专利名称：红球菌、其脂肽类胞外生物破乳剂、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于石油化工和工业微生物领域。
背景技术：
目前我国油田大多采用注水的方式开采原油，因此在原油开采过程中，采出原油中往往含有一定量的水。原油脱水的方法有很多，如离心、加热、电脱水和添加化学破乳剂等。由于操作方便，且不需要专门的设备，以化学破乳为核心的原油脱水方法在国内石油工业中得到了最广泛的应用。但使用化学破乳剂存在破乳剂投加量大、破乳效果欠佳、适应性差、对环境污染严重等诸多问题。因此，从减少污染和保护环境的角度考虑，需要找到一种更加清洁的破乳剂来代替化学破乳剂。利用具有破乳作用的生物表面活性剂进行破乳就是一条可行的途径。 采用生物表面活性剂破乳有以下优点(1)微生物新陈代谢所产生的生物表面活性剂具有独特的结构和功能，并且具有易降解、对环境污染小的特点；(2)投加生物破乳剂可大大提高破乳的效果；(3)微生物发酵工艺简便，成本低廉，将使脱水工艺的运行费用降低；(4)生物破乳剂的适应性广，可在极端环境条件(高温、高盐、强酸强碱等)下应用。
过去的二十多年来，国外研究者对产生物表面活性剂的微生物及其破乳性能进行了细致的研究。他们从菌种采集开始，通过分离纯化、富集培养逐步从自然界筛选出具有强破乳能力的菌种，并对菌种培养条件、破乳操作条件、乳化液含水量以及乳化液种类等诸多影响因素进行了实验研究。从目前的研究结果来看，具有破乳作用的生物表面活性剂有两大类一类是在培养过程中分泌到培养基中的胞外产物，另一类是与细胞壁结合的产物。在实验室研究中，通常用含有生物破乳剂的微生物全培养液进行破乳试验，研究其破乳效果和影响因素。尽管采用全培养液进行破乳可以节省产物提取的成本，但其中含有的剩余培养基、其它代谢产物等可能会对脱出水和油的品质产生影响。此外，未经处理的全培养液体积较大且不易保藏，其运输和保存也是较难解决的问题。而将产物提取出来，就会增加生产成本。相比而言，胞外生物破乳剂的提纯成本要远低于胞壁结合型的生物破乳剂。
发明内容
针对以上问题，本发明旨在研究一种脂肽类胞外生物破乳剂，以解决投加全培养
液时对油品质量的影响和胞壁结合型产物提取成本高的问题。 本发明采用以下技术方案以实现上述发明目的。 本发明目的之一涉及一种红球菌(Rhodococcus sp.)，该菌株现以超低温冻结的方式保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2008年9月12日，保藏编号CGMCCNo. 2667，分类命名红球菌。 培养权利要求1所述红球菌的方法，特征在于采用肉汤培养基，各组分的质量比为牛肉膏培养基4. 5-5. 5份，蛋白胨9. 5-10. 5份，葡萄糖4. 5-5. 5份，NaCl 4. 5-5. 5份，
3水1000份，pH7. 0，或者采用石蜡培养基，各组分的质量比为NH4N03 3. 5_4. 5份，K2HP04
3. 5-4. 5 &、，KH2P045 . 5—6 . 5 &、，MgS04 *7H20 0. 1—0. 3 &、，CaCl2 *2H20 0. 8—1. 2 &、，FeS04 *7H200. 8-1. 2份，EDTA 0. 8-1. 2份，液体石蜡4% (V/V)，水1000份，pH 7. 0 ;在温度为30_40°C，转速为120-160rpm的摇床中培养。 上述红球菌的全培养液作为脂肽类胞外生物破乳剂的应用。 制备脂肽类胞外生物干粉破乳剂的方法，将上述红球菌的全培养液在8000-12000rpm下离心15-25min，去除菌体，清液用酸溶液调pH至1. 5-2. 5，在0-4。C下静置，得到絮状沉淀，于8000-12000rpm下离心15_25min，弃去清液，得到的絮状沉淀即为初产物；初产物经冷冻干燥后，得到生物干粉破乳剂。 上述生物干粉破乳剂的应用，将生物干粉破乳剂用碱性溶液溶解，并将pH调至7. 0后用蒸馏水配成使用浓度90 200mg/L，使用温度在35 6(TC之间，使用时间在18-36小时之间。 本发明还涉及该红球菌的筛选方法。
