一种高表达cxcr5的间充质干细胞及其制备和用图
【专利摘要】一种高表达CXCR5的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)及其制备方法和用途。过表达CXCR5，可以使MSCCXCR5在体内定向迁移至炎症区域发挥免疫调节的能力，而不是随机散乱分布在体内各个部位。用这种间充质干细胞治疗疾病将更有靶向性和有效性，将有效提高MSC的治疗效果。
【专利说明】
-种高表达CXCR5的间充质干细胞及其制备和用途
技术领域
[0001 ] 本发明设及一种高表达CXCR5的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)及 其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)，是最早从骨髓中发现的一种非造 血类的干细胞(Friedenstein，A.J.，et al，1974)，参与构成骨髓造血微环境，对造血干细 胞的增殖与分化具有明显支持作用(Mendez-Fe;rre;r，S.，et al. ,2010) eMSC广泛分布于全 身各个组织和器官，除骨髓外，还可W从厮带，厮血，牙銀，骨骼肌等分离得到。MSC还有向成 骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，屯、肌细胞等分化的能力。MSC缺乏特异性标志物，主要表达 〔029、〔044、〔073、〔090、〔0105和〔0166等间质标志物，不表达〔01化、〔014、〔019、〔0：34、〔045 等造血相关标志物;不表达或低表达HLA-I类分子，不表达HLA-II类分子。
[0003] 近年来MSC独特的免疫调节作用引起了越来越多关注。体外实验表明，MSC可抑制 特异性刺激的混合淋己细胞反应(MLR)中或者非特异性的丝裂原植物凝集素 (PHA)刺激诱 导的T淋己细胞的增殖(Di Nicola，M.，et al.，2002)dMSC能诱导调节性T细胞(Treg)的扩 增，抑制杀伤性Τ细胞的细胞毒功能(Aggarwal，S.，et al.，2005) dMSC能影响B细胞的活化、 增殖、趋化W及其抗体的产生(Corcione，A.，et al.，2006)dMSC能抑制DC的生成，增殖，阻 断DC的成熟和分化，从而减弱DC的抗原提成能力(Beyth，S.，et al.，2005)eMSC能强烈抑制 IL-2活化的NK细胞的增殖，细胞因子的分泌及其杀伤功能。MSC调控免疫细胞的机制尚不完 全清楚，其免疫调节作用不受血K限制，存在直接接触作用方式W及分泌可溶性因子转化生 长因子-β(transforming growth facto;r-0,TGF-0)、白细胞介素 -10(interle址in-10,化- 10)、前列腺素 E2(p;rostaglandin E2,PGE2)、肝细胞成长因子化epatoc}fte growth factor ,HGF)、肿瘤坏死因子α刺激基因 -6(tumornecrosis factor-astimulated gene-6, TSG-6)等发挥作用(Gebler，A.，0.Zabel and B.Seliger，2012)。由于MSC易于分离扩增，免 疫原性低，具有旁分泌和免疫调节的功能，所WMSC在细胞治疗方面应用前景广阔。目前间 质干细胞的临床试验有600多项(April 2015，clinicaltrials.gov)，适应症包括自身免疫 病、移植排斥、骨/软骨疾病、屯、血管疾病、神经系统疾病等。
【申请人】在前期工作中治疗慢性 移植物抗宿主病的有效性证实了MSC对疾病的免疫调节功能(Peng,Y.，et al. ,2015)。据报 道，MSC还可用于治疗多发性硬化症化i，J.F.，etal.，2014)，溃瘍性结肠炎(Duijvestein， Μ.,et al.,2010)，糖尿病(Holmes,et al.,2014)等。
