也不同。
利用介电电泳对不同类细胞进行分离可以利用常规介电电泳，使一种细胞受到正向介电电泳力，被吸引到电极边缘；而另一种细胞受到负向介电电泳力，被排斥到电场最弱的地方。通过外加流体泵推动流体运动，把受到负向介电电泳力的细胞收集起来，达到分离效果。也可以在电极或微电极上施加适当的交流信号来产生行波电场。通过制作在基底上的电极和微电极，以形成芯片、微芯片或是微粒操纵芯片进行细胞分离。(王小波，吴镭，程京等，微流体系统中实体分子的操纵方法，2000年8月8日，00122631.2；王小波，杨卫平，许俊泉等，用于微粒操纵与微粒导向的装置及其使用方法，2000年9月27日，00129043.6；王小波，程京，吴镭，许俊泉，利用声场力和其它作用力对微粒进行场流分离的装置和方法，2000年9月30日，00130562.X；王小波，吴镭，杨卫平等，多力操纵装置及其应用，2000年9月30日，00130563.8)在利用介电电泳对不同类的细胞进行分离时，只有当细胞之间的介电性质相差很大的时候，即生物细胞所具有与频率相关的电导率和介电常数大小相差很大时时，才能得到比较好的分离效果。例如血细胞与大肠杆菌、死酵母细胞和活酵母细胞的分离。而对于细胞介电性质十分接近的细胞，分离效果就比较差。虽然可以通过介电电泳一场流分离、常规介电电泳一行波介电电泳结合，可以提高分离的效率，但是对于象胎儿成核红细胞、母体成核红细胞和母体淋巴细胞这样介电性质十分相近的细胞，分离效果仍然很差。
同样，红细胞与白细胞的介电性质也十分接近，直接进行介电电泳分离是难以将它们分离的。
本发明的目的之一是提供一种细胞分离方法，该方法通过对细胞染色以扩大细胞之间性质的差异，从而实现细胞的分离。
本发明的目的之二是提供一种从怀孕母体血液样品中分离出其中所含之成核红细胞的方法，该方法通过对细胞染色以扩大母体血液中所含细胞之间诸如介电性质、物理形态等性质上的差异，从而从中分离出母体成核红细胞与胎儿成核红细胞。
本发明的目的之三是提供一种将红细胞与白细胞分离的方法，该方法通过对细胞染色以扩大红细胞与白细胞的介电性质，从而将它们分离。
本发明的目的之四是提供一种用于在密度梯度离心方法中收集细胞的离心管，利用该离心管可以大大提高细胞收集效率。
本发明的目的之五是提供一种用于细胞分离的介电电泳分离装置，以实现对细胞的快速的介电电泳分离。
本发明的技术方案如下本发明的目的之一是这样实现的本发明之从样品中分离出所需细胞的方法，是在进行细胞分离之前，在样品中加入细胞染料，对样品中的细胞进行染色。
本发明之细胞染色过程可在液体中进行。
本发明上述方法特别适用的情况之一是，其中所需分离的细胞与样品中所含其它细胞具有接近的介电性质。
在细胞染色后，可利用介电电泳力对样品中的细胞进行分离，得到所需的细胞。
在细胞染色后，可根据染色后的细胞呈现的不同形态，分离出所需的细胞。
在本发明之方法中，可利用介电电泳芯片分离样品中所需的细胞，由介电电泳芯片对样品中染色后的细胞施加介电电泳力。
介电电泳芯片可包括常规介电电泳芯片、行波介电电泳芯片或基于行波介电电泳的颗粒操纵开关芯片。
可利用多路细胞颗粒操纵开关，根据染色后细胞呈现的形态，分离样品中的细胞。
本发明所采用的细胞染料可满足以下条件在适当的染料浓度和染色时间下，介电性质相近的细胞对于该染料的吸收效率不同，可导致一种细胞染色、另一种细胞不染色。
本发明的目的之二是这样实现的本发明之一种从母体血液样品中分离出其中所含之成核红细胞的方法，包括以下步骤(1)在母体血液样品中加入细胞染料；(2)利用介电电泳力对母体血液样品中的细胞进行分离，得到成核红细胞。
从所述的母体血液样品中分离出的成核红细胞可包括母体自身的成核红细胞和胎儿成核红细胞。
在母体血液样品中加入细胞染料之前，可除去母体血液中的大部分红细胞。
