专利名称：一种海藻糖载入红细胞内的方法
技术领域：
本发明涉及一种海藻糖载入红细胞内的方法，特别是用电脉冲渗 透将海藻糖载入红细胞内的方法。
背景技术：
海藻糖是一种优良的冻干保护剂，当适当提高细胞内海藻糖浓度 时，可以提高细胞冻干后的存活率，因此人们希望提高细胞内海藻糖 的浓度。但由于细胞膜是一种非渗透性膜，对于海藻糖这种非渗透性 的物质很难进入细胞内部，即使能够用一般的方法载入，效果也不是 太理想。目前常用的方法主要有
1 、利用内吞作用(endocytosis)分别将海藻糖弓I入人间叶干细胞 (MSCs， mesenchymal stem cells)禾口血小板中。此方法载入量较少。
2、 利用转基因的葡萄状球菌a-溶血素，它是一种可打孔的蛋 白质，通过它产生横跨膜孔(transmembrane pores)来使细胞膜有可 逆的渗透性。此方法操作复杂且得到的样品量较少。
3、 Gyana提出一种有效的、方便的将海藻糖引入红细胞的方法， 我们称此法为"Gyana孵育法"。该方法利用红细胞膜的热力学特性 (thermal properties),在37。C条件下孵育7h可以将足量的海藻糖 载入红细胞内。在胞外海藻糖浓度为800mM时，胞内海藻糖浓度可以 达到34mM，溶血率为15%。此方法的载入效果比以前的方法都好，但 是耗时长，溶血率较大，并且载入效果有待进一步提高。
发明内容
为了解决上述方法中存在的操作烦琐、耗时长、实验样品量少、
载入效果不太明显等问题，本发明提出了一种通过电渗透的方法将海 藻糖载入红细胞内，通过选择合适的细胞外海藻糖浓度和控制电渗透 的参数，可以达到理想的载入效果。 本发明采用的技术方案
电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法
(1) 电渗透前细胞的处理
先将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，将红 细胞用等渗pH=7. 4的磷酸盐缓冲溶液以2500r/min离心5min，反复 洗涤3次，弃去上清液，得洗涤红细胞。将得到的洗涤红细胞与800mM 的海藻糖溶液以1:1. 5的比例混合均匀，得到红细胞溶液。
(2) 红细胞溶液的电脉冲渗透 将得到的加入了海藻糖的红细胞溶液取400微升放入间距为2mm
的电击杯中，将此电击杯放入电击池中，并将电脉冲渗透的参数设置 如下电压300v、脉宽lms、频率为1次/分钟，共四次。在此参数 下进行红细胞的电脉冲实验。
(3) 细胞内海藻糖浓度的提取 将经过电渗透的红细胞溶液用pH=7.4的等渗磷酸盐缓冲液以
2500r/min离心5min，反复洗涤3次，弃去上清液，得到电脉冲渗透 红细胞溶液。取电脉冲渗透过的红细胞溶液lml加入10%的三氯乙酸 3ml混合均匀，在8(TC恒温水浴箱中用生胶带密封加热lh后再以 3500r/min离心5min，收集上清液，如此提取3次，得到细胞内的海 藻糖的提取液。 本发明的技术效果
本发明的一种电渗透的载糖方法在红细胞中的使用，通过三氯 乙酸提取后，经过硫酸蒽酮法测定，细胞内的海藻糖浓度最高可高达
63. 68mM，与目前现有技术中报道的红细胞在细胞外海藻糖浓度为 800mM的"Gyana孵育法"的载糖浓度为34mM相比(测定方法同样是 硫酸蒽酮法)，得到了很大的提高，且此方法还具有操作方便，省时 省力的特点。
图1，海藻糖浓度与吸光度对应关系图；
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述，但不限制本发明。 实施例
电脉冲仪美国BTX公司BCM-830脉冲仪(电穿孔仪) 胞内海藻糖浓度的计算
(1) 海藻糖浓度与吸光度的关系图标准曲线的制作 取已知各浓度海藻糖的溶液lml加入2g/L硫酸蒽酮溶液4ml，
在冰水浴中摇匀冷却，沸水精确煮沸10min，再用流水冷却10min。 在625nm处以空白管调零，用lcm光径的比色皿测定各管吸光度值， 绘制海藻糖浓度与吸光度的关系，见附图l。
(2) 细胞内的海藻糖浓度计算 用标准曲线方法测定出提取液中的海藻糖浓度，按照如下公式计
算出细胞内的海藻糖浓度
其中 <formula>formula see original document page 5</formula>
