利用家蚕细胞表达抗菌肽apidaecin和制备抗菌肽apidaecin的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种利用家蚕细胞表达抗菌肽apidaecin和 制备抗菌肽apidaecin的方法。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽是由生物体基因之间编码产生的一类能抵抗外界病原体感染的小分子肽， 具有理化性质稳定、无免疫原性、抗菌谱广等特性，其抗菌活性和抗菌效应与抗生素非常接 近，在替代抗生素方面显示了巨大的潜力。apidaecin是一类富含脯氨酸的抗菌肽，由于其 独特的抑菌作用机制而备受关注，研究表明，apidaecin能特异地作用于革兰氏阴性菌，对 大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌和乙酸钙不动杆菌等致病菌均具有普遍的杀伤作用。因 此，apidaecin对解决因革兰氏阴性菌而导致的抗生素抗性危害不断加重的问题具有特殊 意义。
[0003] 目前，抗菌肽可通过以下途径获得：1、从生物体提取纯化；2、化学合成；3、基因工 程，其中前两种方法由于成本和技术问题，不适于抗菌肽的工业化生产，基因工程方法是目 前最有潜力的途径。Apidaecin已在多种不同的宿主中表达，如链霉菌、乳酸乳球菌等，这些 制备apidaecin的方法普遍存在着表达量低、成本昂贵，无法达到实际应用的要求等问题。
[0004] 杆状病毒表达系统自建立之后，就得到了迅速的发展和广泛的应用。与其他表达 系统相比，杆状病毒表达系统具有以下特点：安全性好，表达产物后加工比较完全，可容纳 较大的DNA片段，适合表达细胞毒性蛋白，最大的特点是外源蛋白表达量高，若以家蚕幼虫 或蛹做为生物反应器，还有下列优点：
[0005] (1)蚕体中有多种天然蛋白保护剂，对表达产物有保护作用，与昆虫细胞内的表达 相比，家蚕体内表达水平往往高出100-1000倍。
[0006] (2)家蚕遗传背景清楚，且饲养的成本低，桑叶饲养的家蚕仅0. 5元/条，用家蚕生 成外源蛋白容易产业化。
[0007] (3)利用家蚕作为生物反应器，具有我国资源优势和特色，容易形成自主产业。
[0008] (4)由于蚕蛹本身可以食用，所以家蚕作为生物反应器有望开拓新的应用领 域，如口服药物，口服疫苗等，张耀洲等发现含有重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)的蚕蛹经离心、脱脂、纯化、冻干之后，经剂型加工制成口服药。该药给药于白细胞 缺少的动物模型或因化疗等原因造成的白细胞减少病人，有很强的生白效果，这些冻干蚕 蛹蛋白质在对小鼠和猕猴的长短期毒理安全性试验中均未发现异常。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用杆状病 毒表达系统在家蚕细胞内安全、高效地表达抗菌肽apidaecin的方法。
[0010] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种产量高的抗菌肽apidaecin的制 备方法。 toon] 本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种利用家蚕细胞表达抗菌肽 apidaecin的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0012] (1)化学合成如SEQ ID NO. 1所述的AP2基因，并在该AP2基因的5'端加上肠激 酶酶切位点序列，并克隆入pFastBacHta，构建重组质粒pFast_His_AP2,该质粒表达His融 合的AP2 ;
[0013] (2)将步骤（1)所得的重组质粒pFast-His-AP2转化BmDHlOBac感受态细胞；
[0014] (3)经蓝白斑筛选，挑取含有重组Bacmid的白色菌落，抽提重组BmBacmid基因；
[0015] (4)将步骤（3)所得的重组BmBacmid基因转染BmN培养细胞并进行培养，培养过 程中当观察到细胞感染时，将BmN培养细胞培养液离心收集感染上清，得到重组病毒；
[0016] (5)将步骤（4)所得的重组病毒上清继续感染BmN培养细胞，感染72小时候，分别 收集感染BmN培养细胞和培养上清，将收集到的感染BmN培养细胞悬浮于昆虫细胞裂解液， 冰上超声裂解，离心取上清得表达产物，该表达产物为带His融合的AP2融合蛋白。
[0017] 上述方案中，蓝白斑筛选使用的培养基为含卡那霉素、庆大霉素、四环素的固体培 养基。