在母体血液样品中加入细胞染料之前，可把母体血液样品加入到等渗的葡萄糖缓冲液中。
所采用的葡萄糖缓冲液的电导率可为10μs/cm到1.5ms/cm之间。
本发明可采用吉姆萨氏(Giemsa)染料作为细胞染料。
也可采用特异鉴别胎儿血红蛋白的染料作为细胞染料。
在本发明中，可将染色后的母体血液样品加入到介电电泳芯片上，由该介电电泳芯片对母体血液样品中的细胞施加介电电泳力以分离细胞。
可采用一信号发生器对介电电泳芯片施加信号，使母体血液样品中的母体白细胞被捕捉到电极上，染色后的成核红细胞被排斥到芯片上电场最弱的地方。
可利用多路细胞颗粒操纵开关，实现对母体血液样品中的母体红细胞、母体白细胞、母体成核红细胞、胎儿成核红细胞的并行分离及检测。
可以对染色后的母体血液样品进行一次以上的介电分离。
在本发明中，吉姆萨氏染料与缓冲液之配比可为1∶5至1∶500。
在本发明中，染色时间可为10秒至10分钟。
本发明的目的之三是这样实现的本发明之一种将红细胞与白细胞分离的方法，包括以下步骤(1)将含有红细胞和白细胞的样品加入到缓冲液中；(2)加入细胞染料，对样品中的细胞进行染色；(3)利用介电电泳芯片分离红细胞和白细胞。
本发明在上述的方法中可采用吉姆萨染料作为细胞染料，且染料与缓冲液之比可为1∶10至1∶100。
在染色过程中，其中的染色时间可为30分钟以上。
在上述的方法中，可采用以下方式当样品中的细胞被染色后，通过一个信号发生器，调节频率以及电压幅值，找到一个合适的频率和电压值，红细胞在这个设置下，表现为正向介电电泳，被捕捉到电极上；而染色的白细胞表现为负向介电电泳，被排斥到电场最弱的地方，通过利用介电电泳芯片和外加流体泵的作用，可以收集到白细胞。
本发明的目的之四是这样实现的本发明之一种用于在密度梯度离心方法中收集细胞的离心管，该离心管中部之内径比其上部及下部更为窄细。
本发明的目的之五是这样实现的本发明之一种用于细胞分离的介电电泳分离装置，包括两片介电电泳芯片、一垫片、信号发生器、管道及泵，其中垫片置于两介电电泳芯片之间。
在上述的介电电泳分离装置中，可在垫片上方的介电电泳芯片上设有入口孔和出口孔。
在上述的介电电泳分离装置中，垫片上流体通道的形状可与电极的形状相对应。
在上述的介电电泳分离装置中，在垫片上之流体通道中，处于电极作用区域的管道口径可宽于处于无电极作用区域的管道口径，以减少细胞的非特异性吸附。
以下结合附图和实施例进一步说明本发明。
图1A和图1B是本发明之一种用于在密度梯度离心方法中收集细胞的离心管的两种结构示意图；图2是一种常规的介电电泳分离装置的结构示意图；图3是本发明之介电电泳分离装置的实施例之局部结构示意图；图4是图3所示的装置中之垫片上的流体通道的一种形状示意图；图5A和图5B是介电电泳芯片上所设置的电极的两种形状示意图；图6是一种利用多路细胞颗粒操纵开关设计的细胞分离装置。
在本发明的实施例中，可利用微加工出来的介电电泳电泳芯片，通过对母体血液样品中细胞进行染色，以扩大胎儿成核红细胞与母体细胞之间的介电特性差异，实现对胎儿成核红细胞的富集，纯化，以实现快速、简便、准确的产前诊断。在优选的实施例中，本发明的实验步骤如下首先从怀孕母体中抽取血液，做密度梯度离心，以除去大部分的红细胞干扰。密度梯度离心是生物、医学中常用的一种分离不同种血细胞的方法。由于血清、淋巴细胞、粒细胞以及红细胞具有不同的密度，因此用Ficoll等多糖聚合物离心时，不同密度的细胞处于不同的层面，由此而实现的细胞的收集。由于成核红细胞与淋巴细胞的密度接近，因此二者会混合在一个层面。