[0004] 然而我们发现，在临床治疗中，效果有时并不理想。有些研究者认为虽然MSC在体 夕巧很好的免疫调节功能，例如能够有效抑制T细胞增殖等，但静脉输注的MSC并不能完全 治疗小鼠 cGV皿(Sudres M.et al. ,2006);另一些研究者称MSC在治疗肝脏损伤时，发现聚 集在损伤部位的MSC数量少，并认为运可能是MSC治疗效果局限的主要原因 （Gao J. etc, 2001);还有研究者通过示踪发现MSC进入体内后散乱地分布在各个器官，例如肺、肝、骨髓 等等(Paul Lin.et al. ,2013)，相当于MSC在体内"被稀释"，真正到达关键部位发挥作用的 MSC数量并不可观，那么发挥的免疫调节功能也将大打折扣。所W，MSC在临床治疗中面临的 主要问题是MSC输注后在体内无序地分布。
[0005] 趋化因子在疾病发生发展的过程中至关重要，而MSC表面表达的趋化因子受体有 很多，如CCR1，CCR4，CCR6，CCR7，CCR9，CCR10，CXCR4，CXCR5，CXCR6，CX3CR等，不仅本身表达 量低，并且在扩增传代之后，MSC几乎不再表达运些受体(Sarkar，D.，et al.，2011)。而骨髓 中MSC的含量仅仅占0.001-0.01%，健康捐献者一次捐献的骨髓分离出原代MSC数量有限， 一般治疗cGVHD病人一次输注的细胞量为每公斤体重0.4-9 X106个，一次治疗所需的细胞 量就达约0.2-4.5 X 108个。所W，MSC体外大量扩增是目前为达到临床应用中所需的细胞量 的基本方法。运就可能由于MSC受体表达的丢失，造成治疗的不稳定性。
[0006] 现在很多研究工作者将提高MSC治疗的祀向性作为研究方向：如用病毒转染的方 法过表达CXCR4,促进MSCs向大脑损伤部位趋化(Wang，Z.，et al. ,2015);用IGF-1预处理 MSCs，增加 MSCs上CXCR4的表达(Xinaris，C.，et al. ,2013);通过增加粘附分子PS化-1和 SLeX，增强MSCs向炎症内皮细胞的黏附能力化evy，0.，et al.，2013);将MSC上CD44分子转 化为E-selectin/X-selectin，增加 MSCs向骨髓的趋化（Sackstein,R. ,et al. ,2013)等等。
[0007] 趋化因子CX化13在炎症反应中起到重要作用，例如在自身免疫性滑膜炎的炎性滑 膜液中检测到CX化13的mRNA高表达(William H，et al. ,2013);在小鼠回肠炎的疾病模型 中，也发现了在炎症部位高表达趋化因子CXCL13(A Viej〇-Borbolla，et al.，2010);在神 经莱姆病中，脑脊液中的CX化13含量甚至可W作为急性发作期的高敏感性的一个指标 化atie Kingwell ,2011)。我们在小鼠接触性超敏反应（contact hypersensitivity,C服） 模型中也发现了随着局部耳朵炎症的发展，CXCL13呈现逐渐升高的趋势，并且运种模型发 病快，炎症反应局限，利于观察结果。于是我们利用运一特点，构建了趋化因子CXCL13相对 应的受体CXCR5的质粒，利用慢病毒转染的方法，使MSC表达受体CXCR5，并在疾病高峰期输 注过表达CXCR5的MSC，通过观察，我们发现过表达CXCR5的MSC治疗效果显著，在体内时能够 定向迁移至病损部位，大大提高MSC在体内发挥免疫调节能力的效率。
【发明内容】
[0008] 本发明通过构建表达CXCR5的质粒，利用慢病毒转染的方法，使MSC过表达受体 CXCR5,使MSC由静脉输注入体内时能够定向迁移至病损部位，而不是无序地分散在体内各 个部位，大大提高MSC在体内发挥免疫调节能力的效率。
[0009] 本发明所采用的技术方案如下：
[0010] 提供一种高表达巧CR5的间充质干细胞。
[0011] -种所述间充质干细胞在制备治疗下列疾病之一的药物中的用途：自身免疫病、 移植排斥、骨/软骨疾病、屯、血管疾病、神经系统疾病等。
[0012] -种包含所述间充质干细胞的药物。
[0013] -种制备所述间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0014] 1)收集健康个体外周血中单个核细胞并培养W获得获得外周血单个核细胞；
[001引2)提取外周血单个核细胞RNA;
[0016] 3)逆转录；
[0017] 4)PCR反应和回收CXCR5cDNA片段；
[0018] 5)克隆与转化；
[0019] 6)构建质粒；
[0020] 7)病毒包装；
[0021] 8)病毒转染间充质干细胞。
[0022] 进一步，步骤4)中引物为：