菌株的筛选以胜利油田的含油污泥作为筛选源，加入下述培养基中(L—0 :NH4N03
4. Og， K2HP04 4. Og， KH2P04 6. Og，原油4% (V/V) ， MgS04 7H20 0. 2g， CaCl2 2H20 1. Og，MnS041.0g，EDTA 1.4g，pH = 7.0。以7天为一个周期，转接3个周期后，从中筛得一株能产生脂肽类胞外生物破乳剂的红球菌。 本发明还涉及该脂肽类胞外生物破乳剂的应用方法。将生物破乳剂用碱性溶液溶解，并将PH调至7. 0后用蒸馏水配成使用浓度，破乳试验的温度为35 60°C ，投加量为90 200mg/L。
本发明的优点如下 1.胞外生物破乳剂的提取过程方便，成本较低，解决了胞壁结合型生物破乳剂提取成本高的问题。 2.提取得到的胞外生物破乳剂干燥后占用体积小，解决了全培养液运输和保藏上的难题。 3.筛选到的红球菌为土著菌种，破乳能力强。
图1为本发明的红球菌经革兰氏染色后的显微镜照片； 图2为本发明的红球菌的肉汤培养物对W/0型煤油模型乳状液的破乳试验结果；
图3为本发明的红球菌的肉汤培养物对0/W型煤油模型乳状液的破乳试验结果；
图4为本发明的红球菌的石蜡培养物对W/0型煤油模型乳状液的破乳试验结果；
图5为本发明的红球菌的石蜡培养物对0/W型煤油模型乳状液的破乳试验结果；
图6为本发明的红球菌在肉汤培养基中生成的生物破乳剂対W/0型煤油模型乳状液的破乳试验结果； 图7为本发明的红球菌在石蜡培养基中生成的生物破乳剂对W/0型媒油模型乳状液的破乳试验结果； 图8为本发明的生物破乳剂应用于海洋采出厂稀油采出液的破乳试验结果。
具体实施例方式红球菌的筛选 取5g胜利油田的含油污泥投加至lOOmL下述培养基中(L—0 :NH4N03 4. 0g， K2HP044. 0g， KH2P04 6 . 0g，原油4% (V/V) ， MgS04 7H20 0. 2g， CaCl2 2H20 1. 0g， MnS04 1. 0g， EDTA1.4g，pH= 7.0。在温度为35t:，转速为140rpm的摇床中培养，以7天为一个周期，转接培养3个周期后，通过稀释涂布法从中成功分离到一株能产生脂肽类胞外生物破乳剂的红球菌，其革兰氏染色后的显微镜照片见图l(图中菌株的放大倍数为iooo倍)，该红球菌的编号为S-SL-2。
红球菌的培养 这株红球菌在肉汤培养基和石蜡培养基中都能生长，并产生胞外生物破乳剂。肉汤培养基的配方如下(L—0 :牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g， NaCl 5. Og， pH 7.0。石蜡培养基的配方如下(L—0 :NH萬4. Og， K2HP04 4. Og， KH2P04 6. Og， MgS04 7H20 0. 2g，CaCl2 2H20 1. Og， FeS04 7H20 1. Og， EDTA 1. 4g，液体石蜡4% (V/V) ， pH 7. 0。培养条件均为在温度为35t:，转速为140rpm的摇床中培养。
生物破乳剂的提取与鉴定将全培养液在10000rpm下离心20min，去除菌体，上清液用6mol/L的HC1调pH至
2. 0，在4t:下静置24h，再于10000rpm下离心20min，弃去上清液，得到的絮状沉淀即为初产