做密度梯度离心时，血液分成四层。最下层是红细胞，依次向上是粒细胞、淋巴细胞和成核红细胞、血清。用普通的离心管进行操作时，由于所需要的白细胞和成核红细胞处于中间层，并且量比较少，因此会在操作中损失部分所需要的细胞。为了提高收集效率，可以使用如图1A或图1B所示的离心管。具体操作中，可以将离心管设计成圆柱形，如图1A所示，也可以设计成方形，如图1B所示，在设计这种离心管时，为了达到最佳收集效果，有必要进行一个预试验，以确定离心管的尺寸。其中，如图1A所示，将离心管设计成圆柱形，圆锥底部105的体积等于含有红细胞和粒细胞的组分之体积，中部103有一窄细圆柱部分，其体积等于含有淋巴细胞和成核红细胞的组分之体积，那么圆锥上部101只有含有血清的组分。由于此离心管的中间部分很细，因此中间相(淋巴细胞和成核红细胞)与上层和下层的分界面102、104很小，易于观察，从而提高收集中间层细胞的效率。如图1B所示，其中部203也设计成方形窄缝，两面厚，两面薄，上部201和下部205设计成三角形体，分界面202、204很小。为了进一步提高效率，可以在中间层与上层和下层分界部分薄壁处用液氮枪冷冻，收集时，先把上层倒出，然后去掉冰冻的部分，就可以得到中间层，从而大大提高了细胞收集效率。
经过两次离心洗涤后，把含有胎儿成核红细胞、母体成核红细胞、母体淋巴细胞以及微量粒细胞、红细胞的样品保存在母体血清中。本领域的专业人员应该理解，可以通过其它方法，例如过滤的方法来去除血液中的红细胞。把样品加入到等渗的葡萄糖缓冲液中(例如浓度是8.5％的蔗糖溶液，其中右旋葡萄糖的浓度是0.3％)。缓冲液的电导率要合适，一般是10μs/cm到1.5ms/cm之间。之后，加入一定浓度和体积的细胞染料，例如Giemsa染料。通过加入适当浓度的染料以及选择适当的染色时间，可以达到所有的成核红细胞均染色，而所有的母体白细胞均不染色，并且经过染色的细胞中，成核红细胞和母体白细胞从形态上可以区分，且它们之间的介电特性差异很大。这是由于不同种类的细胞对染料的吸收效率不同，或者是细胞的不同细胞器对染料的吸收效率不同，导致细胞形态上的差别，进而导致细胞介电性质的扩大。由于染色是在液体中进行，因此染色的时间以及染料的浓度值必须适当。吉姆萨(Giemsa)染料与缓冲液(buffer)之比是在1∶5与1∶500之间，例如采用1∶10的比例。浓度过大，则溶液颜色过深，不易观察，并且成核红细胞与母体白细胞很快都染色；浓度过小，则部分成核红细胞没有染色，达不到完全分离的效果。染色时间也要控制合适，在染料浓度为1∶100的情况下，时间在10秒到10分钟。如果染色的时间和染料的浓度值控制过长，则母体白细胞也被染色，达不到分离的效果。如果时间过短，则成核红细胞也不染色。经过特定的时间后，加入到介电电泳芯片上。通过一个信号发生器，调节频率以及电压幅值，找到一个合适的频率和电压值，母体白细胞在这个设置下，表现为正向介电电泳，被捕捉到电极上；而染色的成核红细胞表现为负向介电电泳，被排斥到电场强度最弱的区域。通过利用介电电泳芯片和外加流体泵的作用，可以收集到成核红细胞。在收集到的成核红细胞中，既有母体成核红细胞，又有胎儿成核红细胞。对此样品进行针对胎儿血红蛋白的特异染色，母体成核红细胞与胎儿成核红细胞从形态上也可以区分，并且介电特性差异得到扩大，再一次利用介电电泳芯片，就可以分离得到纯的胎儿成核红细胞。之后就可以进行常规的分子生物学检测，对胎儿进行产前诊断。
关于染料的浓度与染色时间，还需根据染料的类型、染色细胞的类型等因素来确定。
本领域的专业人员应该可以理解，即可以使用单一的常规介电电泳芯片把母体细胞和胎儿细胞分开，然后利用泵产生的流体速度，收集负向介电电泳的胎儿细胞。也可以利用常规介电电泳/行波介电电泳芯片，微粒操纵芯片对胎儿细胞进行输运，分离，最后通过利用泵产生的流速，到达更好的分离效果。(可参见中国专利申请号00122631.2，名称微流体系统中实体分子的操纵方法，申请日2000年8月8日；及中国专利申请号00129043.6，用于微粒操纵与微粒导向的装置及其使用方法，申请日2000年9月27日；及中国专利申请号00130562.X，利用声场力和其它作用力对微粒进行场流分离的装置和方法，申请日2000年9月30日；及中国专利申请号00130563.8，发明人王小波，吴镭，杨卫平等，名称多力操纵装置及其应用，申请日2000年9月30日)同时，由于胎儿成核红细胞在母体血液中的数量非常少，因此，通过一次介电电泳分离可能无法得到纯的胎儿成核红细胞，需要经过两次或者两次以上的介电电泳分离，才能得到纯的胎儿成核红细胞。