[0023] F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG，
[0024] R：CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCAo
[0025] 进一步，步骤6)中引物为
[0026] F-attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGC TAACGCTGG
[00打]R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTG AGAGAGGTGGCA。 [00%] 进一步，步骤6)中质粒结构为：
[00 巧]pF i na1/PGK-pur0-EF1α-CXCR5-1RES-EGFP。
[0030] 进一步，步骤7)中病毒为慢病毒。
[0031] 一种CXCR5引物序列：
[0032] F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG，
[00；33 ] R: CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA;
[0034] 用于制备所述的间充质干细胞。
[0035] 一种PCR引物序列：
[00；36] F-attBl :GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGC TAACGCTGG
[00；37] R-attB2 :GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTG AGAGAGGTGGCA
[0038] 用于制备所述的间充质干细胞。
[0039] 本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著地进步，具体地说，在不影响 MSC本身表型、分化能力及免疫调节能力的基础上，过表达CXCR5，可W使MSC?Ks在体内定向 迁移至炎症部位。与普通MSC不同的是，MSC^Ks能够快速有效地迁移至病损部位发挥免疫调 节的能力，而不是无目的地随机分布在体内各个部位。
[0040] 治疗自身免疫性疾病的优化治疗方法，将CXCR5基因修饰MSC治疗疾病将更有祀向 性和有效性，显著提高MSC的治疗效果。
【附图说明】
[0041 ]图 1 :MSC?R5 和 MSCEGfp 表达 CXCR5图
[0042] 图2:致敏后右侦陌朵(致敏)巧化13的mRNA随时间变化图
[0043] 图3:致敏后右侧耳朵(致敏)水肿程度随时间变化图
[0044] 图4: C服小鼠造模与治疗模式图
[0045] 图5:治疗后小鼠耳朵水肿程度折线图
[0046] 图6:切片染色显示结果
[0047] 图7:ΜΚ)活性柱图 [004引图8:化ISA结果
【具体实施方式】
[0049]为了使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明 进行详细描述。
[(K)加]实施例1
[0051 ] 1、MSC培养与表型鉴定：
[0化2] 取健康志愿者骨髓20ml，与1XPBS按1:1稀释，采用Ficoll-Paque淋己分离液用密 度梯度离屯、法从骨髓中分离出单个核细胞（200化pm，30min)，收集到的单个核细胞按1 X lOVcm2密度接种到75cm2培养瓶进行培养。用kDMBl培养基在37°C、5%C02条件下培养3天 后，去除悬浮细胞，换液继续培养。待细胞长至80 %密度后，吸去培养基，用PBS洗涂2次，用 0.125%膜酶消化l-2min，传代比例为1: 3dMSC由健康供者捐献的骨髓分离得到，临床用MSC 的分离、扩增、冻存、复苏等均在符合GMP(good manu化cturing practice)标准的条件下进 行。在倒置显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，拍片记录。取体外培 养的MSCs消化成单细胞悬液，用含0.1 %BSA+0.05%化化的PBS(pH 7.4)洗涂一遍，弃去上 清，调整细胞密度为lOVml于流式管，采用流式抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、 CD105、CD166标记MSCs，充分震荡混匀，4°C，避光解育30min，然后用含0.1%BSA+0.05% 船化的?85(抑7.4)洗涂两遍，^去除多余抗体;弃上清，用20〇1111%?。4重悬细胞，流式检 测MSCs细胞表型（CD29+，CD34-，CD44+，CD45-，CD73+，CD90+，CD 105+，CD 166+)，证明体外培养对 MSCs细胞表型无影响。