物。初产物经冷冻干燥24h后，质量损失80% -90%，得到最终的生物破乳剂。 将生物破乳剂配成浓度为6. 25g/L的氯仿溶液，以氯仿_甲醇_水(65 : 25 : 4)
为展开剂进行薄层层析，可使茚三酮显色剂显紫红色，鉴定为脂肽类生物破乳剂。 煤油模型乳状液的配制 以煤油和蒸馏水混合配制煤油模型乳状液。煤油与水以体积比2 : 3混合，以司盘80为乳化剂，投加量为煤油的1. 67% (V/V)，在10000r/min下搅拌3min，制得W/0型乳状液。煤油与水以体积比3 : 2混合，以司盘60和吐温60为乳化剂，投加量分别为水的0. 075%、0. 175% (V/V)，在10000r/min下搅拌3min，暂停30s后再搅拌3min，制得0/W型
乳状液。 实施例1 : 肉汤培养物对煤油模型乳状液的破乳效果 将筛选得到的红球菌S-SL-2接入肉汤培养基，于温度为35t:，转速为140rpm的摇床中培养3天，其全培养液在10000rpm离心20min，倒出上清液，离心菌体用蒸馏水悬浮还原至原始体积制成菌悬液，在W/0、 0/W型煤油模型乳状液中分别投加全培养液、上清液、菌悬液，比较三者的破乳效果，并与未投加任何样品和空白肉汤培养基的破乳效果做比较，破乳试验的温度为35t:，投加量均为10% (V/V)，结果见图2、图3。 从图2中可以看出，全培养液、上清液、菌悬液对W/0型煤油模型乳状液24h的破乳率分别为94. 1%、98.6%和18.2%，而空白和肉汤培养基24h的破乳率均不高，分别为12. 0%和55. 5%，可见S-SL-2的上清液中含有能使煤油模型乳状液破乳的胞外生物破乳剂。 从图3中可以看出，S-SL-2肉汤培养物对0/W型煤油模型乳状液24h的破乳率均未超过40% 。 S-SL-2对W/0型煤油模型乳状液的破乳效果优于0/W型煤油模型乳状液。
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实施例2: 石蜡培养物对煤油模型乳状液的破乳效果 将筛选得到的红球菌S-SL-2接入石蜡培养基，于温度为35°C ，转速为140rpm的摇床中培养7天，其全培养液在lOOOOrpm离心20min，除去上层剩余石蜡、中层液后，离心菌体用蒸馏水悬浮还原至原始体积制成菌悬液，在W/0、 0/W型煤油模型乳状液中分别投加全培养液、中层液、菌悬液，比较三者的破乳效果，并与未投加任何样品的破乳效果做比较，破乳试验的温度为35t:，投加量均为10% (V/V)，结果见图4、图5。 从图4中可以看出，全培养液、中层液、菌悬液对W/0型煤油模型乳状液24h的破乳率分别为88. 2%、93. 2%和49. 7%，而空白24h的破乳率为12. 5%，可见S-SL-2的中层液中含有能使煤油模型乳状液破乳的胞外生物破乳剂。 从图5可以看出，全培养液、中层液、菌悬液对0/W型煤油模型乳状液24h的破乳率分别为73. 2% 、40. 5%和49. 6%，与W/0型煤油模型乳状液相比，中层液的破乳率下降了52. 7%。
实施例3 : 生物破乳剂对W/0型煤油模型乳状液的破乳效果 将S-SL-2在肉汤培养基和石蜡培养基中得到的上清液和中层液，分别用6mol/L的HC1调pH至2. 0，在4t:下保存过夜，再于10000rpm下离心20min，弃去上清液，得到以絮状沉淀形式析出的初产物，经冷冻干燥24h后，得到最终的生物干粉破乳剂。用少量碱性溶液将生物破乳剂溶解，并用NaOH将pH调至7. 0后用蒸馏水配成使用浓度。试验不同投加量时生物破乳剂的破乳效果，结果见图6、图7。 从图6中可以看出，从肉汤培养基中提取的生物破乳剂随着投加量的増加，对W/0型煤油模型乳状液的破乳率提高，投加量为100mg/L时，24h破乳率达到89. 1%。