Giemsa染色也可以用于分离其它介电性质相近的细胞。例如红细胞和白细胞的介电性质也十分接近。Giemsa染料与缓冲液(buffer)之比是在1∶100，染色时间超过30分钟的情况下，由于Giemsa染料只对细胞核染色，而红细胞没有细胞核，因此只有白细胞染色，这样，通过一个信号发生器，调节频率以及电压幅值，找到一个合适的频率和电压值，红细胞在这个设置下，表现为正向介电电泳，被捕捉到电极上；而染色的白细胞表现为负向介电电泳，被排斥到电场最弱的地方。通过利用介电电泳芯片和外加流体泵的作用，可以收集到白细胞。
整个介电电泳分离装置如图2所示，管道1与泵7之入口相连，泵7之出口通过管道8与盖片3入口相连，盖片3出口通过管道9与管道2相连。通过阀F1、F2、F3、F4的关断分别控制缓冲液(容器13中)、样品(容器12)、收集管10以及废液管11的流通。介电电泳芯片5与垫片4上之流体池构成一个反应腔，样品在里面进行分离。信号发生器6对介电电泳芯片5施加信号。其中，垫片4的高度在分离中起很重要的作用，适当的高度可以达到最佳的分离效果。高度过大，则细胞下落时间长，分离时间长；高度过小，则反应腔体积过小，分离时间也长。为达到快速、准确的分离效果，必须选择合适的流体池高度。如果高度过大，在流体上方的细胞就受不到介电电泳力，只有下落到介电电泳力的受力范围内，才与电极发生作用。因此许多细胞不经过分离就通过流体池。如果高度过小，则每次处理的液体量过少，分离时间加长。合适的流体池高度可以达到快速、准确的进行分离。同时，为了增大介电电场的范围，可以把该装置设计成三维结构，如图3所示。即用另一片介电电泳芯片14取代图2中的盖片3，并且在此介电电泳芯片14上钻两个孔，形成入口141和出口142，分别连通管道8和9。这样介电电场作用的高度大约增加一倍，垫片4的高度就可以相应的增加一倍，那么流体池的容量也可以增大一倍，大大缩短了分离时间。并且，垫片4中流体通道41的形状也与两介电电泳芯片5、14上之电极51、143的形状相对应，如图4所示，其中管道宽的区域(如图中所示参考编号411部)有电极作用，管道窄的区域(如图中所示参考编号412部)没有电极作用。这样，细胞经过的相应距离大大增加，又减少了细胞在没有电极作用区域的非特异性粘附，提高了分离效率。
介电电泳芯片上的电极(51或143)的形状可采用如图5A和图5B所示的构造；不同几何尺寸、形状的电极要和相应几何尺寸、形状的流体通道相对应，介电电泳芯片的电极形状也可以是别的形状(可参见中国专利申请号00122631.2，微流体系统中实体分子的操纵方法，2000年8月8日，发明人王小波，吴镭，程京等)。
本领域的专业人员应该理解，介电电泳芯片可以是常规介电电泳芯片，也可以是行波介电电泳芯片，微粒操纵介电电泳芯片，或者是它们的结合体以达到更好的分离、纯化结果。例如，如图6所示，可以通过利用行波介电电泳原理设计成多路细胞操纵开关，实现对母体红细胞、母体白细胞、母体成核红细胞以及胎儿成核红细胞的并行分离及检测。即经过Giemsa染色后，样品进入进样通道15。母体红细胞、母体白细胞没有染色，而母体成核红细胞以及胎儿成核红细胞被染色。施加适当的电信号，后两种细胞被收集到分支b2上，而前两种细胞被收集到分支b1上。对分支b2上的母体成核红细胞和胎儿成核红细胞进行针对胎儿成核红细胞的特异免疫染色反应，则二者从形态上可以区分，并且介电性质差别扩大。