[0化3]将P2代细胞传至六孔板，长至60 %左右待用。
[0054] 2、外周血单个核细胞的获取：
[0055] 取健康志愿者新鲜外周血20ml，用1XPBS按1:1稀释，采用Ficoll-Paque淋己分离 液通过密度梯度离屯、法分离，收集全部白膜层单个核细胞，用无菌PBS按1:4稀释。200化pm， 离屯、lOmin，弃上清。再加足量PBS洗涂两次。用RPMI-1640完全培养基悬浮细胞，即获得人外 周血单个核细胞(PBMC)。
[0化6] 3、Trizol法提取外周血单个核细胞RNA:
[0057]将获得的人外周血单个核细胞(PBMC)加入1ml化izol溶液，吹打混匀，使细胞充 分裂解，静置5min;加入20化1氯仿，剧烈振荡混匀20s，使水相和有机相充分接触，室溫静置 15min ;4°C下，12000g离屯、15min，可见分为Ξ层，RNA在上层水相，小屯、移至另一个新的 RNase free EP管;加入0.5ml异丙醇，轻柔地充分混匀，于室溫静置lOmin，沉淀RNA; 4°C下， 12000g离屯、lOmin，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗管壁两次，超净台风干;加入5〇41 DEPC水溶解沉淀，Nano化op超微量分光光度计测量浓度。
[0化引 4、逆转录：
[0059] 去除基因组DNA:RNA(lyg)+DNase I(lyl)+Buffer 面ase I with MgCl2(lyl) + DEPC 水，10μ1 体系，37°C 解育 30min;加入邸 了4(化1)，65°(：解育1〇111111;加入011旨〇((11')(化1)， 65°C解育lOmin;最终，加入5 X Reaction Buffθ；Γ(5μ1)，RNase-R;Lbonuclease Inhibitor!； 1 μ1)，10πιΜ dNTP Mix(2yl)，M-MLV RT(lyl)，R化se Free Water共25μ1 体系，42°C解育 60min，收取cDNA产物。
[0060] 5、PCR反应和回收CXCRScDNA片段：
[0061 ] PCR反应：2XStar mix(含Taq DNA Polymerase、dNTPs、Mgh、反应缓冲液和稳定剂 等）10μ1，DEPC水7μ1，上游引物1μ1，下游引物化1，cDNAlyl，总体系20ul; CXCR5片段大小 1119bp。胶回收:锋利手术刀切割目的片段条带，使用琼脂糖凝胶DM回收试剂盒切胶回收 PCR目的产物CXCR5片段。
[0062] CXCR5引物序列：
[0063] F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG，
[0064] R：CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA；
[00化]6、TA克隆与转化：
[0066] TA克隆：体系：PMD19-T Vector*l(化l)，CXCR5cDNA(4yl)，Solution Ι(5μ1)，16 °C，2h，获得ΤΑ克隆产物。
[0067] 转化:-80°C取出感受态细胞D册α，冰上溶解5min; 3化1感受态巧μΙΤΑ克隆产物，轻 弹，置于冰上30min;42°C热击45s~Imin，立即置于冰上2min;加 37°C解育的LB600yl，在37 °C，150化pm的摇床上解育化；离屯、3500巧m，4~5min，倒上清，重悬，将10化1转化物涂在预 热的含有50μg/ml Amp的LB平板上，37°C解育过夜;挑出3~5个菌落进行PCR检测和测序。 [006引 7、6曰16*曰户法构建003?5-11?65斗6。?基因的质粒
[0069] ① PCR 扩增 attB-PCR 产物
[0070] 10XLA PCR Buffer(Mg2+plus)：3yl; 2???Μ dNTP Mix 3μΙ,