[0018] 本发明解决第二个技术问题所采用的技术方案为：将按第一个技术方案所述的利 用家蚕细胞表达抗菌肽apidaecin的方法制得的带His的AP2融合蛋白用His亲和层析进 行洗脱纯化，洗脱液在肠激酶酶解缓冲液中透析过夜后，用5kDa的过滤膜浓缩，所得浓缩 液中加入EK后再25°C酶切过夜，酶切溶液即为AP2的粗制品。
[0019] 洗脱纯化过程中，在漂洗缓冲液中依次加入5mM、IOmM和20mM的咪唑，使得洗脱液 中咪唑的终浓度为400mM，层析过程中加入竞争性咪唑缓冲液可有效减少非特异性结合，提 高层析产物纯度。
[0020] 上述方案中在纯化和浓缩所述AP2的粗制品的每一步中均加入终浓度为0. 5mM的 PMSF，可有效防止蛋白质制品在纯化过程中降解。
[0021] 与现有技术相比，本发明的优点在于：利用杆状病毒表达系统在家蚕BmN培养细 胞表达抗菌肽apidaecin可有效增加表达产量，同时家蚕细胞中有多种天然蛋白质保护 齐?，可对表达产物进行有效表达，使得基因表达产物十分稳定，提高表达安全性。
【附图说明】
[0022] 图1为实施例1中大肠杆菌BmDHlOBac细胞内发生的转座示意图；
[0023] 图2为实施例1中PCR方法确认转座发生的原理示意图；
[0024] 图3为实施例3中重组蛋白酶切处理效果示意图。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0026] 材料：
[0027] BmNPV Bac-to-Bac快速表达系统由浙江大学动物科学学院吴小锋教授研究室开 发并保存，主要包括已被转化BmNPV Bacmid和辅组质粒的感受态细胞BmDHIOBac、供体质 粒 pFastBacHTa, b, c 等；
[0028] AP2基因片段由上海生工生物工程有限公司合成并克隆入pFastHta ;
[0029] 家蚕培养细胞BmN细胞由吴教授研究室保存；
[0030] 培养家蚕培BmN细胞培养基为TC-100，添加10 %的胎牛血清(杭州四季青生物工 程材料有限公司）；
[0031] DNA转染试剂Lipofectin、各种抗生素以及DH5 a、DHlO β菌株等均购自 Invitrogen ；
[0032] LB液体培养基由0. 5g蛋白胨，0. 25g酵母提取物，0. 5g氯化钠，加50ml水配置而 成；
[0033] LB固体培养基由0· 5g蛋白胨，0· 25g酵母提取物，0· 5g氯化钠，Ig琼脂，加50ml 水配置而成；
[0034] 昆虫细胞裂解液由 IOmM Tris. Cl, 130mM NaCl，1%(V/V)Triton X-100, IOmM NaF, IOmM磷酸钠，IOmM焦磷酸钠，pH7. 5,过滤除菌制得，使用前加入蛋白酶抑制剂PMSF ;
[0035] 肠激酶酶解缓冲液由20mM tris，IOOmM NaCl配制而成，PH7. 8。
[0036] 实施例1 :质粒和重组病毒的构建
[0037] 化学合成AP2基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，并在目的片段的上 游引入肠激酶酶切位点序列（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)。合成的DNA片段直接克隆到质粒 pFastBacHta中，构建重组质粒pFast_His_AP2,该质粒表达His融合的AP2。
[0038] 将重组质粒转化入BmDHlOBac感受态细胞，具体步骤为：将10 μ 1重组质粒连接 混合物加入到200 μ 1感受态细胞中，混匀，冰上放置30min，置于42°C水浴热击45s，迅速 置于冰上2min，然后加入800 μ I S. 0. C培养基中，37°C摇床振摇4h，取部分稀释菌液涂布 在含有卡那霉素（50μ g/ml)、庆大霉素（7μ g/ml)、四环素（10μ g/ml)、X-gal和IPTG的 LB培养板上，37°C培养48h，重组质粒进入大肠杆菌BmDHlOBac细胞后，在转座子的帮助下， 外源基因转座进入大肠杆菌BmDHlOBac中的BmBacmid转座位点中。由于转座祀位点位于 LacZa基因片段内部，转座发生后，于LacZa基因的阅读框被打破，使转座发生前后的大 肠杆菌BmDHlOBac在X-gal的作用下显示出不同的颜色(蓝色、白色)。如图1所示，转座时， 左边质粒中虚线框内的是转座子部分，其中包括外源基因 AP，整个转座子原件在大肠杆菌 BmDHlOBac内特异性的插入到BmBacmid中的转座祀位点中，从而完成外源基因到杆状病毒 基因组的整合。
[0039] 在含有100~200个菌斑的培养板上挑选约10个白色菌落，接着在新的培养板