施加适当的电信号，就可以分别在分支b5、b6上得到母体成核红细胞以及胎儿成核红细胞，并且分支的结构适合进行单细胞操纵，即使经过染色后，二者介电性质仍很接近，可以通过单细胞操作，就可以分别把两种细胞分别收集到分支b5、b6上。同时在分支b1上，由于母体红细胞与母体白细胞形态上差别较大，可以施加适当的电信号，并且分支的结构适合进行单细胞操纵，就可以把两种细胞分别收集到分支b3、b4上。(参见中国专利申请号00129043.6，用于微粒操纵与微粒导向的装置及其使用方法，2000年9月27日，发明人王小波，杨卫平，许俊泉等)。这其中，分支管道的宽度具有很重要的意义。管道宽度应该与细胞直径处于一个数量级，这样便于进行单细胞操纵。
在染色之前，由于母体白细胞和胎儿成核红细胞介电性质十分接近，甚至在形态上十分接近，因此用介电电泳很难把二者分开。一旦染色后，由于细胞本身性质的不同，对色素吸收的效率不同，因此就有了不同的结果。本领域的技术人员应该理解，可以采用任何合适的染色方法对样品进行染色，以扩大细胞间的介电特性差异。染色方法的关键是特定的染料与缓冲液的浓度配比浓度、适当的染色时间下，介电性质相似的细胞对染料的吸收效率是不同的，从而造成一种细胞染色，一种不染色，二者之间的介电性质扩大。与常规的血细胞染色方法区别的是，整个染色过程都是在液体中进行的。常规的血细胞染色方法首先需要用甲醛、甲醇、乙醇等有机溶剂把细胞固定在玻片上，用蒸馏水洗涤、风干后用各种染色液对细胞进行染色。本发明中，需要对各种各样的染色方法进行改进。由于染色后需要对细胞进行介电分离，因此不能对细胞进行固定。染色的整个过程应该在溶液中进行。这样，产生的结果和常规结果就有差异。如果选定特定浓度、体积的染色液加入细胞样品中去，并且控制好染色时间，由于不同细胞对色素的吸收不同，不同的细胞有不同的染色结果，这样，染色结果与常规方法有了很大的区别，染色的细胞和没有染色细胞的介电性质有了很大的区别，可以利用介电电泳效应把它们轻易的分开。其它可以改进的常规的血细胞染色方法有吉姆萨(Giemsa)染色法、瑞氏(Wright)染色法、瑞氏-姬姆萨混合染色法、Romannowsky染色法(包括May-Grunwald染色法、Jenner染色法、Giemsa染色法、Leishman染色法)、核酸和硫氢基染色法(脱氧核糖核酸染色法、脱氧核糖核酸及核糖核酸染色法-即甲绿呱啷咛染色法)、多糖类染色法-(过碘酸-碱性复红反应)、脂类染色法(苏丹黑B染色法、酸性氧化苏木素染色法)、氧化酶及过氧化酶染色法(细胞色素氧化酶染色法、过氧化物酶染色法)、脱氢酶染色法(琥珀酸脱氢酶染色法、6-磷酸葡萄糖脱氢酶染色法)、碱性磷酸酶染色法(酸性磷酸酶染色法、抗酒石算酸性磷酸酶染色法)、酯酶染色法(特异性酯酶染色法、非特异性酯酶染色法)、酯酶双染色法、酯酶与玫瑰花结双标记染色法、5-核苷酸酶染色法(包括Naidoo染色法、Gomori和武内染色法、Washstein染色法)、β-葡萄糖苷酸酶染色法、环腺苷3’-5’-磷酸二酯酶染色法、热盐水溶解法、铁染色法、墨汁吞噬法(邓家栋，杨崇礼，杨天楹，血液病实验诊断，天津科学技术出版社，1983)。另外还包括特异的胎儿成核红细胞免疫染色方法，Kleihauer-Betke酸性洗脱反应(Bianchi Diana W.，et al.，Isolation of Fetal DNA fromNucleated Erythrocytes in Maternal Blood，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol 86，3279-3283，May 1990)。