[0071] ΙΟμΜ上游引物 1.5μ1； ΙΟμΜ下游引物 1.5μ1; TaKaRa LA Taq 1 μ1:;
[0072] Template plasmid 1 Op呂-1 μ呂； 补加水至总体狼30以心；
[0073] 所用引物序列：
[0074] F-attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGCTAA CGCTGG [00巧]R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTGAG AGAGGTGGCA
[0076] ②PCR产物回收
[0077] 使用琼脂糖凝胶DM回收试剂盒切胶回收PCR产物 [007引③BP重组反应
[0079] 室溫混合W下成分：
[0080] CXCR5的attB-PCR产物 7.5-75ng;
[0081 ] PD0NR221 质粒 75ng;
[0082] 补加洗脱缓冲液邸至总体积4.化1;
[0083] 冰上溶解BP Clonase II enzyme mix 2分钟，短暂縱满2次；
[0084] 加入W上反应样品中加入化L BP Clonase II enz;yme mix,短暂縱满混匀2次，短 暂离屯、；
[0085] 25Γ解育1小时；
[0086] 加入0.5化蛋白酶K中止反应，37 °C解育10分钟；
[0087] -20°C保存或取化L进行转化。
[008引④BP反应产物的转化
[0089] 过程同上。
[0090] 筛选出重组子进行PCR检测和测序。
[0091] ⑤LR重组反应
[0092] 小提质粒
[0093] 测质粒浓度
[0094] 室溫混合W下质粒： pUp EF-la 5 fmoles pDOWN CXC民5 5掛的1巧
[0095] pTail IRES-EGFP 5 fmoles pDes pLV.Des3d.P/puiO 10 fmoles
[0096] 补加 1 XtE buffer(pH 8.0)至4.^iL，混匀。
[0097] 冰上溶解LR Clonase? II Plus Enzyme Mix 2分钟，短暂縱满2次；
[0098] 加入W上反应样品中加入化L LR Clonase? II Plus Enzyme Mix,短暂縱满混匀 2次，短暂离屯、；
[0099] 室溫解育16小时；
[0100] 加入化L蛋白酶K中止反应，37°C解育10分钟；
[0101] ⑥LR反应产物的转化
[0102] 转化步骤同上；
[0103] 构建成功的慢病毒过表达质粒结构如下：
[0104] pFinal/PGK-pur〇-EFla-CXCR5-IRES-EGFP
[0105] 对照组质粒：
[0106] pFinal/PGK-puro-EFla-EGFP
[0107] 8、慢病毒包装
[0108] 将293T细胞接种在10cm皿中，待其90%满的时候换新鲜不含双抗的293新鲜培养 液，放入培养箱中；
[0109] 2小时后将构建成功的过表达CXCR5基因的载体质粒与慢病毒载体质粒混合加入 无血清的0PTI-MEM培养基中，静置5分钟后加入X-化eme HP，颠倒混匀后静置15分钟，加入 293T细胞；
[0110] 12-16小时左右换液，继续培养24小时-48小时左右，收集含有病毒的上清培养液；
[0111] 慢病毒超速离屯、浓缩，弃上清，溶于1 XPBS后，分装保存于-80°C。
[0112] 9、慢病毒转染MSC
[0113] 将P2代的MSC传至六孔板，长至60 %左右待用；
[0114] 感染前换新鲜培养液L-DMEM培养基，取出浓缩病毒加入上清并加基因转染增强剂 polybrene(聚凝胺），12-16小时后更换新鲜培养基。
[0115] 10、检测巧CR5mRNA和蛋白的表达情况：
[0116] 72小时后收集细胞，通过流式细胞仪分选纯化得到转基因细胞系并扩增；
[0117] 实时巧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，RT-PCR)检测感染后的MSC表达 CXCR5mRNA 的含量：
[0118] ①提取RNA并逆转录:步骤参考本部分3、4; 感反应体系：cDNA 1μ1;
[0119] SYB民 mix ]0μΙ; ΙΟμΜ上游引物 1μ1; ΙΟμΜ下游引物 1μ1,