从图7中可以看出，从石蜡培养基中提取的生物破乳剂对W/0型媒油模型乳状液的破乳率亦随着投加量的增加而增加，当投加量超过100mg/L时，继续加大投加量对破乳率提高的作用不明显，24h的最大破乳率为73.6%，破乳效果差于肉汤培养基中提取的生
物破乳剂。 实施例4: 将本发明的生物破乳剂应用于海洋采出厂稀油采出液的破乳 胜利油田海洋采出厂的采出液属W/0型稀油乳状液，含水率为10%。在6(TC条件
下，在采出液中分别投加从肉汤全培养液中提取的生物破乳剂、从石蜡全培养液中提取的
生物破乳剂，以及现场使用的聚醚类化学破乳剂，投加量依次为90mg/L、140mg/L和110mg/
L，其中化学破乳剂的投加量为海洋采出厂实际投加量的2倍，试验结果见图8。 从图8中可见，6.5h后，未投加任何破乳剂的空白样非常稳定，未脱出任何水，而
化学破乳剂的投加量虽已提高至实际投加量的2倍，但破乳率仅为26. 7%，从肉汤和石蜡
全培养液中提取的生物破乳剂的破乳效果明显优于化学破乳剂，6. 5h的破乳率分别达到
62. 5%和60. 0%。
权利要求
一种红球菌Rhodococcus sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2008年9月12日，保藏编号CGMCC No.2667。
2. "培养权利要求1所述红球菌的方法，特征在于采用肉汤培养基，各组分的质量比为牛肉膏4. 5-5. 5份，蛋白胨9. 5-10. 5份，葡萄糖4. 5-5. 5份，NaCl 4. 5-5. 5份，水1000份，pH 7. 0，或者采用石蜡培养基，各组分的质量比为:琴03 3 . 5-4. 5份，K2HP043. 5_4. 5份，KH2P04 5 . 5—6 . 5份，MgS04 7H20 0. 1—0. 3份，CaCl2 2H20 0. 8—1. 2份，FeS04 7H20 0. 8—1. 2份，EDTA0. 8-1.2份，液体石蜡4% (V/V)，水1000份，pH 7. 0 ;在温度为30_40°C ，转速为120-160rpm的摇床中培养。
3. 权利要求1所述红球菌的全培养液作为脂肽类胞外生物破乳剂的应用。
4. 制备脂肽类胞外生物干粉破乳剂的方法，特征在于将权利要求1所述红球菌的全培养液在8000-12000rpm下离心15_25min，去除菌体，清液用酸溶液调pH至1. 5_2. 5，在0-4t:下静置，得到絮状沉淀，于8000-12000rpm下离心15_25min，弃去清液，得到的絮状沉淀即为初产物；初产物经冷冻干燥后，得到生物干粉破乳剂。
5. 根据权利要求4所述的生物干粉破乳剂的应用，特征在于将生物干粉破乳剂用碱性溶液溶解，并将pH调至7. 0后用蒸馏水配成浓度90 200mg/L的溶液使用，使用温度在35 6(TC之间，使用时间在18-36小时之间。
全文摘要
本发明涉及一株红球菌(Rhodococcus sp.)，及其培养产生的脂肽类胞外生物破乳剂及其应用。该生物破乳剂投加量为100～200mg/L，破乳试验温度为35℃时，可使W/O型煤油模型乳状液24h的破乳率达到72.7％～89.1％。将生物破乳剂应用于胜利油田海洋采出厂的稀油采出液，投加量为90～140mg/L时，6.5h破乳率达到60.0％～62.5％，远优于现场使用的化学破乳剂。胞外生物破乳剂提取方便，生产成本低，易保藏、运输，可解决投加全培养液时对油品质量的影响和胞壁结合型产物提取成本高的问题。
文档编号C12N1/20GK101724579SQ20081020123
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月15日 优先权日2008年10月15日
发明者刘佳, 周琪, 徐竟成, 李光明, 谢良林, 闻岳, 陆丽君, 黄翔峰 申请人:同济大学