Ci——细胞内海藻糖浓度，mmol/L, C一萃取液中海藻糖的浓度，m——海藻糖的分子量，取378. 33g/mol， n——红细胞的计数，xl0(12)/L, V——红细胞的平均体积，fL，
Vb——红细胞不可渗透体积，fL，根据文献报道取值为55. 21%V
利用电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法
(1) 电渗透前细胞的处理
先将健康人新鲜血液以2500r/min离心5min,弃去血浆及白膜， 将红细胞用等渗pH=7. 4的磷酸盐缓冲溶液以2500r/min离心5min， 反复洗涤3次，弃去上清液，得洗涤红细胞。将得到的洗涤红细胞与 800mM的海藻糖溶液以1:1.5的比例混合均匀，得到红细胞溶液。
(2) 红细胞溶液的电渗透 将得到的加入了海藻糖的红细胞溶液取400微升，放入间距为
2mm的电击杯中，将此电击杯放入电击池中，并将电脉冲渗透的参数 设置如下电压300v、脉宽lms、频率为1次/1分钟，共4次。在 此参数下进行红细胞的电脉冲实验。
(3) 细胞内海藻糖浓度的提取 将经过电渗透的红细胞溶液用PH=7. 4的等渗磷酸盐缓冲液溶液
以2500r/min离心5min，反复洗涤3次，弃去上清液，得到电渗透 红细胞溶液。取电渗透过的红细胞溶液lml加入10%的三氯乙酸3ml 混合均匀，在8(TC恒温水浴箱中用生胶带密封加热lh后再以 3500r/min离心5min，收集上清液，如此提取3次，得到细胞内的海 藻糖的提取液，细胞内海藻糖浓度的最大值为63. 68mM。
本发明的电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法与目前现有 技术中报道的红细胞在细胞外海藻糖浓度为800mM的"Gyana孵育 法"的载糖浓度为34raM相比，载入效果得到了很大的提高，且此方 法还具有操作方便，省时省力的特点。
权利要求
1、一种利用电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法，其特征在于含有如下操作步骤(1)电脉冲渗透前细胞的处理将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，将红细胞用pH＝7.4的等渗磷酸盐缓冲溶液在离心机中以2500r/min离心5min，反复洗涤3次，弃去上清液，得红细胞，将此红细胞与配置好的海藻糖浓度为800mM、KCl为5mM的溶液以1:1.5的体积比混合均匀，得到红细胞溶液；(2)电脉冲渗透控制参数的选择取上述步骤(1)中所得的红细胞溶液400微升，放入间距为2mm的电击杯中，将此电击杯放入电击池中，并设定电脉冲渗透时的控制参数为电压300v、脉宽1ms、频率1次/1分钟，共四次；(3)电脉冲渗透后红细胞的处理将上述步骤(2)中经过电脉冲渗透过的红细胞溶液，用pH＝7.4的等渗磷酸盐缓冲液以2500r/min离心5min，反复洗涤3次，弃去上清液，得到载入海藻糖的红细胞悬浊液。
全文摘要
本发明涉及一种电脉冲渗透将海藻糖载入红细胞内的方法。包括电脉冲渗透前细胞的处理，即将新鲜血液离心，弃去血浆及白膜，用pH＝7.4的等渗磷酸盐缓冲溶液在离心机中离心，洗涤，弃上清液，再与配置好的海藻糖以一定的体积比混合均匀，得到红细胞溶液，取一定量，放入电脉冲仪的电击杯中，进行电脉冲渗透，控制电压300v、脉宽1ms、频率1次/1分钟，共四次，经过电脉冲渗透过的红细胞溶液，用pH＝7.4磷酸盐缓冲液洗涤三次得到电脉冲载糖溶液，并测得细胞内的海藻糖浓度达到63.68mM。与目前较好方法为高渗法(细胞外的海藻糖浓度为800mM时，载入的效果为34mM)相比，本发明方法的海藻糖载入浓度明显的提高了，从而有利于红细胞的冻干保存。
文档编号C12N5/078GK101381705SQ20081020142
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月21日 优先权日2008年10月21日
发明者刘宝林, 刘建峰, 周国燕, 周新丽, 晨 宋, 骥 袁, 焕 黄 申请人:上海理工大学