[0120] d 地 2〇 7μ1;
[0121] 总体系 20μ1;
[0122] 反应条件:95°C10min;3 步法，40 个循环:95°(：153,6〇1：3〇3,72°(：153;融解曲线:55 °(：-95°(：，每分钟读1次。
[0123] 使用引物
[0124] GATOH:
[01 巧]F:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC [01 %] R:GAAGATGGTGATGGGATTTC
[0127] CXCR5:
[0128] F:CCTTGAAGGAGGCCATGAG [01 巧]R:TAACGCTGGAAATGGACCTC
[0130] Western Blot检测感染后的MSC表达巧CR5的蛋白水平：
[OU1] ①提取蛋白：取培养中的过表达CXCR5的MSC(MSC?5)和对照组msC(MSCEgfp)，置于 冰上，去除培养液，用预冷的PBS洗两遍后，加入含5 %DTT的1 X SDS上样缓冲液（62.5mM 化13-肥1(9册.8)，2%(*八）505，10%邑17。6'〇1，50111101'1'，0.1%(*八）漠酪兰），迅速用11111 的移液枪来回吹打(约10次），充分裂解细胞。吹打后吸取液体放入1.5mL的化pendorf离屯、 管内，4 °C超声破碎3次，每次1秒；100°C煮沸5分钟，置4 °C冷却并于4 °C W 15000g离屯、5分钟， 准备电泳或-80°C保存备用。
[0132] ②凝胶电泳分离样品：变性聚丙締酷胺凝胶（denatured polyacrylamide gel， SDS-PAGE):加分离胶4. ImL，用去离子水封层，待出现明显界面后，倾掉水封层，加入已经配 制好的浓缩胶至短玻璃块的顶端。插梳，当胶面出现不规则形状时，表明胶已经聚合好，可 W拔梳、上样。
[0133] 按顺序，每泳道加入100°C煮沸5分钟的样本15化，于SDS电泳缓冲液中W恒压120V 电泳约45分钟。
[0134] ③转膜:在电泳的同时，把转膜所需要的材料，如海绵、滤纸、PVDF膜等浸泡在转膜 缓冲液(25mM Tris base，0.2M glycine，20%methanol P册.5)中。电泳结束后，取下凝胶， 去掉上面的浓缩胶部分。把胶放在转膜液中平衡15~30分钟，W去除胶表面附着的SDS。然 后开始装转膜夹层盒，从负极到正极按照海绵、一层滤纸、凝胶、PVD刊莫、一层滤纸和海绵的 顺序装置夹层盒，固定之后放于转移槽内，PVDF膜面朝着正极方向。将夹层盒和冰盒放置于 转移槽内，注入600mL转移缓冲液，恒流200mA2小时。
[0135] ④抗原抗体反应：
[0136] 转膜结束后，取下PVDF膜，在25血的TBS(50mM Tris-肥1 pH7.4，150mM化C1)中洗 10分钟，然后转至20mL封闭液[含5%脱脂奶的lXTBST(0.05%Tween-20inTBS)]中，室溫 下振荡封闭1小时，加入相应的用含5%(w/v)脱脂奶稀释的一抗稀释液。4°C溫和振荡过夜。 次日用1 XTBST洗膜3次，每次5分钟，然后加入用封闭液稀释的由辣根过氧化酶 化orseradish peroxidase，HRP)标记的二抗（1: 2000) 15mL，室溫振荡 1小时。之后用 1 X TBST洗膜3次，每次10分钟，于暗房内显影、定影:取E化试剂盒A、B液配成工作液均匀涂于 PVDF膜表面，解育1分钟后，尽量去除膜表面的反应残液，在X-光感光盒内用塑料保鲜膜固 定膜，放入X-光胶片进行适度曝光，取出X-光胶片于显影液中反应1分钟，把显影好的胶片 在清水中漂洗几次，再于定影液中反应1分钟，然后清水冲洗，惊片。
[0137] 结果可见附图1，MSC?K嗦达蛋白CXCR5，MSCEGfp不表达CXCR5，二者都表达绿色巧 光蛋白EGFP。
[013引实施例2
[0139] DNFB诱导的小鼠接触性超敏反应
[0140] DNFB(2,4-dini1:;r〇-1-f luo;robenzene，2,4-二硝基-1-氣苯)诱导的小鼠接触性超 敏反应模型造模，具体如下：
[0141] 1.6-8周雄性 BALB/c小鼠，16-18g，SPF 环境饲养；
[0142] 2.试剂配制：
[0143] ① DNFB预致敏溶液：