由此，我们可以通过染色方法，从而在形态、细胞介电性质上把胎儿细胞和母体细胞分开，之后利用各种介电电泳芯片分离、富集、纯化到纯的胎儿细胞，最后通过常规分子生物学诊断实现对胎儿先天性遗传病快速、方便、准确的无创产前诊断。
综上所述，本发明之细胞分离方法，通过对细胞染色以扩大细胞之间性质的差异，再利用介电电泳分离方法，或是其它的细胞分离方法，即可实现细胞的分离。本发明之细胞分离方法还可以用于分离其它介电性质接近的细胞，例如从血液中分离癌细胞，同种细菌中不同类细菌(比如正常细菌与突变细菌)的分离和检测，等等；也可以用于其它在物理形态上的差异显示不明显的细胞之间的分离。
本发明之一种从怀孕母体血液样品中分离出其中所含之成核红细胞的方法，通过对细胞染色以扩大母体血液中所含细胞之间诸如介电性质、物理形态等性质上的差异，再利用介电电泳分离方法，或是其它的细胞分离方法，从而从母体血液样品中分离出母体成核红细胞与胎儿成核红细胞，以实现对孕妇、对胎儿的无创产前诊断。
本发明之一种将红细胞与白细胞分离的方法，该方法通过对细胞染色以扩大红细胞与白细胞的介电性质，从而将它们分离。
本发明之一种用于在密度梯度离心方法中收集细胞的离心管，利用该离心管进行细胞收集，操作简单，速度快，可以大大提高细胞收集效率，以加快细胞分离过程。
本发明之一种用于细胞分离的介电电泳分离装置，利用该分离装置可增大介电电场的范围，大大缩短细胞分离时间，实现对细胞的快速的介电电泳分离，以加快细胞分离过程。
权利要求
1.一种从样品中分离出所需细胞的方法，在进行细胞分离之前，在样品中加入细胞染料，对样品中的细胞进行染色。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的细胞染色过程是在液体中进行的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所需分离的细胞与样品中所含其它细胞具有接近的介电性质。
4.根据权利要求1或3所述的方法，在细胞染色后，利用介电电泳力对样品中的细胞进行分离，得到所需的细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，在细胞染色后，根据染色后的细胞呈现的不同形态，分离出所需的细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，利用介电电泳芯片分离样品中所需的细胞，由介电电泳芯片对样品中染色后的细胞施加介电电泳力。
7.根据权利要求6所述的方法，所述的介电电泳芯片包括常规介电电泳芯片、行波介电电泳芯片或基于行波介电电泳的颗粒操纵开关芯片。
8.根据权利要求1或5所述的方法，其中，细胞染色后，利用多路细胞颗粒操纵开关，分离出所需的细胞。
9.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述的细胞染料满足以下条件在适当的染料浓度和染色时间下，介电性质相近的细胞对于该染料的吸收效率不同，可导致一种细胞染色、另一种细胞不染色。
10.一种从母体血液样品中分离出其中所含之成核红细胞的方法，包括以下步骤(1)在母体血液样品中加入细胞染料；(2)利用介电电泳力对母体血液样品中的细胞进行分离，得到成核红细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，从所述的母体血液样品中分离出的成核红细胞包括母体自身的成核红细胞和胎儿成核红细胞。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，在母体血液样品中加入细胞染料之前，除去母体血液中的大部分红细胞。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，在母体血液样品中加入细胞染料之前，把母体血液样品加入到等渗的葡萄糖缓冲液中。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的葡萄糖缓冲液的电导率为10μs/cm到1.5ms/cm之间。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，所述的细胞染料为吉姆萨氏(Giemsa)染料。