[0144] 配制混合液(丙酬:橄揽油4:1)，剧烈震荡混匀；
[0145] 配制预致敏混合液：用混合液配制0.5 %的DWB混合液，即预致敏混合液。②DNFB 致敏溶液:用混合液配制0.2 %的DNFB混合液，即致敏混合液。
[0146] 3.预致敏:第1天，用电动剌刀在小鼠背部近头部皮肤处刮出1.5X1.5cm区域，将 2化10.5%的DNFB预致敏混合液涂抹在被刮皮肤处，处理后常规饲养。
[0147] 4.致敏:第5天，用0.2 %的DNFB混合液涂抹小鼠耳朵，耳朵两面各10μ1。
[014引 5.将动物分为4组，每组8只：
[0149] ①空白对照（Control)组；
[0150] ②模型（C服)组；
[0151] ③ MSCEGfp 治疗（CHS+MSCEGfp)组；
[0152] ④msc?R日治疗（C服+msc?R日）组。
[01对造模后第2天，C服+MSCEGFP组静脉注射MSCEgfp，1 X 106个cells/只；
[0154] C 服+MSC?R 日组静脉注射 MSC?R 日，1 X 106 个 cells/只。
[0155] 6.记录治疗后第1，2,3,4,5天小鼠耳朵厚度，用千分尺测量。
[0156] 结果显示：
[0157] 1、致敏后，小鼠右耳(致敏)在发生炎症后趋化因子CX化13的mRNA不断升高（附图 2 )，厚度逐渐增厚，水肿程度加深(附图3)
[0158] 2、见附图4，化厂4天，用20μ10.5 %的DNFB预致敏混合液涂抹在背部，Day 0天，小 鼠右侧耳朵致敏，致敏后第2天，即Day 2天，当CX化13分泌增多，小鼠尾静脉注射MSC进行治 疗：
[0159] C 服+MSCEGFP 组静脉注射 MSCEGfp，1 X 1〇6 个 cells/只；
[0160] C 服+MSC?R 日组静脉注射 MSC?R 日，1 X 106 个 cells/只；
[0161] Control 组注射 PBS。
[0162] 3、记录治疗后第1，2,3,4,5天小鼠耳朵厚度，用千分尺测量耳朵外缘厚度，每天由 同一操作者同一时间测量Ξ次取均值，结果显示在附图5中，C服+MSC?Ks组小鼠耳朵厚度下 降最快，治疗效果最好，邸S+MSCEgfp组治疗效果在CHS组和CHS+MSC?K5组之间。
[0163] 4、切片染色观察小鼠耳朵MSC的数量：
[0164] 冰冻切片:将小鼠断颈处死，取各实验组小鼠耳朵，取10倍耳朵体积的多聚甲醒固 定化，转移至30 %薦糖脱水，4 °C过夜，0CT固定，冰冻切片机-20°C切片，7皿;免疫巧光染色： 烘片，60°C，30分钟，撕去0CT，0.01M的PBS洗脱5分钟X 3次，用免疫组化笔划线圈起有组织 部分，滴加山羊血清，封闭30分钟，加一抗，4 °C解育过夜，室溫放置30分钟，0.01M的PBS洗脱 5分钟X 3次，加二抗，30分钟，0.01M的PBS洗脱5分钟X 3次，力阳API，10分钟，0.01M的PBS洗 脱5分钟X 3次，封片。
[0165] 从附图6可见治疗后MSC?5组耳朵厚度明显低于MSCEGfp组耳朵厚度，更重要的是 MSCGxgks组耳朵中MSC的数量明显多于MSCEgfp组，证明MSC?Ks能够祀向地迁移至炎症部位。
[0166] 5、局部炎症细胞的浸润-髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MP0)检测，髓过氧化物 酶又称过氧化物酶，是血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一。 髓过氧化物酶是中性粒细胞所特有，即使在有强吞隧作用的巨隧细胞中也极少或完全没有 运种酶。在细胞化学上，一般将运种髓过氧化物酶作为中性粒细胞得到的标志，每个细胞所 含的酶的量是一定的，约占细胞干重的5%，该酶具有使过氧化氨还原的能力，利用运一特 点可W分析酶的活力，并定量测定中性粒细胞的数目。
[0167] MP0检测:准备待测样品-各组小鼠耳朵，称重，W试剂盒中相应试剂为匀浆介质， 按重量体积比为1:19加匀浆介质制备成5%的组织匀浆，然后按照试剂盒步骤检测MP0活 性，结果如附图7，C服+MSC?K5组MP0活性明显低于C服+MSCEGFP组和C服组。
[016引结果显示MSC?KS组中性粒细胞的浸润明显低于MSCEGfp组，证明MSCGXgks能够祀向地 迁移至炎症部位，发挥免疫功能，减轻炎性浸润。