16.根据权利要求10所述的方法，其中，所述的细胞染料为特异鉴别胎儿血红蛋白的染料。
17.根据权利要求10所述的方法，其中，将染色后的母体血液样品加入到介电电泳芯片上，由该介电电泳芯片对母体血液样品中的细胞施加介电电泳力以分离细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，采用一信号发生器对介电电泳芯片施加信号，使母体血液样品中的母体白细胞被捕捉到电极上，染色后的成核红细胞被排斥到芯片上电场最弱的地方。
19.根据权利要求10所述的方法，其中，利用多路细胞颗粒操纵开关，实现对母体血液样品中的母体红细胞、母体白细胞、母体成核红细胞、胎儿成核红细胞的并行分离及检测。
20.根据权利要求10所述的方法，其中，对染色后的母体血液样品进行一次以上的介电分离。
21.根据权利要求15所述的方法，其中，吉姆萨氏染料与缓冲液之配比为1∶5至1∶500。
22.根据权利要求10或21所述的方法，其中，染色时间为10秒至10分钟。
23.一种将红细胞与白细胞分离的方法，包括以下步骤(1)将含有红细胞和白细胞的样品加入到缓冲液中；(2)加入细胞染料，对样品中的细胞进行染色；(3)利用介电电泳芯片分离红细胞和白细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中的细胞染料采用吉姆萨染料，且染料与缓冲液之比为1∶5至1∶500。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中的染色时间为30分钟以上。
26.根据权利要求23所述的方法，其中，当样品中的细胞被染色后，通过一个信号发生器，调节频率以及电压幅值，找到一个合适的频率和电压值，红细胞在这个设置下，表现为正向介电电泳，被捕捉到电极上；而染色的白细胞表现为负向介电电泳，被排斥到电场最弱的地方，通过利用介电电泳芯片和外加流体泵的作用，可以收集到白细胞。
27.一种用于在密度梯度离心方法中收集细胞的离心管，该离心管中部之内径比其上部及下部更为窄细。
28.一种用于细胞分离的介电电泳分离装置，包括两片介电电泳芯片、一垫片、信号发生器、管道及泵，其中垫片置于两介电电泳芯片之间。
29.根据权利要求28所述的介电电泳分离装置，其中，在垫片上方的介电电泳芯片上设有入口孔和出口孔。
30.根据权利要求28所述的介电电泳分离装置，其中，垫片上流体通道的形状与电极的形状相对应。
31.根据权利要求28或30所述的介电电泳分离装置，其中，在垫片上之流体通道中，处于电极作用区域的管道口径宽于处于无电极作用区域的管道口径，以减少细胞的非特异性吸附。
全文摘要
本发明涉及一种从样品中分离出所需细胞的方法,是在进行细胞分离之前,在样品中加入细胞染料,对样品中的细胞进行染色。通过对细胞染色以扩大样品所含细胞之间诸如介电性质、物理形态等性质上的差异,再利用介电电泳分离方法,或是其它的细胞分离方法,即可实现细胞的分离。本发明之细胞分离方法还可以用于从怀孕母体血液样品中分离出其中所含之母体或胎儿的成核红细胞、分离红细胞与白细胞,以及分离其它介电性质接近的细胞等等。
文档编号G01N33/72GK1376779SQ0111001
公开日2002年10月30日 申请日期2001年3月22日 优先权日2001年3月22日
发明者荆高山, 张坚, 程京 申请人:北京博奥生物芯片有限责任公司, 清华大学