[0169] 6、局部炎症因子的分泌
[0170] ELISA检测：96孔化ISA板，用1 Xwashing buffer洗涂2次，加标准品、待测样品， lOOul/孔，室溫避光解育化，弃液体，用1 Xwashing buffer洗涂5次，加检测抗体lOOul/孔， 室溫避光解育化，弃液体，用1 Xwashing buffer洗涂5次，去除多余抗体，加酶结合物工作 液lOOul/孔，室溫避光解育30min，弃液体，用IX washing buffer洗涂5次，加显示底物 50ul/孔，避光解育20min，加终止液50ul/孔，混匀后酶标仪检测450nm 0D值。
[0171] 见附图8，结果显示，显示CHS+MSC?K5组局部的炎性因子TN化和IFN 丫的浸润明显 低于CHS+MSCEgfp组和CHS组，证明MSC?K5能够祀向地迁移至炎症部位，发挥免疫功能，减轻 炎性反应。
[0172] 上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说 明，它们并非用W限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式 或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种高表达CXCR5的间充质干细胞。2. 如权利要求1所述间充质干细胞在制备治疗下列疾病之一的药物中的用途：自身免 疫病、移植排斥、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、糖尿病。3. -种包含如权利要求1所述间充质干细胞的药物。4. 一种制备如权利要求1所述间充质干细胞的方法，包括如下步骤： 1) 收集健康个体外周血中单个核细胞并培养以获得外周血单个核细胞； 2) 提取外周血单个核细胞RNA; 3) 逆转录； 4. PCR反应和回收CXCR5cDNA片段； 5) 克隆与转化； 6) 构建质粒； 7) 病毒包装； 8) 病毒转染间充质干细胞。5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中引物为： F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG， R:CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA 〇6. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤6)中引物为： F-attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGCTAACGCTGG R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA 〇7. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤6)中质粒结构为： pFinal/PGK-pur〇-EFla-CXCR5-IRES-EGFP〇8. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤7)中病毒为慢病毒。9. 一种用于制备如权利要求1所述的间充质干细胞的CXCR5引物序列： F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG， R:CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA 〇10. -种用于制备如权利要求1所述的间充质干细胞的PCR引物序列： F-attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGCTAACGCTGG； R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA 〇
【文档编号】A61P1/04GK106011074SQ201610420076
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】项鹏, 张小然, 陈小勇
【申请人】中山大学